专利名称：一种大豆抗原蛋白过敏细胞模型及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种大豆抗原蛋白过敏细胞模型及其应用。
背景技术：
大豆作为人和动物优质的植物蛋白和油脂来源，具有极高的营养价值。其所含 蛋白质约占大豆籽粒的40%。但是，大豆中含有胰蛋白酶抑制因子、凝集素、异黄酮、抗 原蛋白等多种抗营养因子。其中大豆抗原蛋白是大豆中能引起人和畜禽过敏反应的一类 蛋白质，主要包括大豆疏水蛋白(免疫学命名为Gly ml)、大豆壳蛋白(Gly m2)、大豆 抑制蛋白(Gly m3)、大豆胰蛋白酶抑制因子、大豆球蛋白(glycinin)、β-伴大豆球蛋白 (β-conglycinin)等。目前研究证实，大豆球蛋白和β _伴大豆球蛋白是含量最丰富，免疫 原性较强的大豆抗原蛋白，两者共占大豆籽实总蛋白的65-80 %。研究表明，在大豆抗原蛋白分子上有IgE抗原决定簇，被人和动物食入后，可引起 致敏人群或动物体内IgE抗体升高，从而导致过敏反应的发生。此外，值得重视的是，某些 种类的大豆抗原蛋白如大豆球蛋白和β -伴大豆球蛋白具有热稳定特性，普通的热处理对 其破坏作用较小。例如，烘烤大豆粉中具有抗原活性的大豆抗原蛋白残留量仍高达18%，这 个量足以引起婴儿的过敏反应。由于抗原活性的存在，大豆抗原蛋白对仔猪、犊牛及其它幼龄畜禽的生长和健康 造成了一定的危害。因此，将大豆进行适当的加工处理以减少或消除大豆抗原蛋白的抗原 活性成了当前科学界的一个重要研究目标。目前已证实，豆粕、膨化大豆、发酵豆粕、大豆浓 缩蛋白和大豆分离蛋白等大豆制品的抗原活性低于生大豆。但是，在大豆加工参数和大豆 抗原蛋白抗原活性的致敏临界值方面还没有一个统一的认识，其原因主要是大豆抗原蛋白 种类繁多，抗原活性的定量检测技术非常薄弱。已有的定量检测方法主要以抗血清测定、 单克隆抗体ELISA技术、高效液相色谱分析、动物过敏性模型评价为主。这些方法从免疫 学角度来看仍存在一定的缺陷，抗血清测定检测的灵敏度较低，而且重复性差；单克隆抗体 ELISA技术需要针对每种大豆抗原蛋白分别制备单克隆抗体，然后制备试剂盒，工程复杂而 工作量巨大；高效液相色谱分析则无法体现免疫反应性，并且由于前处理过程繁琐和需要 昂贵的专门仪器而难以广泛应用于大豆制品的现场检测；同时，以上三种方法作为体外检 测方法，检测的结果仅代表某种大豆抗原蛋白的含量，并不能直接显示其抗原性的强弱。过 敏性动物模型作为唯一的体内过敏性评价方法，虽然可以直接显示过敏性强弱，但难以定 量，同时完成评价需要大量的动物，工作量大，个体差异明显，而且不符合动物保护和动物 福利原则。RBL细胞是1973年由英国学者Eccleston等从嗜碱性白血病大鼠中分离得到的； RBL-2H3细胞系是由美国Barsumian研究小组(1981)将RBL反复克隆获得的亚系。由于 RBL-2H3细胞系具有永生化特性，培养方法简单，体外脱颗粒方法容易重复，所以是建立脱 颗粒模型的最佳选择。以前认为RBL细胞系是一种嗜碱性细胞，但近些年在对其糖蛋白量、 蛋白酶标志和超微结构等的研究后发现，它是一种粘膜型的肥大细胞，现已广泛用于研究肥大细胞体外脱颗粒的研究和运用。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备大豆抗原蛋白过敏细胞模型的方法。本发明提供的制备大豆抗原蛋白过敏细胞模型的方法，包括如下步骤将肥大细胞与大豆抗原蛋白特异性IgE抗体共孵育，孵育后的细胞，即为大豆抗 原蛋白过敏细胞模型。