肽库的制作方法

专利名称：肽库的制作方法
技术领域：
本发明涉及肽，所述肽的结构通过结合至提供结构主链的化合物而受限，从而赋予所述肽构象。特别地，本发明涉及通过改变肽和结构主链之间的相互作用而改变这种肽库的构象多样性。
背景技术：
不同的研究组已在先将具有半胱氨酸残基的多肽与合成分子结构连结(Kemp， D. S.禾口 McNamara，P. Ε.，J. Org. Chem, 1985 ；Timmerman, P.等人，ChemBioChem, 2005)。 Meloen和同事已使用三(溴甲基)苯和相关分子以在合成骨架上快速定量地环化多个肽环从而结构模拟蛋白质表面(Timmerman，P.等人，ChemBioChem，2005)。用于产生候选药物化合物的方法(其中所述化合物通过将含半胱氨酸的多肽连接至例如三(溴甲基)苯的分子骨架而产生)公开于WO 2004/077062和W02006/078161中。W02004/077062公开了一种选择候选药物化合物的方法。特别地，该文献公开了包含第一和第二反应基团的各种骨架分子，并将所述骨架与另外的分子接触以在偶联反应中在所述骨架和另外的分子之间形成至少两个连接。W02006/078161公开了结合化合物、免疫原化合物和拟肽类。该文献公开了取自现有蛋白质的各种肽集合的人工合成。然后将这些肽与具有一些引入的氨基酸变化的恒定合成肽组合以制备组合库。通过经由化学连接至具有各种氨基酸变化的单独的肽而引入该多样性，提供了增加的机会来发现所需的结合活性。该文献的图7显示了合成各种环肽构造的示意性代表。在该文献中公开的构造依赖于-SH官能化的肽，其通常在骨架上包含半胱氨酸残基和芳香杂环基团，所述骨架通常包含苄基卤取代基，如双-或三-溴苯基苯。这种基团反应以在肽和骨架之间形成硫醚连接。在本申请人的共同待审的未公布的国际专利申请PCT/GB2009/000301中，本申请人公开了使用生物选择技术(如噬菌体展示)以选择连结至合成分子结构的肽。

发明内容
骨架和多肽之间的相互作用的性质对于决定肽-骨架缀合物的结构形式是重要的。尽管现有技术利用骨架来将结构赋予多肽，并因此允许通过改变肽序列而引入构象多样性，但现有技术并未认识到结构以及结构多样性可通过操纵肽和骨架之间的相互作用， 以及改变骨架本身而得以改变。本发明提供了利用骨架和骨架-肽界面而改变结构和/或引入结构多样性。因此，在第一方面，本发明提供了一种改变第一多肽配体或第一组多肽配体的构象以制备第二多肽配体或第二组多肽配体的方法，每个多肽配体包含由共价连接至分子骨架的环序列分隔的至少两个反应基团，所述分子骨架与所述反应基团形成共价键，所述方法包括自多肽和所述第一配体或第一组配体的骨架组装所述第二配体或第二组配体，加上如下步骤之一
a)改变至少一个反应基团；或b)改变所述分子骨架的性质；或c):改变至少一个反应基团和所述分子骨架之间的键；或d) (a)、(b)或(C)的任意组合。本发明所采用的方法允许本领域技术人员改变包含共价连接至分子骨架的多肽的任意结构化多肽的构象，以及这种肽的基团。改变结构化多肽的构象将影响其功能。例如，当结构化多肽为结合分子时，可改变结合特异性和/或结合亲合力。结合亲合力可增大或减小。亲合力的增大可具有优点，例如允许使用较小量的治疗剂或诊断剂。同样，可优选具有减小亲合力的化合物，例如以减少来自低水平的靶蛋白(T-细胞受体配体等)的背景。反应基团的改变通常包括用于与骨架形成共价键的氨基酸侧链中的变化。例如， 反应性胺或硫醇基团可被取代。这可通过氨基酸置换发生，例如半胱氨酸由另一天然氨基酸(如赖氨酸)置换；由替代氨基酸(如硒代半胱氨酸或叠氮苯丙氨酸)置换；以及例如通过改变相邻氨基酸之一或两者来改变反应基团位于多肽中的环境，由此影响肽结构。改变分子骨架的性质包括，例如，改变骨架反应基团的性质。例如，将三(溴甲基) 苯骨架改变为三(溴甲基)均三甲苯骨架引入了附接于苯环的甲基基团，并允许骨架和多肽之间更小程度的“作用(play)”，从而导致更刚性的结构。如果多肽缀合物的结构与靶标互补，则相比于更柔性的结构与靶标结合，可更倾向刚性结构与靶标结合；在另一方面，如果多肽缀合物的结构不互补，则可优选更柔性的结构与靶标结合，因为在肽配体和靶标之间存在适应配合的更多可能性。可得到许多替代骨架反应基团，如下所列，更多的对于本领域技术人员是显而易见的。骨架本身也可改变，例如通过选择不同的分子结构。所述骨架可具有或不具有对第一谱系中的骨架的一定程度的结构相似性；因此，本发明设想使用结构上类似，但化学上不同的骨架。此外，本发明包括使用结构上不同的骨架。改变反应基团和骨架之间的键可得自反应基团或骨架反应基团的性质的改变。此夕卜，其可为在骨架附接之后的键的改性的结果。例如，骨架和肽之间的硫醚连接的氧化导致亚砜的形成，所述亚砜具有改变的几何，并因此赋予肽配体中的多肽不同的结构。弓I入骨架、多肽或键的改变无需为对称的。例如，如果在肽上存在两个或三个反应基团，仅需改变它们中的一个以引入增加的库多样性。或者，可改变一定百分比的反应基团；例如，20、30、40或50%的多肽分子可被构造为在一个或多个位置上具有经改变的反应基团，而剩余的多肽未改性或以不同的方式改性。同样，骨架改变无需为对称的。不对称的骨架可在一个、两个、三个或更多个位置上存在不同的骨架反应基团。这种基团可为正交的，从而支配与多肽的结合的特定排列，由此减少可形成的肽配体的结构异构体的数目。或者，可允许异构体的形成以促进甚至更大的多样性。本发明的库的集合本身可用于引入多样性。例如，可将多肽谱系暴露于两个或更多个骨架物种(可能为骨架谱系)，从而通过序列变化和骨架变化的不同组合而产生增加的多样性。如果骨架具有三个骨架反应基团，则仅通过随机化所述骨架反应基团的性质即可引入显著的变化程度。结合多肽序列的随机化，这可产生大大增加的谱系尺寸。当应用于多肽谱系时，根据本发明的方法可用于增加多肽配体的结构多样性。此夕卜，另外的多样性可通过选择可能具有不同的结构性质的不同骨架而获得。在优选具体实施方案中，本发明包括从较小组的多肽配体(包括例如单个多肽配体)产生一组或一个谱系的多肽配体。在这种具体实施方案中，通过如下的任意一个或多个方式产生多样性骨架的改变或置换、肽中至少一个反应基团的改变，和/或改变多肽和骨架之间的至少一个键。适当地，当需要时，谱系的多样性可进一步通过改变肽序列而提高。例如，可在多肽中的反应基团之间进行氨基酸加入、删除或取代，因此改变掩埋 (subtended)在骨架的附接点之间的环的序列。例如，可改变一个环，而留下第二个环不改变。因此，本发明提供了一种自第一多肽配体产生一组不同多肽配体的方法，所述第一多肽配体包含由共价连接至分子骨架的环序列分隔的至少两个反应基团，所述分子骨架与所述反应基团形成共价键，所述方法包括自多肽和所述第一配体或第一组配体的骨架组装一组或一个谱系的配体，并加上如下改变之一a)改变至少一个反应基团；或b)改变所述分子骨架的性质；或c):改变至少一个反应基团和所述分子骨架之间的键；或d) (a)、(b)或(C)的任意组合；或e)结合(a)至(d)的任一步骤改变多肽序列。在一个具体实施方案中，多样性可通过使一个或多个多肽配体环经受完全蛋白水解或部分蛋白水解而产生。一个或多个配体环的分裂可改变结构，并因此改变其功能性质。 有利地，蛋白水解可与一个或多个环的多肽序列的改变结合使用。在第二方面，本发明提供了一种增加第一谱系的多肽配体的构象多样性的方法， 所述第一谱系的多肽配体包括多个多肽，所述多肽包含由共价连接至分子骨架的环序列分隔的至少两个反应基团，所述分子骨架与所述反应基团形成共价键，所述方法包括自所述第一谱系的多肽和至少两个结构上不同的分子骨架物种组装第二谱系的肽配体。所述结构上不同的分子骨架物种的不同之处可在于分子结构和/或一个或多个骨架反应基团的性质。分子骨架的变化可用于进行所选多肽配体的亲合力成熟(affinity maturation)。在一个具体实施方案中，本发明提供了一种用于提供多肽配体的方法，所述多肽配体包含在两个或更多个氨基酸残基处共价连接至分子骨架的多肽，所述方法包括如下步骤(a)提供第一谱系的多肽；(b)将所述多肽缀合至分子骨架以形成第一谱系的多肽缀合物，所述分子骨架在两个或更多个氨基酸残基处结合至所述多肽；(c)筛选所述第一谱系以用于结合靶标，并选择结合至靶标的第一谱系成员；(d)根据如上所述的本发明的第一方面，将另外的变化引入所述多肽配体，从而产生第二谱系的多肽缀合物；以及(e)筛选所述第二谱系以改进结合至靶标。特别地，骨架中的改变(其增加或降低多肽结构的柔性)对结合亲合力具有显著影响而无需改变结合特异性。
此外，本发明提供了一种用于改变多肽配体的结合活性的方法，所述多肽配体包括多肽，所述多肽包含由共价连接至分子骨架的环序列分隔的至少两个反应基团，所述分子骨架在两个或更多个氨基酸残基处与所述反应基团形成共价键，所述方法包括如下步骤(a)改变至少一个反应基团；或(b)改变所述分子骨架的性质；或(c):改变至少一个反应基团和所述分子骨架之间的键；或(d) (a)、(b)或(C)的任意组合；或(e)结合(a)至(d)的任一步骤改变多肽序列。筛选可通过分析独立分子而进行。这种方法在WO 2004/077062和W02006/078161 中提供。然而，独立化合物或小组化合物的筛选是冗长的，且如果分析大量化合物，则所述筛选可能是昂贵的。可使用筛选试验进行试验的化合物数目通常不超过数千。由于以此方式筛选大量多肽配体可能是效率低的，因此极度需要改进的筛选能力。在优选的具体实施方案中，多肽谱系以核酸库的形式提供，并作为基因展示系统的部分引入。适用系统包括噬菌体展示、细菌展示、酵母展示、核糖体或多核糖体展示、mRNA 展示和人工微囊中的活体外表达。优选技术为使用丝状噬菌体的噬菌体展示。本发明的多肽配体包含掩埋在分子骨架上的两个反应基团之间的至少一个多肽环。优选地，本发明的多肽缀合物包含两个环。其可为对单个靶标特异性的，或为结合至两个或更多个靶标的多特异性的。可将数个这种多肽缀合物一起引入同一分子中。例如， 具有相同特异性的两个这种多肽缀合物可经由分子骨架连接在一起，从而增加了配体对其靶标的亲合力。或者，在另一具体实施方案中，组合多个多肽缀合物以形成多聚体。例如， 组合两个不同的多肽缀合物以产生多特异性分子。