专利名称：一种氧化还原酶或其重组酶的应用及一种重组氧化还原酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种氧化还原酶或其重组酶作为羰基还原酶催化剂在不对称还原前手性羰基化合物以制备光学活性手性醇中的应用，以及一种重组氧化还原酶。
背景技术：
光学活性手性醇是医药和精细化学品合成的重要中间体。目前，光学活性手性醇的制备方法主要包括化学催化的羰基不对称还原法、生物催化的羰基不对称还原法和生物催化的消旋醇手性拆分法。其中，化学催化羰基的不对称还原，通常需要铑、钌等昂贵的金属催化剂。这些催化剂回收困难、污染环境，且反应能耗高。生物催化不对称还原法的优点在于，该方法理论上能将酮100%地转化为单一构型的手性醇，底物利用率高，产物易于分离，缺点是需要添加昂贵的辅酶。生物催化的手性拆分不需添加辅酶，但该方法的缺点在于目标构型的产物最高收率不会超过50 %。前手性羰基化合物的不对称还原是获取光学活性手性醇的有效途径之一。迄今为止，已有许多关于生物催化酮不对称还原制备光学活性醇的报道。例如，Qi如等 (Construction and co-expression of a polycistronic ρlasmidencoding carbonyl reductase and glucose dehydrogenase for production of ethyl (S)_4_chloro_3_ hydroxybutanoate. Bioresource Technology, 2010,101 :6761-6767)用来自树干毕赤酵母(Pichia stipitis)CBS 60 的羰基还原酶I3sCR催化4_氯乙酰乙酸乙酯(Ethyl 4-chloroacetoacetate, C0BE)不对称还原制备(S) ~4~ 氯 _3_ 羟基丁酸乙酯(Ethyl 4-chloro-3-hydroxybutanoate, (S)-CHBE)。其中(S)-CHBE 是用于治疗血胆固醇过多的他汀类药物——羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)抑制剂的重要中间体。该文献采用水 /辛酸乙酯两相反应体系和分批加入底物COBE和葡萄糖的策略，有机相中(S)-CHBE的浓度达1J6M，光学纯度高于99%，得率为90%。但该催化方法的缺点在于，需要添加葡萄糖和葡萄糖脱氢酶催化辅酶NADPH的再生，在这种情况下，反应过程中需要精确控制 pH 值，±曾力口了工艺复杂度。Inoue 等(Purification andCharacterization of a Novel Alcohol Dehydrogenase from Leifsonia sp. StrainS749 -.a Promising Biocatalyst for an Asymmetric Hydrogen TransferBioreduction. Applied and environmental microbiology. 2005,75 :3633-3641)用来自赖氏细菌(Leifsonia sp.) strain S749 的醇脱氢酶LsADH催化2，2，2-三氟苯乙酮生产(S)-2，2，2-三氟苯乙醇(一种潜在的手性液晶材料)，单水相反应体系中可催化的底物浓度达到100g/L，其中醇脱氢酶LsADH具有催化异丙醇氧化，同时使NAD+还原生成NADH的能力，反应过程不需要控制pH值。然而，目前已用于工业化生产的羰基还原酶类催化剂并不多，其难点在于具有高催化活性和高选择性等优异催化性能的羰基还原酶难以获得，而且催化反应中所涉及的辅酶价格昂贵，无疑增加了工艺生产的成本。因此，针对前手性羰基化合物，亟需筛选高效特异的，尤其是能实现自身辅酶循环的羰基还原酶，以满足工业需要。Genbank收录了一种氧化还原_&CR(Genbank登录号为NP 631416)，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，共包含263个氨基酸，其可来源于天蓝色链霉菌(Str印tomyces coelicolor)A3(2)NRRL B-16638，其编码基因(Genbank 登录号 NC 003888. 