所述大豆抗原蛋白特异性IgE抗体通过如下方法制备将大豆抗原蛋白免疫动 物，得到抗血清，即得到大豆抗原蛋白特异性IgE抗体；所述大豆抗原蛋白为大豆总抗原蛋白、大豆胰蛋白酶抑制因子、β-伴大豆球蛋白 和/或大豆球蛋白。所述大豆抗原蛋白过敏细胞模型为如下1)-4)中任一所述过敏细胞模型1)为通过如下方法制备将肥大细胞和大豆胰蛋白酶抑制因子抗血清共孵育，得 到孵育后的细胞，即为大豆胰蛋白酶抑制因子过敏细胞模型；2)为通过如下方法制备将肥大细胞和大豆总抗原蛋白抗血清共孵育，得到孵育 后的细胞，即为大豆总抗原蛋白过敏细胞模型；3)为通过如下方法制备将肥大细胞和β-伴大豆球蛋白抗血清共孵育，得到孵 育后的细胞，即为β-伴大豆球蛋白过敏细胞模型；4)为通过如下方法制备将肥大细胞和大豆球蛋白抗血清共孵育，得到孵育后的 细胞，即为大豆球蛋白过敏细胞模型。所述大豆胰蛋白酶抑制因子抗血清通过如下方法制备将大豆胰蛋白酶抑制因子 免疫动物，分离血清，即得到大豆胰蛋白酶抑制因子抗血清；所述大豆总抗原蛋白抗血清通过如下方法制备将大豆总抗原蛋白免疫动物，分 离血清，即得到大豆总抗原蛋白抗血清；所述β -伴大豆球蛋白抗血清通过如下方法制备将β -伴大豆球蛋白免疫动物， 分离血清，即得到β-伴大豆球蛋白抗血清；所述大豆球蛋白抗血清通过如下方法制备将大豆球蛋白免疫动物，分离血清，即 得到大豆球蛋白抗血清。所述肥大细胞为RBL-2H3细胞；所述动物为大鼠，所述大鼠的品种名为Brown Norway。所述共孵育的温度为37 °C，所述共孵育的时间为6小时-12小时，所述共孵育的时 间具体为6小时、10小时或12小时。所述大豆胰蛋白酶抑制因子过敏细胞模型中，所述大豆胰蛋白酶抑制因子抗血清 与所述肥大细胞的配比为IOul (0.5X 105-2X 105)个细胞，所述大豆胰蛋白酶抑制因子 抗血清与所述肥大细胞的配比具体为IOul 0.5X105个细胞、IOul IXlO5个细胞或 IOul 2 X IO5 个细胞；所述β-伴大豆球蛋白过敏细胞模型中，所述β-伴大豆球蛋白抗血清与所述肥 大细胞的配比为IOul (0.5Χ105-2Χ105)个细胞，所述β _伴大豆球蛋白抗血清与所述 肥大细胞的配比具体为IOul 0. 5Χ IO5个细胞、IOul 1 X IO5个细胞或IOul 2X IO5
5个细胞；所述大豆总抗原蛋白过敏细胞模型中，所述大豆总抗原蛋白抗血清与所述肥大细 胞的配比为IOul (0.5X 105-2X 105)个细胞，所述大豆总抗原蛋白抗血清与所述肥大细 胞的配比具体为IOul 0. 5X105个细胞、IOul 1 X IO5个细胞或IOul 2X105个细胞；所述大豆球蛋白过敏细胞模型中，所述大豆球蛋白抗血清与所述肥大细胞的配比 为IOul (0.5X 105-2X 105)个细胞，所述大豆球蛋白抗血清与所述肥大细胞的配比具体 为 IOul 0. 5X IO5 个细胞、IOul 1 X IO5 个细胞或 IOul 2X IO5 个细胞；所述大豆胰蛋白酶抑制因子过敏细胞模型的共孵育体系由IX IO5个RBL-2H3细 胞、500 μ L MEM培养基、IOul大豆胰蛋白酶抑制因子抗血清组成；所述β-伴大豆球蛋白过敏细胞模型的共孵育体系由1父105个1 1^2!13细胞、 500 μ L MEM培养基、IOul β -伴大豆球蛋白抗血清组成；所述大豆总抗原蛋白过敏细胞模型的共孵育体系由1父105个1 1^2!13细胞、 500 μ L MEM培养基、IOul大豆总抗原蛋白抗血清组成；所述大豆球蛋白过敏细胞模型的共孵育体系由1父105个1 1^2!13细胞、50(^1^ MEM培养基、IOul大豆球蛋白抗血清组成；所述孵育后的细胞为共孵育结束后48小时内的细胞。