或者，可组合相同或不同的三个或更多个多肽缀合物以形成多特异性配体。在一个具体实施方案中，多价复合物(complex)可通过将相同或不同的分子骨架连接在一起而构造。本领域技术人员将了解靶分子的选择很大且多变。靶分子可例如为人类或动物蛋白、细胞因子、细胞因子受体、酶的酶辅因子或DNA结合蛋白。合适的细胞因子和生长因子包括但不限于ApoE、Apo-SAA, BDNF、心肌营养蛋白-1、EGF、EGF受体、ENA78、嗜酸性粒细胞趋化因子、嗜酸性粒细胞趋化因子-2、重组人次级非淋巴组织趋化因子(Exodus-2)、 FGF-酸性、FGF-碱性、成纤维细胞生长因子-10 (30)。FLT3配体、曲动蛋白(CX3C)、⑶NF、 G-CSF、GM-CSF、GF-1、胰岛素、IFNy, IGF-I、IGF-II、IL_la、IL-I (3、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、 IL-6、IL-7、IL-8(72a. a.)、IL_8(77a. a.)、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、 IL-17、IL-17a、IL_17c、IL_17d、IL_17e、IL_17f、IL-18(IGIF)、IL-21、IL-22、IL-23、IL-31、 IL-32、IL-33、IL-34、抑制素α、抑制素β、ΙΡ-10、角质细胞生长因子-2 (KGF-2)、KGF、瘦素、LIF、淋巴细胞趋化因子、苗勒氏抑制物质、单核细胞集落抑制因子、单核细胞吸附蛋白 (30ibid)、M-CSF、MDC(67a. a.) ,MDC (69a. a.) ,MCP-I (MCAF)、MCP-2、MCP_3、MCP_4、MDC (67a. a.) ,MDC (69a. a.)、MIG、MIP-la、MIP_lp、MIP_3a、MIP3 (3、MIP_4、骨髓抑制因子-1 (MPIF-I)、 NAP-2、神经秩蛋白、神经生长因子、P-NGF, NT_3、NT-4、抑瘤素M、PDGF-AA, PDGF-AB,PDGF-BB、PF-4、RANTES、SDFla、SDFlp、SCF、SCGF、肝细胞因子(SCF)、TARC、TGF-α , TGF- β、 TGF-2、TGF-3、肿瘤坏死因子(TNF)、TNF_a ,TNF-β、TNF 受体 I、TNF 受体 II、TNIL_1、TP0、 VEGF、VEGF 受体 1、VEGF 受体 2、VEGF 受体 3、GCP_2、GR0/MGSA、GR0-β、GR0_ γ、HCC1、1-309、 HER UHER 2,HER 3和HER 4。细胞因子受体包括前述细胞因子的受体。趋化因子靶标包括 CC 趋化因子配体 CCL21 /6Ckine、CCL12/MCP-5、CCL6/C10、CCL22/MDC、CCL14/HCC-1 /HCC-3、 CCL3L1/MIP-1 α 同种型 LD78 β、CCL23/Ck β 8-1、CCL3/MIP-1 a、CCL28、CCL4L1/LAG-1、 CCL27/CTACK、CCL4/MIP-1 β、CCL24/ 嗜酸性粒细胞趋化因子-2/MPIF-2、CCL15/MIP-1 δ、 CCL26-类/嗜酸性粒细胞趋化因子-3-类、CCL9/10/MIP-1 y、CCL26/嗜酸性粒细胞趋化因子-3、CCL19/MIP-3 β、CCLl 1/ 嗜酸性粒细胞趋化因子、CCL20/MIP-3 a、CCL14a/HCC_l、 CCL23/MPIF-1、CCL14b/HCC-3、CCL18/PARC 、CCL16/HCC-4、CCL5/RANTES 、CCL1/I-309/ TCA-3、TAFA1/FAM19A1、MCK-2、TAFA5/FAM19A5、CCL2/JE/MCP-1、TAFA3/FAM19A3、CCL8/ MCP-2、TAFA4/FAM19A4、CCL7/MCP-3/MARC、CCL17/TARC、CCL13/MCP-4 和 CCL25/TECK ；趋化因子受体包括 CCRl、CCR7、CCR2、CCR8、CCR3、CCR9、CCR4、CCRlO、CCR5、CCRL2/LCCR/CRAM-A/ B 和 CCR6 ；CXC 趋化因子配体包括 CXCL13/BLC/BCA-1、C)(CL10/IP-10/CRG-2、CXCL14/BRAK、 LIX、CXCLl6, CXCL15/Lungkine、CXCL5/ENA—78、CXCL9/MIG、CXCL6/GCP—2、CXCL7/NAP—2、 CXCL1/2/3/GR0、CXCL4/PF4、CXCL1/GR0 α /KC/CINC-1、CXCL12/SDF-1 α、CXCL2/GR0 β / MIP-2/CINC-3、CXCL12/SDF-1 β、CXCL3/GR0 γ /CINC-2/DCIP-1、CXCL12/SDF-1、CXCLll/ I-TAC, CXCL7/胸腺趋化因子-1和CXCL8/IL-8 ；CXC趋化因子受体包括CXCR3、CXCR7/ RDC-I、CXCR4、CXCR1/IL-8RA、CXCR5、CXCR2/IL-8RB 和 CXCR6 ；TNF 超科配体包括 4-1ΒΒ 配体 /TNFSF9、LIGHT/TNFSF14、AraiL/TNFSF13、淋巴毒素、BAFF/BLyS/TNFSF13B、淋巴毒素 β /TNFSF3、CD27 配体 /TNFSF7、0X40 配体 /TNFSF4、CD30 配体 /TNFSF8、TL1A/TNFSF15、 CD40 配体 /TNFSF5、TNF-a /TNFSF1A、EDA (pan) ,TNF-β /TNFSFIB,EDA-Al/ 外异蛋白 Al、 TRAIL/TNFSF10、EDA-A2、TRANCE/TNFSF11、Fas 配体 /TNFSF6、TWEAK/TNFSF12 和 GITR 配体 /TNFSF18 ；TNF 超科受体包括 4-1BB/TNFRSF9/CD137、NGF R/TNFRSF16、BAFFR/TNFRSF13C、 骨原壳蛋白 /TNFRSF11B、BCMA/TNFRSF17、0X40/TNFRSF4、CD27/TNFRSF7、RANK/TNFRSF11A、 CD30/TNFRSF8、RELT/TNFRSF19L、CD40/TNFRSF5,TACI/TNFRSF13B,DcR3/TNFRSF6B,TNFRH3/ TNFRSF26、DcTRAIL R1/TNFRSF23、TNF RI/TNFRSF1A、DCTRAIL R2/TNFRSF22、TNFRII/ TNFRSF1B、DR3/TNFRSF25、TRAIL R1/TNFRSF10A、DR6/TNFRSF21、TRAILR2/TNFRSF10B、EDAR、 TRAIL R3/TNFRSF10C、Fas/TNFRSF6/CD95、TRAILR4/TNFRSF10D、GITR/TNFRSF18、TROY/ TNFRSF19、HVEM/TNFRSF14、I￥EAKR/TNFRSF12、淋巴毒素 β R/TNFRSF3 和 XEDAR ；Toll-样受体包括 TLR-I、TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-5、TLR-6、TLR-7、TLR-8 和 TLR-9 ；酶，包括组织蛋白酶A、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶F、MMPl、MMP2、 MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、MMP17、MMP19、 MMP20、MMP21、MMP23A、MMP23B、MMP26、MMP27、MMP28、尿激酶、激肽释放酶，包括 KLKl、KLK2、 KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK9、KLK10、KLK11、KLK12、KLK13、KLK14 和 KLK15 ；补体系统的组分；细胞内信号分子和转录因子；P53 ；和MDM2。靶标也可为大血浆蛋白，如血清白蛋白，如下所列。应了解该列表并不是穷举的。在第三方面，本发明提供了一种包含多肽的多肽缀合物，所述多肽包含至少三个反应基团，每一个反应基团由共价连接至分子骨架的环序列分隔，所述分子骨架包含与所述反应基团形成共价键的至少三个骨架反应基团，其中所述分子骨架包含至少两个不同的骨架反应基团。优选地，所述分子骨架包含三个不同的反应基团。可将另外的结合或官能活性附接至共价连接至分子骨架的肽的N或C末端。所述官能团例如选自能够结合至延长多肽配体在活体内的半衰期的分子的基团，以及延长多肽配体在活体内的半衰期的分子。这种分子可为，例如，HSA或细胞基质蛋白，且能够结合至延长多肽配体在活体内的半衰期的分子的基团为对HSA或细胞基质蛋白特异性的抗体或抗体片段。在一个具体实施方案中，所述官能团为结合分子，其选自包含共价连接至分子骨架的多肽的第二多肽配体，和抗体或抗体片段。可将2、3、4、5或更多个多肽配体结合在一起。这些配体的任意两个或更多个的特异性可相同或不同；如果它们相同，则将形成多价结合结构，该多价结合结构相比于单价结合分子具有增加的对靶标的亲合力。此外，分子骨架可相同或不同，并可掩埋相同或不同数目的环。此外，所述官能团可为效应物基团，例如抗体Fc区域。可在将肽结合至分子骨架之前或之后进行附接至N或C末端。因此，可制备(合成，或通过核酸表达)已在适当位置具有N或C末端多肽基团的肽。然而，优选在肽已与分子主链组合以形成缀合物之后进行N或C末端的插入。例如，可使用芴甲氧羰酰氯以在多肽的N-末端处引入Fmoc保护基团。Fmoc结合至包括具有高亲合力的HSA的血清白蛋白， 且Fmoc-Trp或FMOC-Lys以增加的亲合力结合。肽可使用留下的Fmoc保护基团合成，然后通过半胱氨酸与骨架偶联。替代物为棕榈酰部分，其也结合HSA，并例如已在利拉鲁肽中使用以延长该GLP-I类似物的半衰期。Fmoc基团给予双环肽人血清白蛋白结合功能。或者，可制备肽与骨架的缀合物，然后例如使用胺和巯基反应连接体N-e-马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯(EMCQ在N末端处改性。