3, REGION 8176680. · 8177471)的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，共包含792bp碱基。至今，尚未见文献报道该氧化还原酶进行任何实际应用的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有的高催化活性和高选择性羰基还原酶尚不多见，且大多需要昂贵的辅酶，不能满足工业应用理想需要的缺陷，而提供一种氧化还原酶或其重组酶在羰基化合物不对称还原领域中的新应用，以及一种可高效特异催化羰基化合物，尤其是4-氯乙酰乙酸乙酯的不对称还原，且可实现自身辅酶循环的重组氧化还原酶。本发明涉及一种氧化还原酶或其重组酶作为羰基还原酶催化剂在不对称还原前手性羰基化合物以制备光学活性手性醇中的应用；所述的氧化还原酶或其重组酶的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示。本发明中，所述的氧化还原酶的Genbank登录号为NP_631416，下文简称氧化还原酶 &CR，其可来源于天蓝色链霉菌(Sti^ptomyces coelicolor)A3 (2)NRRL B-16638。本发明中，所述的重组酶可由下述方法制得培养包含碱基序列如序列表中SEQ ID No. 1所示的氧化还原酶基因的重组表达转化体，即可。其中，所述的培养的步骤的方法和条件没有特殊限制，可以根据宿主类型和所选培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要使重组表达转化体能够生长并产生本发明的重组氧化还原酶即可。对于培养基，本发明优选包括下述成分的培养基 酵母膏5 10g/L，蛋白胨10 20g/L和NaC110g/L。本发明一较佳实例为将包含碱基序列如序列表中SEQ ID No. 1所示的氧化还原酶基因的重组大肠杆菌接种于含卡那霉素的LB培养基(包括酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L和 NaCl 10g/L)中培养，之后再接种于LB，培养基(包括酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L和NaCl 10g/L)中培养，当培养液0D_达到7. 5 8.5(优选8)时，在终浓度为0. 1 ImM(优选 0. 5mM)的异丙基-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下，即可高效表达本发明的重组氧化还原酶。其中，所述的培养的温度较佳的为30 37°C，更佳的为37°C。所述的培养较佳的在振荡条件下进行。所述的再接种于LB’培养基的步骤较佳的按体积比5%的接种量接种。所述的诱导的时间较佳的为22 ^°C，更佳的为25°C。所述的诱导的时间较佳的为10 15h，更佳的为12h。按上述方法制得本发明的重组氧化还原酶后，可按本领域常规方法收集待用，一般可为下述方式中任一种(1)收集培养液中的细胞，洗涤，冷冻干燥，得冻干细胞。具体的操作优选将培养液离心(转速一般为8000 IOOOOrpm)去除上清液，收集细胞，生理盐水洗涤(优选两次)，冷冻干燥，得冻干细胞。( 将收集的培养液中的细胞进行细胞破壁处理，离心，取上清液，即得粗酶液。具体的操作优选将收集的培养液中的细胞重新悬浮于本领域常用的PH6. 0 7. 0的缓冲液(如磷酸盐缓冲液，优选pH6. 5、IOOmM的磷酸-磷酸钠缓冲液)中，进行细胞破壁。所述的细胞破壁的方式可采用常规方法，如超声处理，优选条件为功率400W，超声如，间歇6s，重复99轮。细胞破壁后的离心的速度较佳的为8000 1OOOOrpm0 (3)按方式( 制备粗酶液，将粗酶液进一步冷冻干燥得粗酶粉其中，所述的包含碱基序列如序列表中SEQ ID No. 1所示的氧化还原酶基因的重组表达转化体可按下述方法制得将包含碱基序列如序列表中SEQID No. 1所示的氧化还原酶基因的重组表达载体转化至宿主微生物中，即可。