所述β-伴大豆球蛋白抗血清中IgE抗体的效价为不低于1 2Χ104，具体为不 低于1 4Χ104，尤其优选为1 4Χ IO4;用于检测所述β-伴大豆球蛋白抗血清中的特异 IgE抗体效价的抗原为β-伴大豆球蛋白，所述β-伴大豆球蛋白的量为2yg;所述大豆胰蛋白酶抑制因子抗血清中IgE抗体的效价为不低于1 2X104，具体 为不低于1 4X104，尤其优选为1 IX IO5;用于检测所述大豆胰蛋白酶抑制因子抗血清 中的特异IgE抗体效价的抗原为大豆胰蛋白酶抑制因子，所述大豆胰蛋白酶抑制因子的量所述大豆球蛋白抗血清中IgE抗体的效价为不低于1 2X104，具体为不低于 1 4X104，尤其优选为1 4X IO4;用于检测所述大豆球蛋白抗血清中的特异IgE抗体效 价的抗原为大豆球蛋白，所述大豆球蛋白的量为2μ g ；所述大豆总抗原蛋白抗血清中IgE抗体的效价为不低于1 2X104，具体为不低 于1 4X104，尤其优选为1 IXlO5;用于检测所述大豆总抗原蛋白抗血清中的特异IgE 抗体效价的抗原为β -伴大豆球蛋白，所述大豆总抗原蛋白的量为2 μ g。由所述方法制备的细胞模型也是本发明保护的范围。所述大豆总抗原蛋白是指是大豆中能引起人和畜禽过敏反应的一类蛋白质，包 括大豆胰蛋白酶抑制因子、大豆球蛋白、β -伴大豆球蛋白。所述大豆总抗原蛋白通过如下方法制备，也可以商购将大豆依次进行脱皮、磨浆、过滤、滤液脱脂、溶解，即得到总抗原蛋白；所述滤液脱脂为向所述过滤得到的滤液加入乙醚混勻，旋转蒸发去除乙醚，得到 脱脂大豆粉； 所述溶解为将所述脱脂大豆粉和含有β -巯基乙醇的Tris-HCl缓冲液混合，得到 总抗原蛋白。 所述脱脂大豆粉和含有β -巯基乙醇的Tris-HCl缓冲液的配比为Ig 20ml ；
所述含有β-巯基乙醇的Tris-HCl缓冲液由溶质和溶剂组成，所述溶质为Tris 碱和β -巯基乙醇，所述溶剂为水，所述Tris碱在所述缓冲液中的浓度为0. 03Μ,所述 β-巯基乙醇在所述缓冲液中的浓度为10mM。所述β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白分别通过如下方法制备，也均可以商购将上述得到的大豆总抗原蛋白在10，000rpm/min离心30min，收集上清液；HCl调 节pH至6. 4，10，000rpm/min (4°C )离心30min,分别收集上清液A和沉淀A ；上清液A用HCl调节pH至4. 8，15，000rpm/min (4°C )离心30min后收集沉淀； 0. 03M 的 Tris-HCl (pH 8. 0，IOmM β -巯基乙醇)溶解沉淀，调节 pH 至 6. 2，15，OOOrpm/ min(4°C)离心30min，取上清液；调节pH至7. 6，加入固体(NH4)2SO4,使(NH4) 2S04饱和度达 51%，41静置过夜，15，000印111/1^1^4°0离心30min后收集沉淀；溶解于pH 7. 6浓度为 0. Olmol/L的磷酸盐缓冲液，加入固体(NH4)2SO4,使(NH4) 2S04饱和度达90%，4°C静置过夜， 15，000rpm/min (4°C )离心30min,收集沉淀；将沉淀溶于pH 7. 6的浓度为0. Olmol/L磷酸 盐缓冲液中，即得到伴大豆球蛋白；沉淀A用磷酸盐缓冲液(向浓度为0. Olmol/L磷酸盐缓冲液中加入β-巯基乙醇， 所述β-巯基乙醇在磷酸盐缓冲液中的浓度为lOmmol/L，pH为8. 