经由该连接体，肽缀合物可连接至其他多肽，例如抗体Fc片段。结合官能团可为结合至分子骨架的另一个肽(从而产生多聚体)；另一结合蛋白 (包括抗体或抗体片段)；或任何其他所需实体(包括血清白蛋白或诸如抗体Fc区域的效应物基团)。此外，可将另外的结合或官能活性直接结合至分子骨架。有利地，所述分子骨架包含可结合所述另外的活性的反应基团。优选地，该基团相对于分子骨架上的其他反应基团为正交的，以避免与肽相互作用。在一个具体实施方案中， 所述反应基团可被保护，当需要缀合另外的活性时将所述反应基团去保护。在另一方面，本发明还提供了一种包含至少一种根据本发明的肽配体的试剂盒。在另外的方面，本发明提供了一种包含可通过本发明的方法获得的肽配体、药物可接受的载体、稀释剂或赋形剂的组合物。此外，本发明提供了一种使用根据本发明的肽配体或组合物治疗疾病的方法。在另外的方面，本发明提供了一种使用根据本发明的肽配体或组合物诊断(包括诊断疾病)的方法。因此，通常可利用分析物与肽配体的结合来置换试剂，这导致在置换时信号的产生。例如，分析物(第二靶标)的结合可置换结合至肽配体的酶(第一靶标)，从而提供结合试验的基础，特别是如果酶通过其活性部位保持在肽配体上时。本发明的多肽缀合物的特别的优点是比现有技术的结合剂更小。通常，这种配体具有5000道尔顿以下，优选4000道尔顿以下，且优选3000道尔顿以下的分子量。应了解如本发明的第二构造中描述的由“菊花链(daisy-chaining) ”肽配体构造的配体将具有更高的分子量。此外，结合至分子(如HSA)的肽配体将具有高得多的分子量。配体的小尺寸源于小分子骨架(通常质量为500道尔顿)的使用。肽本身优选长度小于27个氨基酸，所述长度在将肽附接至分子骨架的N-末端附接点和C-末端附接点之间测得。当然，在所述附接点之外可存在或附接另外的肽，从而增长肽结构。每个多肽环长度优选为0和9个氨基酸之间，所述长度在相邻附接点之间测得。有利地，在任意肽配体中的环长度独立地为3、4、5、6、7、8或9个氨基酸。
具体实施例方式除非另外限定，本文所用的所有技术和科学术语具有如本领域普通技术人员(如在肽化学、细胞培养和噬菌体展示、核酸化学和生物化学领域中)所通常理解的相同含义。 使用标准技术用于分子生物学、基因和生物化学方法(参见Sambrook等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第三版，2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY ；Ausubel 等人，Short Protocols in Molecular Biology (1999) 第四版，John ffiley&Sons, Inc.)，其以引用方式并入本文。本文所指的肽配体指共价结合至分子骨架的肽。通常，这种肽包含能够与骨架形成共价键的两个或更多个反应基团，和掩埋在所述反应基团之间的序列，所述序列称为环序列，因为当所述肽结合至骨架时其形成环。所述反应基团为能够与分子骨架形成共价键的基团。通常所述反应基团存在于肽上的氨基酸侧链上。优选诸如半胱氨酸、赖氨酸和硒代半胱氨酸的含氨基基团。靶标为所述肽配体结合的分子或其部分。通常，所述靶标类似于表位。所述分子骨架为能够在多个点连接肽以将一个或多个结构特征赋予肽的任意分子。分子骨架不是交联剂，因为其不仅仅置换二硫键，相反，其提供用于肽的两个或更多个附接点。优选地，分子骨架包含用于肽的至少三个附接点，称为骨架反应基团。这些基团能够与肽上的反应基团反应以形成共价键。分子骨架的优选结构如下描述。谱系为变体的集合，在该情况中为序列不同的多肽变体。在一些具体实施方案中， 反应基团的位置和性质不变化，但可将在它们之间形成环的序列随机化。在其他具体实施方案中，反应基团本身可变化。谱系的尺寸可变化，在本发明中谱系的尺寸可取决于谱系的目的。例如，第一谱系有利地为大谱系，其可适合于使用噬菌体选择。这种谱系有利地由至少102、103、104、105或更多个不同的多肽变体组成。较小谱系可能不旨在通过基因展示系统 (例如噬菌体展示)进行选择，并可由100个或更少的不同的多肽变体组成。例如，它们可由10、20、30、40或50个不同的多肽变体组成。因此，例如，起始于第一谱系，可根据本文所述的方法改变一个子集的成员以制备第二更小谱系，所述第二更小谱系本身可被筛选而无需使用基因展示技术(如噬菌体展示)。一组多肽变体包括至少两个不同的多肽变体，并可包括5、10、15、20、25、30、40、50
或更多个不同的变体。对于较小谱系，变体组可被筛选而无需使用基因展示技术(如噬菌体展示)，但所述变体组应服从使用任何合适的多肽展示技术(如固相多肽阵列、微量滴定板等)进行筛选。结合活性(或任意其他所需的活性)的筛选根据本领域公知的方法进行，例如噬菌体展示技术。例如，可使用固定至固相的靶标确定和分离谱系的结合成员。筛选允许根据所需特性选择谱系成员。术语库指异质多肽或核酸的混合物。所述库由成员组成，每一个所述成员具有单个多肽或核酸序列。在该意义上，库与谱系同义。库成员之间的序列差异导致存在于库中的多样性。所述库可采取多肽或核酸的简单混合物的形式，或可为用核酸库转化的生物体或细胞的形式，例如细菌、病毒、动物或植物细胞等。优选地，每个独立的生物体或细胞仅含有一个或有限数目的库成员。有利地，将核酸引入表达载体，以允许由核酸编码的多肽的表达。因此，在优选的方面，库可采取寄助物群体的形式，每一个生物体含有表达载体的一个或多个复制体，所述表达载体含有核酸形式的库的单个成员，该成员可被表达以产生其对应的多肽成员。因此， 寄助物群体具有编码基因不同的多肽变体的大谱系的可能性。优选地，核酸库编码多肽谱系。库的每一个核酸成员优选具有与库的一个或多个其他成员相关的序列。相关序列意指具有至少50%同一性，适当地至少60%同一性，适当地至少70%同一性，适当地至少80%同一性，适当地至少90%同一性，适当地至少95%同一性，适当地至少98%同一性，适当地至少99%同一性的氨基酸序列。在至少10个氨基酸， 适当地至少12个氨基酸，适当地至少14个氨基酸，适当地至少16个氨基酸，适当地至少17 个氨基酸或参照序列的全长的连续片段上适当地评价同一性。本文所用的改变反应基团或骨架指改变骨架的化学结构或组成，或置换骨架的任意一个或多个反应基团，或置换骨架的任意部分。其也指置换整个骨架。在一个具体实施方案中，改变反应基团或骨架将导致组装的肽配体中的构象改变。例如，其包括将改变骨架上的反应基团的键几何、结构以及因此空间排列的改变、将改变多肽上的反应基团的结构以及因此空间排列的改变、将改变骨架的主链本身的结构的改变，以及这些特征的组合。也包括影响键和连接的柔性的改变，其可改变对于肽配体可预期的适应配合的水平。本文所指的构象多样性为在肽配体谱系中的肽配体的不同构象选择的程度。如果配体谱系用一种骨架构造，则所述多样性将源于肽序列中的变化。根据本发明，另外的多样性可通过改变肽附接至骨架的方式，或通过改变骨架本身而获得。就谱系而言，对于任意给定改变，变化可包括许多选择，由此还引入另外的多样性。因此所得谱系涵盖了初始谱系所不覆盖的多样性空间。该空间可更大、更小或部分重叠。增加配体多样性通常，肽配体谱系可通过现有技术已知的技术或本文描述的技术制得。配体的基本组分，特别是分子骨架和多肽组分，可由Timmerman等人，2005ChemBioChem 6 =821-824, 以及W02004/077062、W02006/078161和W02008/013454已知。使用噬菌体展示以选择与分子骨架复合的多肽描述于Heinis等人，2009，Nature Chemical Biology，5 :502_507，以及本申请人的共同待审的未公布国际专利申请PCT/GB09/000301中。这些文献的每一个以引用方式并入本文。构造根据本发明的配体和配体谱系的优选方法，以及噬菌体展示的使用在如下更详细地描述。通常，可利用骨架-肽界面的改变增加谱系多样性，或(如果需要)降低谱系多样性。如上所述，存在三个基本途径以实现该目的(a)改变多肽的反应基团；(b)改变骨架， 包括骨架的反应基团；(c)改变多肽和骨架之间的键，特别是在已形成键之后。超过一种方法的组合也是可能的。(A)构造配体谱系⑴分子骨架分子骨架有时称为‘分子核’或‘连接体化合物’。该分子(其在一些具体实施方案中为芳族小分子)包含能够与肽形成共价键的骨架反应基团。肽上的反应基团与所述骨架反应基团相互作用以形成所述共价键。适当地，所述分子骨架可以是或可基于天然单体，如核苷、糖或类固醇。适当地，所述分子骨架可包含这种实体的短聚合物，如二聚体或三聚体。已知极广范围的骨架结构，其已在本领域中，例如在CAS注册中编录。参见Lipkus 等人，(2008) J Org Chem 73:4443-4451。贡献结构多样性的因素也是已知的，如杂原子的尺寸和位置。适当地，分子骨架为具有已知毒性，适当地具有低毒性的化合物。合适的化合物的例子包括胆固醇、核苷酸、类固醇或现有药物(如塔马泽盘(tamazepam))。适当地，所述分子骨架可为大分子。适当地，所述分子骨架为由氨基酸、核苷酸或糖类组成的大分子。适当地，所述分子骨架包含能够与靶标多肽的官能团反应以形成共价键的反应基团。本发明的分子骨架含有化学基团，所述化学基团允许本发明的编码库的多肽的官能团与分子骨架形成共价连接。所述化学基团选自广泛范围的官能团，包括苄基卤、α-卤代羧酸或酰胺、丙烯酰基部分、胺、硫醇、醇、酮、醛、腈、羧酸、酯、烯烃、炔烃、酸酐、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、叠氮化物、烷基卤和酰基卤。适当地，所述分子骨架可包含三(溴甲基)苯，特别是1，3，5_三(溴甲基)苯 (iTBMB')或其衍生物，或者可由三(溴甲基)苯，特别是1，3，5_三(溴甲基)苯(‘ΤΒΜΒ，) 或其衍生物组成。在一些具体实施方案中，所述分子骨架可具有四面体几何，使得编码多肽的四个官能团与分子骨架的反应产生不超过两个产物异构体。其他几何也是可能的；实际上，几乎无限数目的骨架几何是可能的，从而导致肽配体多样化的更大可能性。合适的分子骨架为2，4，6_三(溴甲基)均三甲苯。其类似于1，3，5_三(溴甲基)苯，但另外含有附接至苯环的三个甲基基团。在该骨架的情况中，另外的甲基基团可与多肽形成另外的接触，并因此增加了另外的结构限制。因此，获得与使用1，3，5_三(溴甲基)苯不同的多样性范围。当然，甲基基团无需在每个位置上加入；且取代位置无需对称。因此，可获得甚至另外的多样性。本发明的分子骨架选自小分子或大分子结构。所述分子骨架由有机、无机或有机和无机组分组成。