所述的宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足重组表达载体可稳定的自行复制，且所携带的本发明的氧化还原酶基因可被有效表达即可。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠埃希氏菌(E.coli) BL21(DE3)。所述的包含碱基序列如序列表中SEQ ID No. 1所示的氧化还原酶基因的重组表达载体可按下述方法制得将碱基序列如序列表中SEQ ID No. 1所示的氧化还原酶基因连接于载体上，即可。所述的载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选质粒pET18a。较佳的，可通过下述方法制得本发明的重组表达载体将碱基序列如序列表中SEQ ID No. 1所示的氧化还原酶基因和质粒pET-28a用限制性内切酶 NdeI和HindIII双酶切，然后用T4DNA连接酶连接，即可得本发明的重组表达质粒。所述的碱基序列如序列表中SEQ ID No. 1所示的氧化还原酶基因可通过引物，以天蓝色链霉菌(Sti^ptomyces coelicolor)A3 (2)NRRL B-16638 的基因组为模板，经聚合酶链式反应(PCR)进行基因扩增制得；所述的引物为上游引物为 GGAGATTCATATGAGCACCACCGGAACCACC,下游引物为 GTGAAGCTTTCAGACGGCGGTGTAGGCGC。本发明的应用较佳的按下述方法进行在NAD+和/或NADH、以及异丙醇的存在下， 在所述的氧化还原酶或其重组酶的作用下，将作为底物的前手性羰基化合物进行不对称还原反应，制得光学活性手性醇。上述应用中，所述的不对称还原反应的各条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择，具体选择以及优选条件如下介绍所述的前手性羰基化合物较佳的为芳基酮类化合物或酮酯类化合物，更佳的为 R1COR2, R3C0CH2C00CH2CH3 或 R4C0C00CH2CH3 ；其中，队为-C6H5 或-C6H4X, R2 为-CH3、-CH2CF3 或-CH2X, R3 为-CH3、-CH2CH3、-CH2X 或-CF3, R4 为-CH3、-C (CH3) 2、-C6H4X 或-(CH2) 2C6H5，X 为 Cl或Br，X在苯基上取代的位置可为邻位、间位或对位。所述的前手性羰基化合物的量根据具体底物选择，对于单一水相溶剂体系可为10 200g/L反应溶液，对于有机溶剂相/水相的两相转化体系可为10 600g/L水。按常规方法，所述的氧化还原酶或其重组酶可采用下述形式加入反应体系将粗酶液直接加入反应体系，或者将悬浮或溶解有冻干细胞或粗酶粉的PH5 9、优选6 7的缓冲水溶液加入反应体系。所述的缓冲水溶液种类可为本领域常用的各种缓冲液，优选磷酸盐缓冲液。所述的缓冲液的浓度可为50 100mM。本发明最优选pH6. 5、IOOmM的磷酸-磷酸钠缓冲液。所述的氧化还原酶或其重组酶的量为催化有效量以上，一般为80 400U/g 底物(酶活单位U的定义见实施例幻，优选200 400U/g底物。所述的异丙醇的量一般为前手性羰基化合物摩尔量的1 45倍，优选1. 6 1. 8 倍。所述的NAD+和/或NADH的量可为0. 3 1.0mmol/L。较佳的，在反应体系中还加入MgCl2,以提高本发明的氧化还原酶或其重组酶的酶活力。所述的MgCl2的量较佳的为 2mmol/L。上述mmol/L在单一水相溶剂体系中为mmol/L反应溶液，在有机溶剂相/水相的两相转化体系中为mmol/L水。