0)溶解，离心收集上清 液。加入固体(NH4)2SO4,使(NH4)2SO4 饱和度达 51%，4°C静置过夜。15, 000rpm/min(4°C ) 离心30min后收集沉淀，溶解于pH 7. 6的浓度为0. Olmol/L磷酸盐缓冲液。加入固体 (NH4)2SO4,使(NH4)2SO4 饱和度达 90%，4°C静置过夜。15, 000rpm/min(4°C )离心 30min，沉 淀溶于PH 7.6的浓度为O.Olmol/L磷酸盐缓冲液中，即得到获得大豆球蛋白。所述pH 7. 6的浓度为0. Olmol/L磷酸盐缓冲液的配方如下8. OOg NaCl、 0. 20gKCl、0. 20g KH2PO4U. 15g Na2HPO4 · 12H20，加蒸馏水至 lOOOmL，用 lmol/L 的 NaOH 调 PH 为 7. 6。所述的大豆抗原蛋白过敏细胞模型在制备检测大豆抗原蛋白抗原性的试剂盒中 的应用；所述的多克隆抗体在制备检测大豆抗原蛋白抗原性的试剂盒中的应用；以上应用 均是本发明保护的范围。本发明的实验证明，本发明提供的体外肥大细胞致敏模型，可以特异性检测大豆 抗原蛋白抗原活性，克服了传统的SDS-PAGE、多抗血清、单克隆抗体ELISA检测方法不能直 接检测抗原活性、灵敏度和准确性低、不同实验室之间不能参比的缺点，客服了传统的过敏 性动物评价实验难以定量、需要大量的动物、个体差异明显、不符合动物保护和动物福利原 则的缺点。其检测可以定量、准确性和灵敏度高，而成本很低，不同实验室可以参比和重复。 应用于种植业、饲料行业、食品行业高通量快速检测大豆、豆粕、豆制品、豆粕饲料中大豆抗 原蛋白抗原活性的定量检测。具体而言可应用于(1)应用于种植业、饲料行业、食品行业高通量快速检测大豆、豆粕、豆制品、豆粕 饲料中大豆抗原蛋白抗原活性的定量检测。(2)应用该抗体作为研究大豆抗原性的工具，进行大豆种质资源筛选、品种改造；(3)应用该抗原性评价方法取代动物实验，应用于大豆、豆粕、豆制品、豆粕饲料中 大豆抗原蛋白抗原活性的评价和研究；
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(4)运用该细胞模型和特异的氨基己糖苷酶酶活性分析检测方法，用于临床 诊断或辅助诊断对大豆食物过敏的患者/患病畜禽；(5)运用该细胞模型和酶活性测定方法筛选、评价和鉴定具有抗过敏活性的药物 /添加剂；(6)应用该细胞模型和酶活性测定方法，进行药理学研究，用于治疗大豆抗原蛋白 所致过敏性疾病。
图1为SDS-PAGE分析纯化的大豆抗原蛋白样品图2为不同激发时间RBL-2H3细胞β -氨基己糖苷酶的释放率测定
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、细胞模型的制备一、大豆抗原蛋白的提取和纯化大豆胰蛋白酶抑制因子购买自Sigma公司，目录号93620 ；大豆(拉丁名Glycine max,品种为黑农38，购自北京德宝群兴农业科技有限公 司。)脱皮后磨浆，过滤后的滤液用乙醚萃取脱脂，经旋转蒸发除去残留乙醚，制得脱脂大 豆粉；在25°C条件下，向脱脂大豆粉中加入0. 03M的Tris-HCl (pH 8. 0，IOmM β -巯基乙醇) 缓冲液(脱脂大豆粉与Tris-HCl的比例为Ig脱脂大豆粉20mlTriS-HCl)，溶解，得到大豆 总抗原蛋白溶液，即得到大豆总抗原蛋白。将上述得到的大豆总抗原蛋白溶液在10，000rpm/min离心30min，收集上清液； HCl调节pH至6. 