在优选的具体实施方案中，所述分子骨架为小有机分子，例如线性烷烃。更适当地，所述分子骨架为提供较低柔性(即更刚性)的优点的支化烷烃、环烷烃、多环烷烃、芳族 (aromate)、杂环烷烃或杂环芳族。最适当地，所述分子骨架包含至少一个苄基基团。在另一具体实施方案中，所述分子骨架选自大分子结构，例如多肽、多核苷酸或多糖。(ii)多肽如下文更详细所述，肽配体的多肽成分包含两个或更多个反应基团，优选三个或更多个反应基团，以及在反应基团之间的环序列，所述反应基团用于结合至骨架。如在现有技术中，多样性可通过改变环序列而获得。在一个具体实施方案中，用于将肽缀合至分子骨架的反应基团为官能化的-SH基团。具有这种基团的优选的氨基酸为半胱氨酸。然而，其他反应基团可在任意给定多肽中与半胱氨酸结合使用或代替半胱氨酸。例如，两个反应基团可包括一个半胱氨酸和一个另外的合适反应基团(例如包括蛋氨酸、赖氨酸、硒代半胱氨酸或其他)。根据本发明，另外的多样化可通过反应基团的改变而获得。多肽的反应基团适当地由天然或非天然氨基酸的侧链提供。编码多肽的反应基团适当地选自硫醇基团、氨基基团、羧基基团、胍基基团、苯酚基团或羟基基团。编码多肽的反应基团可适当地选自叠氮、酮羰基、炔烃、乙烯基或芳基卤基团。用于连接至分子骨架的编码多肽的反应基团可适当地为多肽的氨基或羧基末端。在一些具体实施方案中，用于连接至分子骨架的多肽的反应基团的每一个具有相同类型。例如，每一个反应基团可为半胱氨酸残基。在一些具体实施方案中，用于连接至分子骨架的反应基团可包括两个或更多个不同类型，或可包括三个或更多个不同类型。例如，所述反应基团可包括两个半胱氨酸残基和一个蛋氨酸或赖氨酸残基，或者可包括一个半胱氨酸残基、一个蛋氨酸或赖氨酸残基和一个N-末端胺或选自如上所述列表的任意基团。对于肽配体，半胱氨酸是可用的，因为其具有如下优点其反应性与所有其他氨基酸最不同。可在分子骨架上使用以与半胱氨酸的硫醇基团反应的骨架反应基团为苄基卤、 α -卤代羧酸或酰胺、丙烯酰基部分、氮丙啶、乙烯基砜。例子为溴甲基苯(骨架反应基团由 TBMB示例)。用于选择性地将化合物偶联至蛋白质中的半胱氨酸的其他骨架反应基团为马来酰亚胺。可在本发明中用作分子骨架的马来酰亚胺的例子包括三-(2-马来酰亚胺基乙基)胺、三-(2-马来酰亚胺基乙基)苯、三_(马来酰亚胺基)苯。不同骨架反应基团的任意改变和组合也是可能的。硒代半胱氨酸为天然氨基酸，其具有与半胱氨酸类似的反应性，并可用于相同的反应。因此，无论何地提及半胱氨酸，除非上下文另外暗示，通常可接受其取代硒代半胱氨酸。赖氨酸(和肽的N-末端的伯胺)也适合用作反应基团以通过连接至分子骨架而改性噬菌体上的多肽。然而，在噬菌体用于选择的情况中，在噬菌体蛋白质中赖氨酸比半胱氨酸更丰富，并存在噬菌体粒子可能变得交联或噬菌体粒子可能失去其感染性的更大风险。尽管如此，已发现在用以与分子骨架形成第二或连续连接的分子内反应(例如，当分子骨架已连接至噬菌体肽时)中，赖氨酸特别有用。在该情况中，分子骨架可优先与所展示的肽的赖氨酸(特别是紧密接近的赖氨酸)反应。选择性地与伯胺反应的骨架反应基团为活化酯，如琥珀酰亚胺、醛或烷基卤。在许多随后实施例中使用的溴甲基基团中，苯环的电子可稳定阳离子过渡态。因此，该特定的烷基卤比未连接至苯(更通常地，(杂环)芳族体系)基团的烷基卤具有 100-1000倍的更高的反应性。用作分子骨架的琥珀酰亚胺的例子包括三-(琥珀酰胺基氨基三乙酸酯)，1，3， 5-苯三乙酸。用作分子骨架的醛的例子包括三甲酰基甲烷，和苯1，3，5三甲醛(1，3，5_三甲酰基苯)。用作分子骨架的烷基卤的例子包括1，3，5_三(溴甲基)-2，4，6_三甲基苯、1， 3，5_三(溴甲基)苯、1，3，5-三(溴甲基)-2，4，6_三乙基苯。在一些具体实施方案中，可在附接分子骨架之前，将分子连接体或变型加入(或产生)编码多肽的反应基团，其中所述连接体或变型能够与分子骨架反应。具有用于连接至分子骨架的反应基团的氨基酸可位于编码多肽内的任意合适的位置。为了影响所产生的特定结构或环，具有反应基团的氨基酸的位置可由熟练操作者进行变化，例如通过操纵编码多肽的核酸以使制得的多肽突变。根据熟练工人的需要或本发明待应用的目的，编码多肽的氨基酸的每一个可为诱变(例如限制变异诱变(restricted variance mutagenesis))的靶标。显然在感兴趣的多肽上要求存在用于键合至分子骨架的至少两个反应基团。除了用于键合至分子骨架的那些氨基酸之外的氨基酸可根据操作者需要而自由变化，并称为‘可变氨基酸’。编码多肽(例如多肽库成员)的所述可变氨基酸可为随机的、部分随机的或恒定的。多肽包含分子骨架结合片段。这是附接分子骨架的区域。适当地，关于多肽上的反应基团的说明适用于该结合片段。适当地，靶标多肽的分子骨架结合片段包含1至27个氨基酸残基，适当地5至20个氨基酸残基。适当地，靶标多肽的分子骨架结合片段包含少于10个氨基酸。这具有如下优点当多肽片段附接至分子骨架时，在多肽片段上加上另外的构象限制。靶标多肽适当地包含序列)(C⑴6C⑴6CX，其中X表示随机的天然氨基酸。适当地， 在本文提及的式中，C可被与骨架反应基团形成共价连接的另一氨基酸置换。靶标多肽适当地包含序列⑴J⑴mY⑴nY⑴。，其中Y表示具有反应基团的氨基酸，X表示随机的氨基酸，m和η为限定中间多肽片段的长度的1和20之间的数字，且1和 ο为限定侧面多肽片段的长度的0和20之间的数字。在一些具体实施方案中，本发明的肽配体可包含具有序列C(X)6C(X)6CW多肽。 在一个具体实施方案中，本发明的库成员或肽配体可包含均三甲苯分子骨架和具有序列 C (X) 6C (X) 6C的多肽，其中所述多肽经由多肽的半胱氨酸残基连结至所述分子骨架的环外甲基基团，从而形成三个硫醚键，且其中X表示氨基酸(适当地为天然氨基酸)。在本发明的一个具体实施方案中，多肽的至少一个反应基团与剩余反应基团正交。正交反应基团的使用允许将所述正交反应基团引导至分子核的特异性位点。涉及正交反应基团的连接策略可用于限制所形成的产物异构体的数目。换言之，通过选择用于至少三个键的一个或多个的反应基团(所述反应基团与选择用于至少三个键的剩余物的反应基团相异或不同)，可有用地获得使多肽的特异性反应基团键合至或将其引导至分子骨架上的特异性位置的特定顺序。在另一具体实施方案中，本发明的编码多肽的反应基团与分子连接体反应，其中所述连接体能够与分子骨架反应，使得所述连接体在最终结合态中将介于分子骨架和多肽之间。基因编码的组合化学库的成员的合适的氨基酸可由任意天然或非天然氨基酸置换。排除在这些可交换氨基酸之外的是具有将多肽交联至分子核的官能团的氨基酸。将可改变的一组相邻氨基酸定义为多肽片段。单个多肽片段的尺寸适当地为1至20个氨基酸。 多肽片段具有随机序列、恒定序列或具有随机和恒定氨基酸的序列。具有反应基团的氨基酸位于本发明的编码多肽内的限定位置或随机位置。在一个具体实施方案中，由具有反应基团的两个氨基酸结合的多肽片段为具有10 个或更少氨基酸的短氨基酸序列，所述反应基团用于与分子骨架/分子核键合。所述编码多肽序列与分子核的反应产生具有高构象限制的库成员。构象受限配体通常更具有特异性，并具有更高的结合亲合力。构象限制也可保护配体免于例如在体液中的蛋白水解降解。在一个具体实施方案中，具有三个反应基团的编码多肽具有序列(X)1Y(X)mY(X) nY(X)。，其中Y表示具有反应基团的氨基酸，X表示随机的氨基酸，m和η为限定中间多肽片段的长度的1和20之间的数字，且1和ο为限定侧面多肽片段的长度的0和20之间的数字。在优选的具体实施方案中，本发明的编码多肽库具有序列AC(X)6C(X)6CG,其中A 表示丙氨酸，C表示半胱氨酸，X表示随机天然氨基酸，且G表示甘氨酸。硫醇介导的缀合物的替代物可用于经由共价相互作用将分子骨架附接至肽。或者，在根据本发明选择或分离多肽之后，这些技术可用于将另外的部分(如与分子骨架不同的感兴趣的小分子)改变或附接至多肽，在该具体实施方案中，显然附接无需为共价的， 并可涵盖非共价附接。通过产生噬菌体(所述噬菌体展示带有必需的化学反应基团的非天然氨基酸的蛋白质和肽，以及带有互补反应基团的小分子)，或者通过在选择/分离阶段之后在制备分子时将非天然氨基酸引入化学或重组合成的多肽，这些方法可代替硫醇介导方法(或与硫醇介导方法结合)使用。引入噬菌体上的肽和蛋白质中的非天然氨基酸可包括1)可与胼、羟胺和它们的衍生物特异性反应的酮反应基团(如在对乙酰基苯丙氨酸或间乙酰基苯丙氨酸中所发现)(Addition of the keto reactive group to the genetic code of Escherichia coli. Wang L, Zhang Z, Brock A, Schultz PG. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 ^Ξ ι 月 7 日；100(1) :56-61 ；Bioorg Med Chem Lett. 2006 年 10 月 15 日；16Q0) :5356-9. Genetic introduction of a diketone-containing amino acid into proteins. Zeng H，Xie J, Schultz PG), 2)可经由铜催化的“点击化学”或品系促进(strain promoted) (3+2)环加成而与炔烃反应形成相应的三唑的叠氮化物(如在对叠氮苯丙氨酸中所发现) (Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Chin JW, Santoro SW, Martin AB，King DS，Wang L，Schultz PG. J Am Chem Soc. 2002 年 8 月 7 日；124(31) :9026-7 ；Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharomyces cerevisiae. Deiters A，Cropp TA, Mukherji M，Chin JW，Anderson JCiSchultz PG. J Am Chem Soc. 2003 年 10 月 1 日；125 (39) :11782-3)或者可经由施陶丁格连接而与芳基膦反应形成相应的酰胺的叠氮化物(Selective Staudinger modification of proteins containing p-azidophenylalanine. Tsao ML，Tian F，Schultz PG. Chembiochem. 