所述的不对称还原反应的温度一般为20 40°C，优选25 30°C。所述的不对称还原反应的时间以反应完全为准，一般为1 36小时。所述的不对称还原反应的溶剂体系可为通常的缓冲水溶液体系。所述的缓冲水溶液同前述。为了更好地解决底物抑制和产物抑制问题，本发明优选有机溶剂相/水相的两相转化体系。所述的有机溶剂相与水相的体积比可为0.5 1.5 1，优选1 1。其中， 所述的水相为前述缓冲水溶液。所述的有机溶剂优选邻苯二甲酸二丁酯、异辛烷、正庚烷、 辛酸乙酯、正己烷、正辛醇、甲苯或乙酸丁酯，更优选甲苯。同样为更好地解决底物抑制和产物抑制问题，较佳地采用底物和异丙醇分批加入的操作。具体的，底物和异丙醇分批加入的批次可为3 6次，优选4次。每批次底物的加入量可为底物总量的1/6 1/3，优选1/4。异丙醇首次加入量可为总量的2/5 3/5，优选 2/5。剩余批次的异丙醇加入量为总量的1/10 3/10，优选1/5。每批次底物和异丙醇加入的时间为前批次底物反应完全后为宜。 反应结束后，按常规方法提取分离后，即可获得光学活性手性醇c 以底物R1COIi2为例，反应路线如下所示。
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权利要求
1.一种氧化还原酶或其重组酶作为羰基还原酶催化剂在不对称还原前手性羰基化合物以制备光学活性手性醇中的应用；所述的氧化还原酶或其重组酶的氨基酸序列如序列表中 SEQ ID No. 2 所示。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的氧化还原酶来源于天蓝色链霉菌(Sti^ptomyces coelicolor)A3 (2)NRRL B-16638 ；所述的重组酶由下述方法制得培养包含碱基序列如序列表中SEQ IDNo. 1所示的氧化还原酶基因的重组表达转化体，即可；所述的培养所用的培养基较佳的为包括下述成分的培养基酵母膏5 10g/L，蛋白胨10 20g/L和NaCl 10g/L。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的重组酶由下述方法制得将包含碱基序列如序列表中SEQ ID No. 1所示的氧化还原酶基因的重组大肠杆菌接种于含卡那霉素的 LB培养基中培养，之后再接种于LB’培养基中培养，当培养液0D600达到7. 5 8. 5，优选 8时，在终浓度为0. 1 ImM，优选0. 5mM的异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷的诱导下，即可；所述的LB培养基包括酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L和NaCl 10g/L ；所述的LB’培养基包括酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L和NaCl 10g/L ；所述的培养的温度较佳的为30 37°C;所述的培养较佳的在振荡条件下进行；所述的再接种于LB’培养基的步骤较佳的按体积比5%的接种量接种；所述的诱导的时间较佳的为22 ；所述的诱导的时间较佳的为10 15h。
4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于所述的重组酶按下述方式中任一种收集(1)收集培养液中的细胞，洗涤，冷冻干燥，得冻干细胞；( 将收集的培养液中的细胞进行细胞破壁处理，离心，取上清液，即得粗酶液；C3)按方式( 制备粗酶液，将粗酶液进一步冷冻干燥得粗酶粉。
5.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的包含碱基序列如序列表中SEQID No. 1所示的氧化还原酶基因的重组表达转化体由下述方法制得通过引物，以天蓝色链霉菌(Sti^ptomyces coelicolor)A3 (2)NRRL B-16638的基因组为模板，经聚合酶链式反应进行基因扩增得碱基序列如序列表中SEQ ID No. 1所示的氧化还原酶基因，之后连接于载体上得包含碱基序列如序列表中SEQ ID No. 1所示的氧化还原酶基因的重组表达载体，之后转化至宿主微生物中，即可；所述的引物为上游引物为 GGAGATTCATATGAGCACCACCGGAACCACC，下游引物为 GTGAAGCTTTCAGACGGCGGTGTAGGCGC ；所述的载体较佳的为质粒pET18a ；所述的宿主微生物较佳的为大肠杆菌，更佳的为大肠埃希氏菌(E. coli)BL21 (DE3)。