4，10，000rpm/min (4°C )离心30min,分别收集上清液A和沉淀A。上清液A用HCl调节pH至4. 8，15，OOOrpm/min (4°C )离心30min后收集沉淀； 0. 03M 的 Tris-HCl (pH 8. 0，IOmM β -巯基乙醇)溶解沉淀，调节 pH 至 6. 2，15，OOOrpm/ min(4°C)离心30min，取上清液；调节pH至7. 6，加入固体(NH4)2SO4,使(NH4) 2S04饱和度达 51%，41静置过夜，15，000印111/1^1^4°0离心30min后收集沉淀；溶解于pH 7. 6浓度为 0. Olmol/L的磷酸盐缓冲液，加入固体(NH4)2SO4,使(NH4) 2S04饱和度达90%，4°C静置过夜， 15，OOOrpm/min (4°C )离心30min,收集沉淀；将沉淀溶于pH 7. 6的浓度为0. Olmol/L磷酸 盐缓冲液中，即得到伴大豆球蛋白粗提液。沉淀A用磷酸盐缓冲液(向浓度为0. Olmol/L磷酸盐缓冲液中加入β-巯基乙醇， 所述β-巯基乙醇在磷酸盐缓冲液中的浓度为lOmmol/L，pH为8. 0)溶解，离心收集上清 液。加入固体(NH4)2SO4,使(NH4)2SO4 饱和度达 51%，4°C静置过夜。15, OOOrpm/min(4°C ) 离心30min后收集沉淀，溶解于pH 7. 6的浓度为0. Olmol/L磷酸盐缓冲液。加入固体 (NH4)2SO4,使(NH4)2SO4 饱和度达 90%，4°C静置过夜。15, OOOrpm/min(4°C )离心 30min，沉 淀溶于PH 7. 6的浓度为0. Olmol/L磷酸盐缓冲液中；获得大豆球蛋白(glycinin)粗提液。以上β-伴大豆球蛋白粗提液和大豆球蛋白粗提液分别用琼脂糖凝胶 Sepharose6B柱纯化。琼脂糖凝胶kpharose 6B经真空脱气后装柱(100cmX2. 6cm)，充分平衡后上样进行凝胶过滤，用PH 7.6的浓度0. 01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)洗脱，核酸 蛋白检测仪^Onm检测，分别收集含有蛋白的洗脱液。将收集到的含有蛋白的洗脱液再经 过DEAE-52层析柱(30cmX3. 3cm)，用pH 7.6的浓度为0. 01mol/L磷酸盐缓冲液(配方 8. OOg NaCl.O. 20g KCl、0· 20g KH2PO4U. 15g Nei2HPO4 · 12H20，加蒸馏水至 lOOOmL，用 Imo 1/ L的NaOH调PH为7. 6)洗脱，收集蛋白洗脱液；将洗脱液于4°C对蒸馏水透析(透析袋的孔 径1000D)除盐，冷冻干燥，得到纯化的β-伴大豆球蛋白和纯化的大豆球蛋白。将上述得到的大豆总抗原蛋白溶液和纯化后的β -伴大豆球蛋白采用SDS-PAGE 电泳方法鉴定蛋白纯度、测定分子量，添加SDS的分离凝胶浓度为12%，浓缩胶浓度为5%。 以低分子量标准蛋白为标准进行电泳，电泳条件为恒压100V。电泳结束后用考马斯亮兰染 色液染色他以上，脱色观察。结果如图1所示，其中1为分子Marker，2为纯化后的β -伴大豆球蛋白，3为大豆 总抗原蛋白，从图中看出，得到了纯化的伴大豆球蛋白和大豆总抗原蛋白。采用同样的方法检测纯化的大豆球蛋白，结果为得到纯化的大豆球蛋白。二、多抗的制备试验选用3周龄断奶的雄性BN (Brown Norway)大鼠(购自北京维通利华公司)， 体重45-55g。大鼠饲喂在装有空调的房间内，温度维持在23°C，相对湿度为65%左右，昼夜 光照交替时间为12/12h。单笼饲养，自由采食和饮水。随机分为2个处理对照组和大豆抗 原蛋白过敏原活化组，每组6只大鼠。试验日粮采用不含大豆及豆制品的玉米-淀粉-酪 蛋白型半纯合日粮，配方见表1。表1无大豆抗原蛋白的半纯合日粮的组成和营养成分