2005 年 12 月；6(12) :2147-9)，4)可与叠氮化物反应形成相应白勺三P坐白勺块经(In vivo incorporation of an alkyne into proteins in Escherichia coli.Deiters A, Schultz PG. Bioorg Med Chem Lett. 2005 年 3 月 1 日；15 (5) :1521-4)， 5)可与含有超过一个适当间隔的羟基基团的化合物进行特异性反应的硼酸(硼酸盐)， 或可与卤代化合物发生钯介导的偶联的硼酸(硼酸盐)(Angew Chem Int Ed Engl. 2008 ； 47 (43) :8220-3. A genetically encoded boronate-containing amino acid. , Brustad E，Bushey ML, Lee Jff, GroffD, Liu W，Schultz PG), 6)可特异性配位金属离子的金属螯合氨基酸，包括带有联吡啶的那些(Angew Chem Int Ed Engl. 2007 ；46 (48) :9239-42. A genetically encoded bidentate, metal-binding amino acid. Xie J, Liu W, Schultz PG)。 通过用质粒或质粒的组合转化大肠杆菌，可将非天然氨基酸引入噬菌体上展示的蛋白质或肽，所述质粒或质粒的组合带有1)响应密码子引导非天然氨基酸的引入的正交氨酰基-tRNA合成酶和tRNAd)经改变以在非天然氨基酸引入位点含有所选密码子的噬菌体DNA或噬菌粒质粒(Proc Natl Acad Sci U S A. 2008年11月18日；105 06) 17688-93. Protein evolution with an expanded genetic code. Liu CC, Mack AV, Tsao ML, Mills JH, Lee HS, Choe H, Farzan M, Schultz PG, Smider VV ；A phage display system with unnatural amino acids. Tian F,Tsao ML,Schultz PG. J Am Chem Soc. 2004 年12月15日；U6 09) :15962-3)。正交氨酰基-tRNA合成酶和tRNA可衍生自詹氏甲烷球菌(Methancoccus janaschii)酪氨酉先对或合成酶(Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichiacoli. Chin Jff, Martin AB, King DS, Wang L, Schultz PG. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 年 8 月 20 日；99 (17) :11020-4) 禾口天然弓I 入口比口各赖氛酸的 tRNA 对(Multistep engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase to genetically encode N(epsilon)-(o-azidobenzyloxycarbonyl)lysine for site-specific protein modification. Yanagisawa I, Ishii R, Fukunaga R, Kobayashi I，Sakamoto K, Yokoyama S.Chem Biol. 2008 年 11 月 24 日；15 (11) :1187-97 ； Genetically encoding N(epsilon)-acetyllysine in recombinant proteins. Neumann H, Peak-Chew SY. Chin Jff. Nat Chem Biol. 2008 年 4 月；4 ) :232-4. Epub 2008 年 2 月 17 日)。用于引入的密码子可为琥珀密码子(UAG)，另一终止密码子(UGA或UAA)，或者其可为四碱基密码子。氨酰基-tRNA合成酶和tRNA可由现有载体制得，所述现有载体包括pBK 系列载体、pSUP (Efficient incorporation of unnatural amino acids into proteins in Escherichia coli. Ryu YiSchultz PG. Nat Methods. 2006年4 月；3 (4) :263-5)载体和 pDULE (Nat Methods. 2005^5^ ；2 (5) :377-84. Photo-cross-linking interacting proteins with a genetically encoded benzophenone.Farrell IS, Toroney R， Hazen JL, Mehl RA, Chin JW)。所用的大肠杆菌株将表达F’菌毛(通常经由tra操纵子)。当使用琥珀抑制时，大肠杆菌株本身不含活性琥珀抑制剂tRNA基因。优选以ImM或更高的最终浓度将氨基酸加入生长培养基。可通过使用由正交核糖体结合位点构造的表达并用
弓I入的双· (Evolved orthogonal ribosomes enhance the efficiency of synthetic genetic code expansion. Wang K, Neumann H, Peak-Chew SY, Chin Jff. Nat Biotechnol. 2007年7月；25(7) :770-7)。这可允许有效的多位点引入非天然氨基酸，从而提供附接至配体的多个位点。(iv)附接之后的改性在一些具体实施方案中，可在附接之后的某时改性多肽-分子骨架复合物。蛋白酶分裂在一些具体实施方案中，一旦将本发明的多肽成分连结至分子骨架/分子核，则将它们蛋白水解分裂。所述分裂产生具有连结至分子骨架/分子核的分立的肽片段的配体。例如，在将多肽连结至分子核之后，可将多肽的一个或多个酰胺键蛋白水解分裂。 这具有产生短多肽的优点，每一个所述短多肽通过至少一个共价键结合至分子骨架，但所述短多肽显示不同的在包含编码母体多肽的核酸的复合物中所保持的分子结构。所述多肽分裂适当地通过本领域已知的任何合适的方式(如受控水解或更适当地由合适的蛋白酶进行酶切)进行催化。所述蛋白酶可为任何合适的蛋白酶，但优选为具有特异性多肽识别序列或基元的蛋白酶。这有利地导致产生更确定和/或更可预期的多肽分裂产物。实际上， 在该具体实施方案中，可例如通过操纵编码多肽的核酸而将蛋白酶识别序列系统地加入靶标多肽或从靶标多肽去除。这有利地提供更大程度的控制，并允许根据本发明在展示的分子中产生更大的多样性。因此，可通过改变多肽分子中蛋白酶分裂位点的性质和位置而获得提高的多样性。更适当地，多肽包含至少一个蛋白酶识别位点。适当地，每个所述分裂位点被包含于用于共价键合至分子骨架的多肽上的反应基团之间的氨基酸序列内。适当地， 每个所述识别位点被包含于用于共价键合至分子骨架的多肽上的反应基团之间的氨基酸序列内。肽环适当地用在特异性氨基酸位置识别和加工多肽的蛋白酶进行分裂，所述蛋白酶例如胰蛋白酶(在Pi位置的精氨酸或赖氨酸)或嗜热菌蛋白酶(在Pi位置的脂族侧链)。在一定浓度下使用酶，所述浓度允许有效加工展示分子的肽环，但剩余(spare)噬菌体粒子。最佳条件可取决于多肽环的长度和所用的蛋白酶而变化。例如，胰蛋白酶通常在 10°C下在 TBS-Ca 缓冲液(25mM Tris HCl/137mM NaCl/lmM CaCl2, pH 7.4)中以 200nM 使用10分钟。适于改性展示的多肽但剩余噬菌体的全部范围的蛋白酶描述于Kristensen， P.禾口 Winter, G. (Proteolytic selection for protein folding using filamentous bacteriophages ；Fold Des. 1998 ；3 (5) :321-8)中。在噬菌体上的肽的酶加工可为‘部分蛋白质水解’，因为不能排除有限数目的噬菌体外壳蛋白质被分裂。因此在条件的优化中， 适当地选择靶标的最大分裂与噬菌体粒子的最大剩余之间的最佳平衡。适当地，靶标多肽包含至少一个这种蛋白水解分裂位点。适当地，靶标多肽包含至少两个这种蛋白水解分裂位点。适当地，靶标多肽包含至少三个这种蛋白水解分裂位点。在每一个这种蛋白水解具体实施方案中，适当地，所述蛋白酶位点位于由分子骨架掩埋的靶标多肽环内。这具有使分子骨架保持于复合物上的优点，否则多肽-分子骨架复合物可能从编码靶标多肽的核酸分离，这对于本发明的大多数应用是不希望的。短环(短为例如6个氨基酸残基或更少)的使用可危害一些蛋白酶在环内分裂的能力。在此情况中，合意的是选择有可能更易接近蛋白酶的更长的环。此外，在通过内切蛋白酶分裂环之后，合意的是使用其他内切蛋白酶，或实际上通过外切蛋白酶(如羧肽酶或氨肽酶)进一步削减环。当靶标多肽包含超过一个这种蛋白酶位点时，适当地，每一个所述位点存在于在靶标多肽和分子骨架之间所形成的两个共价键之间。如果需要，可在键之间存在多个分裂位点。在分裂的具体实施方案中，适当地母体多肽将作为整体考虑以用于评估其是否通过至少两个或三个共价键附接至分子骨架。