6.如权利要求1 5任一项所述的应用，其特征在于所述的应用按下述方法进行在 NAD+和/或NADH、以及异丙醇的存在下，在所述的氧化还原酶或其重组酶的作用下，将作为底物的前手性羰基化合物进行不对称还原反应，制得光学活性手性醇。
7.如权利要求1或6所述的应用，其特征在于所述的前手性羰基化合物为芳基酮类化合物或酮酯类化合物，更佳的为R1COIi2、R3COCH2COOCH2CH3或R4COCOOCH2CH3 ；其中， R1 为-C6H5 或-C6H4X, R2 为-CH3、-CH2CF3 或-CH2X, R3 为-CH3、-CH2CH3、-CH2X 或-CF3, R4为-CH3、-C(CH3)2、-C6H4X或-(CH2)2C6H5，X为Cl或Br，X在苯基上取代的位置为邻位或对位。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述的前手性羰基化合物的量在单一水相溶剂体系中为10 200g/L反应溶液，在有机溶剂相/水相的两相转化体系中为10 600g/ L水；和/或，所述的氧化还原酶或其重组酶采用下述形式加入反应体系将粗酶液直接加入反应体系，或者将悬浮或溶解有冻干细胞或粗酶粉的pH5 9、优选6 7的缓冲水溶液加入反应体系；所述的缓冲水溶液较佳的为磷酸盐缓冲液；所述的缓冲液的浓度较佳的为 50 IOOmM ；所述的缓冲水溶液优选pH6. 5、IOOmM的磷酸-磷酸钠缓冲液；和/或，所述的氧化还原酶或其重组酶的量为80 400U/g底物，优选200 400U/g 底物；和/或，所述的异丙醇的量为前手性羰基化合物摩尔量的1 45倍，优选1. 6 1. 8倍；禾口 /或，所述的NAD+和/或NADH的量为0. 3 1. Ommol/L ；和/或，所述的不对称还原反应中，在反应体系中还加入MgCl2,所述的MgCl2的量较佳的为 2mmol/L ；所述的mmol/L在单一水相溶剂体系中为mmol/L反应溶液，在有机溶剂相/水相的两相转化体系中为mmol/L水。和/或，所述的不对称还原反应的温度为20 40°C，优选25 30°C ；和/或，所述的不对称还原反应的时间以反应完全为准。
9.如权利要求6或8所述的应用，其特征在于所述的不对称还原反应的溶剂体系为缓冲水溶液体系或有机溶剂相/水相的两相转化体系；所述的有机溶剂相与水相的体积比较佳的为0.5 1.5 1，更佳的为1 1，所述的水相为缓冲水溶液；所述的缓冲水溶液较佳的为磷酸盐缓冲液；所述的缓冲液的浓度较佳的为50 IOOmM ；所述的缓冲水溶液优选pH6. 5、IOOmM的磷酸-磷酸钠缓冲液；所述的有机溶剂为邻苯二甲酸二丁酯、异辛烷、正庚烷、辛酸乙酯、正己烷、正辛醇、甲苯或乙酸丁酯， 更优选甲苯；和/或，所述的底物和异丙醇以分批加入的方式加入反应体系；底物和异丙醇分批加入的批次为3 6次，优选4次；每批次底物的加入量为底物总量的1/6 1/3，优选1/4 ’异丙醇首次加入量为总量的2/5 3/5，优选2/5 ；剩余批次的异丙醇加入量为总量的1/10 3/10，优选1/5 ；每批次底物和异丙醇加入的时间为前批次底物反应完全后加入。
10.一种重组氧化还原酶，其特征在于其为权利要求1 5任一项中所述的重组酶。
全文摘要
本发明公开了一种氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示的氧化还原酶或其重组酶作为羰基还原酶催化剂在不对称还原前手性羰基化合物以制备光学活性手性醇中的应用。本发明还公开了由下述方法制得的重组氧化还原酶培养包含碱基序列如序列表中SEQ ID No.1所示的氧化还原酶基因的重组表达转化体，即可。本发明涉及的氧化还原酶制备简便，作为羰基还原酶催化剂可适用的前手性羰基化合物范围广，具有优异的催化活性，可获得高转化率、高光学纯度的光学活性手性醇，并且可实现自身辅酶NADH的再生，无需另外加入其它辅酶再生系统，整个反应过程不需控制pH，反应条件温和，具有很好的工业应用开发前景。
文档编号C12N15/63GK102154377SQ20101059937
公开日2011年8月17日 申请日期2010年12月17日 优先权日2010年12月17日
发明者倪燕, 沈乃东, 潘江, 王丽娟, 许建和, 邱勇隽, 邱立欢 申请人:华东理工大学