权利要求
1.一种制备大豆抗原蛋白过敏细胞模型的方法，包括如下步骤将肥大细胞与大豆抗原蛋白特异性IgE抗体共孵育，孵育后的细胞，即为大豆抗原蛋 白过敏细胞模型。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于所述大豆抗原蛋白特异性IgE抗体通过如下方法制备将大豆抗原蛋白免疫动物，得 到抗血清，即得到大豆抗原蛋白特异性IgE抗体；所述大豆抗原蛋白为大豆总抗原蛋白、大豆胰蛋白酶抑制因子、伴大豆球蛋白和/ 或大豆球蛋白。
3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于所述大豆抗原蛋白过敏细胞模型为如下1)-4)中任一所述过敏细胞模型1)为通过如下方法制备将肥大细胞和大豆胰蛋白酶抑制因子抗血清共孵育，得到孵 育后的细胞，即为大豆胰蛋白酶抑制因子过敏细胞模型；2)为通过如下方法制备将肥大细胞和大豆总抗原蛋白抗血清共孵育，得到孵育后的 细胞，即为大豆总抗原蛋白过敏细胞模型；3)为通过如下方法制备将肥大细胞和伴大豆球蛋白抗血清共孵育，得到孵育后 的细胞，即为β-伴大豆球蛋白过敏细胞模型；4)为通过如下方法制备将肥大细胞和大豆球蛋白抗血清共孵育，得到孵育后的细 胞，即为大豆球蛋白过敏细胞模型。
4.根据权利要求1-3中任一所述方法，其特征在于所述大豆胰蛋白酶抑制因子抗血清通过如下方法制备将大豆胰蛋白酶抑制因子免疫 动物，分离血清，即得到大豆胰蛋白酶抑制因子抗血清；所述大豆总抗原蛋白抗血清通过如下方法制备将大豆总抗原蛋白免疫动物，分离血 清，即得到大豆总抗原蛋白抗血清；所述β -伴大豆球蛋白抗血清通过如下方法制备将β -伴大豆球蛋白免疫动物，分离 血清，即得到β-伴大豆球蛋白抗血清；所述大豆球蛋白抗血清通过如下方法制备将大豆球蛋白免疫动物，分离血清，即得到 大豆球蛋白抗血清。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述肥大细胞为RBL-2H3细胞；所述动物为大鼠。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述共孵育的温度为37 °C，所述共孵育的时间为6小时-12小时，所述共孵育的时间具 体为6小时、10小时或12小时。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述大豆胰蛋白酶抑制因子过敏细胞模型中，所述大豆胰蛋白酶抑制因子抗血清与 所述肥大细胞的配比为IOul (0.5X 105-2X 105)个细胞，所述大豆胰蛋白酶抑制因子 抗血清与所述肥大细胞的配比具体为IOul 0.5X105个细胞、IOul IXlO5个细胞或 IOul 2 X IO5 个细胞；所述β-伴大豆球蛋白过敏细胞模型中，所述β-伴大豆球蛋白抗血清与所述肥大细胞的配比为IOul (0.5X 105-2X 105)个细胞，所述β -伴大豆球蛋白抗血清与所述肥大 细胞的配比具体为IOul 0. 5Χ IO5个细胞、IOul 1 X IO5个细胞或IOul 2Χ105个细 胞；所述大豆总抗原蛋白过敏细胞模型中，所述大豆总抗原蛋白抗血清与所述肥大细胞的 配比为IOul (0.5Χ105-2X IO5)个细胞，所述大豆总抗原蛋白抗血清与所述肥大细胞的 配比具体为IOul 0. 