更适当地，当评价靶标多肽是否通过至少三个共价键附接至分子骨架时，将靶标多肽考虑为完整(未分裂)多肽。蛋白酶抗性在另一具体实施方案中，多肽可抗蛋白酶分裂。通常紧密折叠多肽结构更抗蛋白酶，因为蛋白酶不能物理接近多肽以分裂多肽。因此，通过影响多肽环的折叠，操纵肽配体中的骨架和骨架附接可调节蛋白酶敏感性。如在之前部分中所指出，可引入蛋白酶步骤以分裂附接至化学骨架的环内的可接近位点。如果一个谱系的肽缀合物在噬菌体上展示，则这产生肽，每一个所述肽通过至少一个共价键结合至化学骨架，但保持在包含编码母体多肽的核酸的复合物中。预期在用抗原选择之前使用蛋白酶处理化学改性的噬菌体将产生带有包含分裂环的肽缀合物的噬菌体， 以及带有包含未分裂环(其由于缺乏分裂位点，或者由于抗分裂)的肽缀合物的噬菌体。如果一种噬菌体结合至抗原且另一种噬菌体未结合至抗原，则有可能通过在蛋白酶处理前后比较所选噬菌体克隆与靶标抗原的结合来区分这些物种。因此，预期具有分裂环的物种在蛋白酶处理之后结合，但在蛋白酶处理之前不结合；而预期抗蛋白酶物种在处理前后均结合。应注意如果既具有分裂环也具有未分裂环的缀合物结合(如在激肽释放酶分裂之后的 PK15，参见Heinis等人，2009)，则其可能被不正确地认为是抗蛋白酶的。这显示了使用检查分裂的直接方法的重要性，例如通过化学合成肽缀合物，并(例如通过质谱)检查分裂证据。如果分裂环缀合物比抗蛋白酶缀合物更优选，则有利的是在第一回合的选择之前用蛋白酶处理化学改性的噬菌体谱系，并在随后回合中继续使用同一蛋白酶或具有共同切位点的蛋白酶。然而，或者可需要抗蛋白酶缀合物。这种肽可用于口服以免于肠道蛋白酶， 或经受血液、组织或细胞中的蛋白水解攻击的那些蛋白酶。在此情况中，不使用蛋白酶的第一回合的选择(之后为使用蛋白酶的后续回合的选择)应偏向于选择抵抗物种。蛋白酶的使用在选择过程中具有另外的用途。例如，一些未成形的环(线性序列片段)可存在于库中，因为(a)在核苷酸合成中的错误未能编码所需半胱氨酸残基，或(b) 所需半胱氨酸残基已生成二硫键以将半胱氨酸释放至溶液中(可能是由于不充分的还原或再氧化)，或已以不可逆的方式反应(例如被氧化成磺基丙氨酸，或所需半胱氨酸之一已与不同于其他骨架分子的骨架分子反应)。由于线性序列片段比环更易受到蛋白酶攻击，且受制于存在的分裂位点，有可能使用蛋白酶避免这种结合剂。蛋白酶步骤(在还原剂的存在下)也有利于消除环，所述环经由所需半胱氨酸之间的二硫化物形成而不是通过化学骨架形成。如果存在噬菌体上的半胱氨酸的不充分的还原(或随后的再氧化)，则这是预期的。由于该原因，本申请人在化学交联步骤过程中使用脱气缓冲液；本申请人也在与TBMB反应的过程中保持低水平的还原剂(TCEP)以保持还原环境。尽管如此，在第一回合的选择之后，本申请人发现包括四个半胱氨酸残基(三个所需半胱氨酸残基，和在环中的一个另外的半胱氨酸残基)的许多序列，例如在利用MDM2的谱系选择中的CFNSEWSCLQSCSNC(参见实施例1)。由于合成核苷酸库包括随机密码子(NNK多样性其中N表示腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸的每一个为25%的混合物，且K 表示胸腺嘧啶和鸟嘌呤核苷酸的每一个为50%的混合物)，预期这种额外的半胱氨酸存在于肽谱系中。在一些条件下，例如如果存在不充分的还原，或存在所需半胱氨酸与化学骨架的不完全的反应(可能由于骨架通过氨基基团或水的竞争反应)，则预期额外的半胱氨酸在氧化条件下与三个所需半胱氨酸之一形成二硫化物环。或者，额外的半胱氨酸可与骨架反应，剩下两个所需半胱氨酸以形成二硫化物闭环。无论产生二硫化物闭环的确切机理为何，这种二硫化物闭环可与骨架闭环竞争并占优势。应该有可能通过使用由三联体(triplet)而不是单体所构建的合成核苷酸库来减少额外的半胱氨酸的频率，因此避免环中的半胱氨酸密码子；和/或有可能在还原剂的存在下进行选择，以打开二硫化物闭环。更便利地，本申请人已发现，在还原剂(例如二硫苏糖醇)的存在下使用蛋白酶处理化学改性的噬菌体谱系以打开并随后分裂环有助于使这种物种的贡献达到最小。因此，在优选的具体实施方案中，本发明的多肽配体为基本上抗蛋白酶的。因此本发明提供了一种用于选择具有增加的蛋白酶抗性的肽配体的方法，其包括如下步骤(a)提供第一谱系的多肽；(b)将所述多肽缀合至分子骨架以形成一个谱系的多肽缀合物，所述分子骨架在两个或更多个氨基酸残基处结合至所述多肽；(c)筛选所述谱系以用于结合靶标，并选择结合至靶标的第一谱系成员；(d)任选地使用还原剂处理所选谱系；(d)使所述谱系经受蛋白酶抗性选择；以及(e)进一步筛选所述谱系以用于结合至靶标。在最优选的具体实施方案中，在筛选谱系之前包括所述蛋白酶步骤。因此本发明提供了一种用于选择具有增加的蛋白酶抗性的肽配体的方法，其包括如下步骤(a)提供第一谱系的多肽；(b)将所述多肽缀合至分子骨架以形成一个谱系的多肽缀合物，所述分子骨架在两个或更多个氨基酸残基处结合至所述多肽；(c)任选地使用还原剂处理所述谱系；(d)使所述谱系经受蛋白酶抗性选择；以及(e)筛选所述谱系以用于结合靶标，并选择结合至靶标的第一谱系成员。筛选蛋白酶抗性可简单地采取用蛋白酶有限消化的形式；对蛋白酶敏感的那些谱系成员将被消除。最合意的是使用在使用双环肽的条件下(例如在血清的存在下)为活性的蛋白酶。键改性在骨架中的键或在骨架与多肽之间的键可在附接之后进行改性，以改变肽配体的结构。例如，硫醚键可氧化成砜，这改变了键的立体化学，并因此改变了在骨架附接点处掩埋的肽环的结构。更通常地，含有杂原子的基团可被氧化或还原以改变键的立体化学，由此将另外的多样性水平引入肽配体。(ν)合成应注意一旦感兴趣的多肽根据本发明得以分离或确定，则当可能时可简化其随后的合成。例如，可确定感兴趣的多肽的序列，且感兴趣的多肽的序列可通过标准技术合成制得，随后是在活体外与分子骨架反应。当如此进行时，可使用标准化学，因为不再需要保持基因编码的载体粒子的功能和完整性。这使得快速大规模地制备可溶性材料以用于进一步的下游实验或验证成为可能。就此而言，通过本发明的方法确定的候选和榜样(leads)的大规模制备可使用常规化学(如Timmerman等人所公开的方法)实现。因此，本发明也涉及如本文所述选择的多肽或缀合物的制造，其中所述制造包括如下所述的任选的另外的步骤。最适当地，这些步骤在通过化学合成所制得的终产物多肽 /缀合物上进行而不是在噬菌体上进行。任选地，当例如在初始分离/确定步骤之后制造缀合物或复合物时，在感兴趣的多肽中的氨基酸残基可被取代。也可延长肽以引入例如另一个环，并因此引入多特异性。为了延长肽，可使用标准固相或溶液相化学在肽的N-末端或C-末端简单地化学延长肽。可使用标准活化/生物缀合化学引入可活化N-或C-末端。或者，可通过片段缩合或自然化学连接进行加入，例如描述于(Dawson ΡΕ, Muir Tff, Clark-Lewis I, Kent, SBH. 1994. Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science 266 :776-779)中，或通过酶，例如使用微连接 Sl (subtiligase)进行力口入，如描述于(Subtiligase :a tool for semisynthesis of proteins Chang TK,Jackson DY,Burnier JP,Wells JA Proc Natl Acad Sci USA. 1994 年 12 月 20 日；9K26) :12544-8 或 Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters Tags for labelling protein N-termini with subtiligase for proteomics,第 18 卷，第 22 期，2008 年 11 月 15 日，第 6000-6003 页，Tags for labeling protein N-termini with subtiligase for proteomics Hikari A. I. Yoshihara, Sami Mahrus 禾口 James A. Wells) 中。或者，可通过二硫键进一步缀合来延长或改性肽。这具有另外的优点一旦在细胞的还原环境内，允许第一和第二肽彼此分离。在此情况中，分子骨架(例如TBMB)可在第一肽的化学合成过程中加入以与三个半胱氨酸基团反应；然后可将另外的半胱氨酸附加至所述第一肽的N-末端，使得该半胱氨酸仅与第二肽的自由半胱氨酸反应。类似的技术同样适用于两个双环大环的合成/偶联。此外，可使用适当的化学在 N-或C-末端偶联或经由侧链，以相同的方式实现其他官能团或效应物基团的加入。适当地，以不限制任一实体的活性的方式进行偶联。在一方面，可使用结构上等同的另一骨架置换合成分子中的分子骨架。在这种具体实施方案中，肽配体的结构及其特异性优选不改变。该方法的优点在于，可引入可选择的化学，所述化学可能在临床或其他环境中是有利的，或可能较便宜，但在生物选择的情况下无法设想。例如，当使用噬菌体时，化学操纵受到限制，因为其可能影响噬菌体感染性。当合成肽配体时，可消除这种限制，因为噬菌体感染性不再是个问题。(B)肽配体谱系
(i)库的构建旨在用于选择的库可使用本领域已知的技术(例如在W02004/077062中所述)或生物体系(包括本文所述的噬菌体载体体系)构建。其他载体体系是本领域已知的，并包括其他噬菌体(例如噬菌体λ)、细菌质粒表达载体、真核细胞基表达载体，包括酵母载体寸。非生物体系(如W02004/077062所述的那些)基于常规化学筛选方法。非生物体系简单，但缺乏生物体系的能力，因为其筛选大的肽配体库是不可能，或至少是无法实施地繁琐。然而，例如当仅需要筛选少量肽配体时，非生物体系是可用的。然而，通过这种独立试验筛选可为耗时的，且可测试用于结合至特异性靶标的独特分子的数目通常不超过IO6 个化学实体。相比之下，生物筛选或选择方法通常允许取样大得多数目的不同分子。因此，生物方法更适用于本发明的应用。在生物程序中，分子在单个反应容器中进行试验，并将具有有利性质(即结合)的分子与非活性分子物理分离。可获得允许同时产生和试验超过IO13个独立化合物的选择策略。强大的亲合力选择技术的例子为噬菌体展示、核糖体展示、mRNA展示、酵母展示、细菌展示或RNA/DNA适体方法。这些生物活体外选择方法的共同点在于配体谱系由DNA或RNA编码。它们允许通过排序繁殖和确定所选配体。例如，噬菌体展示技术以用于分离对几乎任何靶标具有极高结合亲合力的抗体。当使用生物体系时，一旦选择载体体系，并将编码感兴趣的多肽的一个或多个核酸序列克隆至库载体中时，可通过在表达之前进行诱变而在克隆分子内产生多样性；或者， 可在进行诱变和另外回合的选择之前表达和选择编码蛋白质。这种方法特别指定用于本文所述的肽配体的亲合力成熟。例如，可组合结合至第一和第二靶标的第一和第二谱系的肽配体，且所得第三谱系通过编码谱系的核酸库成员的诱变而经受亲合力成熟。通过标准分子方法进行编码结构上优化的多肽的核酸序列的诱变。聚合酶链反应或 PCR(Mullis 和 Faloona(1987)Methods Enzymo 1.，155 :335，其以引用方式并入本文)具有特别用途。PCR是本领域公知的，其使用由热稳定DNA依赖的DNA聚合酶催化的多个DNA 复制循环以扩大感兴趣的靶标序列。各种抗体库的构建已描述于Winter等人(1994)Arm. Rev. Immunology 12，433-55和其中所引的参考文献中。使用模板DNA(至少Ifg ；更可用地，I-IOOOng)和至少25pmol寡核苷酸引物进行PCR ；当引物池极不均勻时，可能有利的是使用更大量的引物，因为每个序列仅由池的小部分分子表示，且在随后的放大循环中含量变得有限。典型反应混合物包括2μ1 DNA、 25pmol 寡核苷酸引物、2· 5μ 1 IOX PCR 缓冲液 1 (Perkin-Elmer，Foster City, CA) ,0. 4μ 1 1· 25 μ M dNTP、0. 15μ 1(或 2.5 单位 RaqDNA聚合酶(Perkin Elmer, Foster City, CA)禾口去离子水至25 μ 1的总体积。1.覆盖矿物油，使用可编程热循环仪进行PCR。根据实际的严格要求调节PCR循环的每一步骤的长度和温度，以及循环数。退火温度和时间由预期引物退火至模板的效率以及待容许的失配程度决定；显然，当同时放大和诱变核酸分子时，至少在第一回合的合成中要求失配。优化引物退火条件的严格性的能力是本领域技术人员公知的。使用30°C和72°C之间的退火温度。模板分子的初始变性通常在92°C和99°C之间发生4分钟，随后为20-40个循环，所述循环由变性(94-99°C 15秒至1分钟)、退火(温度如上所述确定；1-2分钟)和延长(72°C 1-5分钟，取决于放大产物的长度)组成。最终延长通常为在72°C下4分钟，且可随后为在4°C下的不定(0-24小时)步骤。或者，考虑到根据本发明的多肽的短链长度，变体优选从头合成并插入合适的表达载体中。肽合成可通过如上所述的本领域已知的标准技术进行。自动化肽合成器是普及的，如 Applied Biosystems ABI 433(Applied Biosystems, Foster City，CA，USA)。(ii)基因编码多样性感兴趣的多肽被适当地基因编码。这提供了提高的多样性以及易于处理的优点。 基因编码的多肽库的例子为mRNA展示库。另一例子为可复制基因展示包(rgdp)库，如噬菌体展示库。适当地，感兴趣的多肽被基因编码为噬菌体展示库。因此，适当地，本发明的复合物包含可复制基因展示包(rgdp)，如噬菌体粒子。在这些具体实施方案中，适当地，核酸由噬菌体基因组组成。在这些具体实施方案中，适当地， 多肽由噬菌体外壳组成。在一些具体实施方案中，本发明可用于制备多肽的基因编码组合库，所述多肽通过将许多核酸转译成相应的多肽，并将所述分子骨架的分子连接至所述多肽而产生。多肽的基因编码组合库可通过噬菌体展示、酵母展示、核糖体展示、细菌展示或 mRNA展示产生。适当地，多肽的基因编码组合库通过噬菌体展示产生。在噬菌体展示具体实施方案中，适当地，多肽根据既定技术(例如如下所述)在噬菌体上展示。最适当地，通过将感兴趣的靶标多肽融合至允许外部展示所述感兴趣的多肽的工程化基因来实现这种展示；适当地，所述工程化基因包含噬菌体的工程化基因9 (p9或基因IX)、基因8 (基因VIII)、基因 7 (p7或基因VII)、基因6 (p6或基因VI)或基因3 (p3或基因III)。这些蛋白质提供了如下优点它们含有更少半胱氨酸或不含半胱氨酸，所述半胱氨酸可与分子骨架(如TBMB)反应并产生副产物。对于P6，有利的是使半胱氨酸84突变为丝氨酸。在p7和p9中的半胱氨酸最可能被掩蔽，因此可能无需被突变以将它们去除。P8提供了其不含半胱氨酸残基的优点。 因此，更适当地，所述工程化基因包含噬菌体的工程化基因8 (基因VIII)、基因6 (基因VI) 或基因3(基因III)。最适当地，通过将感兴趣的靶标多肽融合至在结构域1和2中不含半胱氨酸残基的工程化基因3蛋白质来实现这种展示。所述融合可通过本领域已知的任何合适的技术实现，例如通过操纵编码噬菌体基因III蛋白质的核酸以将编码半胱氨酸的密码子变为编码其他氨基酸的密码子，以及通过将编码靶标多肽的核酸序列插入至编码结构中的序列的基因III，使得其作为在噬菌体粒子外部上的基因III融合蛋白质而得以展示。本发明的益处在于所得工程化基因使噬菌体具有感染性，即能够感染和繁殖。甚至当工程化基因为不同于基因3的基因时(如基因6或基因8)，仍然合意的是使基因3去除一个或多个半胱氨酸残基(如全部半胱氨酸残基)。在优选的具体实施方案中，本发明的基因编码的多肽通过转译核酸并将所产生的多肽连接至所述编码而产生。表型与基因型的连接允许繁殖或解码所述编码配体谱系。可获得各种技术以将多肽连接至其多核苷酸编码。所述技术包括噬菌体展示、核糖体展示， mRNA展示、酵母展示和细菌展示等。已使用所述方法产生包含高达IO13个独立成员的编码多肽谱系。可根据本发明产生的独立配体的数目明显高于通常在常规筛选中试验的独立分子的数目。在优选的具体实施方案中，使用噬菌体展示技术来基因编码本发明的多肽。噬菌体展示为其中多肽的基因融合至噬菌体外壳蛋白质的基因的方法。当噬菌体在细菌细胞中产生时，多肽表达为外壳蛋白质的融合。当噬菌体粒子聚集时，多肽在噬菌体表面上展示。 通过使噬菌体谱系与固定的抗原接触，一些噬菌体保持结合至抗原，而其他噬菌体通过洗涤去除。噬菌体可被洗脱和繁殖。可将编码所选噬菌体的多肽的DNA排序。噬菌体展示可用于编码超过101°个独立多肽。噬菌体展示的有利方面在于基因编码，单股DNA被包覆在外壳中。所述外壳可保护DNA免于与分子核反应。在另一优选的具体实施方案中，本发明的多肽库在噬菌体上展示为基因3蛋白质融合。每个噬菌体粒子具有约3至5个所述噬菌体外壳蛋白质的复制体。作为改性多肽的多个复制体的展示的结果，具有微摩尔亲合力的配体(弱结合剂)也可在噬菌体选择中得以分离。或者，使用噬菌粒来降低每个噬菌体的多肽数目，以避免亲合力效应并选择具有较高亲合力的配体。在另一优选的具体实施方案中，使用具有改性外壳蛋白质的噬菌体用于编码本发明的多肽库。特别地，使用在外壳蛋白质中不具有或具有降低数目的特定类型的氨基酸的噬菌体。当分子核对所述特定类型的氨基酸为反应性时，使用所述外壳蛋白质可为有利的。 当用于交联分子核的所展示多肽的反应基团为天然氨基酸，且相同类型的天然氨基酸存在于噬菌体外壳中的表面暴露区域时，明确是这种情况。使用具有改性外壳蛋白质的所述噬菌体可防止噬菌体粒子通过多个噬菌体的氨基酸与同一分子核反应而交联。此外，使用所述噬菌体可减少多肽中的反应基团的氨基酸侧链以及噬菌体外壳蛋白质交联至同一分子核。在另一优选的具体实施方案中，使用具有基因3蛋白质的噬菌体来展示本发明的多肽库，所述基因3蛋白质在结构域1和2中不含二硫桥C7-C36、C46-C53、C188-C201的半胱氨酸残基。具有在所述位置(C7C、C36I、C46I、C53V、C188V、C201A)中的突变，以及在基因 3蛋白质中的另外14个突变以补偿降低的热稳定性(T13I、N15G、R29W、N39K、G55A、T56I、 I60V、T101I、Q129H、N138G、L198P、F199L、S207L、D209Y)的噬菌体由 khmidt F. X.和同事制得(Kather，I.等人，J. Mol. Biol.，2005)。如果用于将多肽交联至分子核的一个或多个官能氨基酸为半胱氨酸残基，则在所述较少外壳蛋白质中不含硫醇基团的噬菌体是合适的。去除在噬菌体外壳蛋白质中的半胱氨酸残基防止了它们妨碍多肽与分子骨架之间的所述键合反应。现在更详细地描述用于本发明的应用的该示例性噬菌体。FX Schmid的不含二硫化物的噬菌体(结构域D1-D2)包含衍生自载体fCKCBS的 fd噬菌体(Krebber, C.，1997，J. Mol. Biol.)。所述载体fCKCBS基于源自美国模式培养物集存库(ATCC :15669-B2)的fd噬菌体载体。野生型fd噬菌体的p3的结构域1和2的氨基酸序列是公众可得的，例如在PubMed 数据库中。为了方便参考，示例性序列为AETVESCLAKPHTENSFTNVWKDDKTLDRYANYEGCLWNATGVVVCTGDETQCYGTWVPIGLAIPENEGGGSEGGGSEGGGSEGGGTKPPEYGDTPIPGYTYINPLDGTYPPGTEQNPANPNPSLEESQPLNTFMFQNNRFRNRQGALTVYTGTVTQGTDPVKTYYQYTPVSSKAMYDAYWNGKFRDCAF