5Χ IO5个细胞、IOul 1 X IO5个细胞或IOul 2Χ IO5个细胞；所述大豆球蛋白过敏细胞模型中，所述大豆球蛋白抗血清与所述肥大细胞的配比为 IOul (0.5Χ105-2Χ105)个细胞，所述大豆球蛋白抗血清与所述肥大细胞的配比具体为 IOul 0. 5Χ IO5 个细胞、IOul 1 X IO5 个细胞或 IOul 2Χ IO5 个细胞。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述大豆胰蛋白酶抑制因子过敏细胞模型的共孵育体系由1乂105个1 1^-2!13细胞、 500 μ L MEM培养基、IOul大豆胰蛋白酶抑制因子抗血清组成；所述β-伴大豆球蛋白过敏细胞模型的共孵育体系由1父105个1 1^2!13细胞、50(^1^ MEM培养基、IOul β -伴大豆球蛋白抗血清组成；所述大豆总抗原蛋白过敏细胞模型的共孵育体系由1 X IO5个RBL-2H3细胞、500 μ L MEM培养基、IOul大豆总抗原蛋白抗血清组成；所述大豆球蛋白过敏细胞模型的共孵育体系由1父105个1 1^2!13细胞、50(^1^ MEM培 养基、IOul大豆球蛋白抗血清组成；所述孵育后的细胞为共孵育结束后48小时内的细胞；所述β-伴大豆球蛋白抗血清中IgE抗体的效价为不低于1 2Χ104，具体为不低于 1 4Χ104，尤其优选为1 4Χ IO4;用于检测所述β-伴大豆球蛋白抗血清中的特异IgE 抗体效价的抗原为β-伴大豆球蛋白，所述β-伴大豆球蛋白的量为2yg;所述大豆胰蛋白酶抑制因子抗血清中IgE抗体的效价为不低于1 2X104，具体为不 低于1 4X104，尤其优选为1 IXlO5;用于检测所述大豆胰蛋白酶抑制因子抗血清中 的特异IgE抗体效价的抗原为大豆胰蛋白酶抑制因子，所述大豆胰蛋白酶抑制因子的量为 2ug；所述大豆球蛋白抗血清中IgE抗体的效价为不低于1 2X104，具体为不低于 1 4X104，尤其优选为1 4X IO4;用于检测所述大豆球蛋白抗血清中的特异IgE抗体效 价的抗原为大豆球蛋白，所述大豆球蛋白的量为2μ g ；所述大豆总抗原蛋白抗血清中IgE抗体的效价为不低于1 2X104，具体为不低于 1 4X104，尤其优选为1 IXlO5;用于检测所述大豆总抗原蛋白抗血清中的特异IgE抗 体效价的抗原为β -伴大豆球蛋白，所述大豆总抗原蛋白的量为2 μ g。
9.权利要求1-8中任一所述方法制备的细胞模型。
10.权利要求1-8中所述方法在制备检测大豆抗原蛋白抗原性的试剂盒中的应用； 或权利要求9所述的细胞模型在制备检测大豆抗原蛋白抗原性的试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种大豆抗原蛋白过敏细胞模型及其应用。本发明提供大豆抗原蛋白过敏细胞模型，通过如下步骤获得将肥大细胞与IgE抗体共孵育，孵育后的细胞，即为大豆抗原蛋白过敏细胞模型。本发明的实验证明，本发明的大豆抗原蛋白体外肥大细胞活化模型可以特异性检测大豆抗原蛋白抗原活性的，可满足饲料行业、食品行业相关企业单位高通量快速检测大豆、豆粕、豆制品中大豆抗原蛋白抗原活性的需要，以及应用于筛选和鉴定抗大豆抗原蛋白过敏的有效药物/添加剂的需要。
文档编号C12N5/071GK102120984SQ20101057727
公开日2011年7月13日 申请日期2010年12月7日 优先权日2010年12月7日
发明者李德发, 谯仕彦, 贺平丽, 马曦 申请人:中国农业大学