HSGFNEDPFVCEYQGQSSDLPQPPVNAPSGFX khmid和同事通过使4个氨基酸突变而进化地稳定了该噬菌体的p3 (Martin， A. ^P Schmi d, FX.，2003，J. Mol. Biol.)。在一个连续工作中，FX Schmid和同事使6个半胱氨酸突变以消除3个二硫桥，并插入另外的突变以补偿稳定性的损失(Kathe r,I.和khmid FX.，2005，J. Mol. Biol.)。在多个进化周期中，他们已制得均具有不含二硫化物的p3 (所述 P3具有不同热稳定性)的克隆19、20、21和23。突变体21( ‘克隆21’)可如所述制得，或可简单地获自FX khmid和同事。根据 FX Schmid的公开，该克隆在结构域1和2中含有如下突变C7S、T13I、N15G、R29W, C36I、 N39K、C46I、C53V、G55A、TlOlI、Q129H、C188V、F199L、C201A、D209Y。此外，当本申请人排序所述克隆并将其与野生型fd噬菌体进行比较时，本申请人发现了在结构域1和2中的如下突变P11S和P198L。不希望受限于理论，假设这些突变已存在于载体fCKCBS的噬菌体中。克隆21的结构域Dl和D2具有如下氨基酸序列AETVESSLAKSHIEGSFTNVWKDDKTLDWYANYEGILWKATGVWITCDETQVYATWVPIGLAIPENEGGGSEGGGSEGGGSEGGGTKPPEYGDTPIPGYIYINPLDGTYPPGTEQNPANPNPSLEESHPLNTFMFQNNRFRNRQGALTVYTGTVTQGTDPVKTYYQYTPVSSKAMYDAYWNGKFRDVAFHSGFNEDLLVAEYQGQSSYLPQPPVNAPSG在一个具体实施方案中，通过使本发明的库接触靶标，并分离结合至所述靶标的一个或多个库成员来进行筛选。在另一具体实施方案中，在筛选中使所述库的独立成员与靶标接触，确定结合至所述靶标的所述库的成员。在另一具体实施方案中，使所述库的成员同时与靶标接触，选择结合至所述靶标的所述库的成员。所述靶标可为肽、蛋白质、多糖、脂质、DNA或RNA。所述靶标可为受体、受体配体、酶、激素或细胞因子。靶标配体可为原核生物蛋白、真核生物蛋白或古生菌蛋白(archeal protein)。更具体地，靶标配体可为哺乳动物蛋白或昆虫蛋白或细菌蛋白或真菌蛋白或病毒蛋白。靶标配体可为酶，如蛋白酶。应注意本发明也涵盖从本发明的筛选分离的库成员。适当地，本发明的筛选方法还包括如下步骤制造大量本发明的复合物，所述复合物由于能够结合至所述靶标而分离。本发明也涉及通过本发明的筛选分离或能够通过本发明的筛选分离的库成员，其中随后产生/制得所述成员而无需进一步使用编码所述多肽(其为本发明的复合物的部分)的核酸。例如，合适的本发明的方法进一步包括通过将分子骨架附接至多肽而制造通过本发明的方法分离或确定的大量多肽的另外的步骤，其中所述多肽被重组表达或化学合成。例如，当在该具体实施方案中多肽被重组合成时，最初将所述多肽编码为本发明的复合物的部分的核酸不再直接存在，但可在中间步骤(例如PCR放大或复合物的最初核酸的克隆)中存在，从而导致产生模板核酸，可在该另外的步骤中自所述模板核酸合成多肽。多肽配体可具有1、2或超过2个环。例如，结合至分子骨架的三环多肽可通过将双环多肽的N-和C-末端结合至根据本发明的分子骨架而产生。以此方式，结合的N和C末端产生第三环，从而制得三环多肽。该具体实施方案不适合在噬菌体上进行，但适合在本发明的多肽-分子骨架缀合物上进行。结合N-和C-末端为常规肽化学的问题。假使需要任何指导，C-末端可被活化和/或N-和C-末端可被延长，例如以将半胱氨酸加至每一端，然后通过二硫化物键合使它们结合。或者，所述结合可通过使用引入N/C末端的连接体区域而实现。或者，N和C末端可通过常规肽键结合。或者，可使用用于结合N和C末端的任何其他合适的方式，例如N-C-环化可通过标准技术完成，例如在Linde等人P印tide Science 90,671-682(2008) "Structure-activity relationship and metabolic stability studies of backbone cyclization and N-methylation of melanocortin peptides" 中，或在 Hess 等人 J.Med· Chem. 51，1(^6-1034 0008) "backbone cyclic peptidomimetic melanocortin-4receptor agonist as a novel orally administered drug lead for treating obesity”中所公开。这种三环分子的一个优点是避免了自由端的蛋白水解降解， 特别是通过外切蛋白酶作用。具有该性质的三环多肽的另一优点是所述第三环可用于通常适用的功能，如HSA结合、细胞进入或转导作用、标记或任何其他这种用途。应注意该第三环对于选择通常不可得(因为其不在噬菌体上制得，而仅在多肽-分子骨架缀合物上制得)，因此其用于其他这种生物功能的用途仍然有利地允许环1和2用于特异性的选择/产生。因此，本发明也涉及所述三环多肽及它们的制造和用途。本发明还提供了使基因编码的化合物库与靶标配体接触的方法以及确定结合至所述靶标配体的配体的方法。所述基因编码的化合物库通过筛选或选择程序进行试验。在筛选程序中，检验独立的库成员。例如使用靶标配体培养独立的库成员的多个复制体。在接触库成员之前或之后固定靶标配体，未结合的成员通过洗涤去除。结合配体例如在酶标法(ELISA)中检测。通过排序基因编码来确定结合至靶标配体的库成员的氨基酸序列。在选择程序中，使编码化合物库的多个成员与一个或多个靶标接触。在接触库成员之前或之后固定靶标，未结合的成员通过洗涤去除。排序结合配体的基因编码。或者繁殖所选的配体以进行进一步的选择回合。在本发明的一个具体实施方案中，化合物库通过噬菌体展示进行编码，且选择通过噬菌体淘洗进行。(iii)噬菌体提纯可使用用于提纯噬菌体的任何合适的方式。标准技术可应用于本发明。例如，噬菌体可通过过滤或通过沉淀(如PEG沉淀)进行提纯；噬菌体粒子可通过之前所述的聚乙二醇(PEG)沉淀制得和提纯。假使需要进一步的指导，可参考Jespers等人的(Protein Engineering Design and Selection 2004 17(10) :709-713. Selection of optical biosensors from chemisynthetic antibody libraries)。适当地，噬菌体可如本文所教导进行提纯。该公布的文本有关噬菌体的提纯方法特别地以引用方式并入本文；特别参考Jespers等人从起始部分直至第709页右栏的材料和方法部分。此外，噬菌体可如Marks等人的J. Mol. Biol第222卷，第581-597页所公布的那样进行提纯，该文章关于如何进行噬菌体制备/提纯的特定描述特别地以引用方式并入本文。假使需要任何进一步的指导，可如下还原和提纯噬菌体。大约切IO12噬菌体粒子与ImM 二硫苏糖醇(DTT)在室温下反应30分钟，然后进行PEG沉淀。在用水冲洗之后，将丸粒再悬浮于Iml反应缓冲液(IOmM磷酸盐缓冲液，ImMEDTA, pH 7. 8)中。然后噬菌体任选地与50μ1 1.6mM N_[(2_碘乙酰氧基)乙基]-N-甲氨基-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑(NBDIA) (Molecular Probes)在室温下反应2小时，或更适当地与本文描述的分子骨架反应。所述反应通过噬菌体粒子的PEG沉淀终止。可制备/提纯噬菌体的又一种方式教导于khreier和Cortese的(A fast and simple method for sequencing DNA cloned in the single-stranded bacteriophage M 13. Journal of molecular biology 129(1) :169-72,1979)中。该公布涉及 Sanger 等人 (1977)的链终止DNA排序程序，其需要单股DNA作为模板。M13噬菌体DNA作为单股存在， 因此在M13中克隆的每个DNA序列可易于以该形式获得。khreier和Cortese显示足够纯以用作序列确定的模板的M13单股DNA可通过噬菌体粒子的简单离心以及用苯酚提取而制得。khreier和Cortese公布的关于噬菌体的提纯方法特别地以引用方式并入本文。为了避免疑问，不进行苯酚提取以制备根据本发明的复合物，因为苯酚提取是用于核酸提纯的目的。因此适当地省略khreier和Cortese的苯酚步骤。仅遵循khreier和Cortese方法至提纯的噬菌体粒子的程度。因此存在用于噬菌体提纯的本领域公知的无数技术。在本发明的情况中，使用这种提纯以去除用于还原感兴趣的多肽中的反应基团(所述反应基团用于键合至分子骨架) 的还原剂，特别是当这种键合经由半胱氨酸残基时。任选地，可采用在如下反应化学部分中所讨论的用于噬菌体提纯的特别有利的技术。应特别注意，这些技术不被认为是本发明必要的，但可代表制备本发明的噬菌体粒子的特别有用的方法或甚至最佳模式。然而，假如注意到在附接分子骨架之前在去除还原剂的阶段避免在噬菌体上的经还原的官能团/反应基团的再氧化，则原则上可使用任意技术实现此目的。所描述的过滤技术特别有效，但也比标准技术更复杂，因此，操作者将选择最适于他们对本发明的特定操作的技术。最适当地，使用过滤技术。(iv)反应化学用于改性多肽的现有技术涉及苛刻的化学和独立的多肽改性反应。相比之下，本发明使用有利地保持产物的基因编码成分的功能和完整性的多肽改性的化学条件。具体而言，当基因编码成分为在编码多肽的噬菌体的表面上所展示的多肽时，化学有利地不危害噬菌体的生物完整性。本文公开了可提高或促进这些化学反应的条件的狭窄窗口。特别地， 如在下文更详细地解释，所用的溶剂和温度对于有效反应而言是重要的。此外，所用试剂的浓度也有助于促进正确的键合，同时改善或消除经改性的多肽部分的交联或损坏。特别地，公开了需要在靶标多肽中的半胱氨酸的还原以用于最有效的反应。显然， 必须去除用于化学还原那些半胱氨酸的还原剂以进行所需的附接。一种已知技术为使用二硫苏糖醇(DTT)或三羧乙基膦(TCEP)用于还原半胱氨酸，并用于去除还原剂以沉淀粒子， 如在沉淀反应中的噬菌体粒子。这种沉淀反应通常涉及20%聚乙二醇(PEG)以及2. 5摩尔 NaCl，其导致噬菌体粒子的沉淀。然而，重要的是避免再氧化。如将在下文更详细地公开， 在一系列策略中发现解决方案，包括使用脱气缓冲液、在反应混合物中使用螯合剂，以及使用过滤以提取粒子，或在TBMB的存在下使用低浓度的TCEP。应仔细选择反应条件，例如用于将分子骨架附接至靶标多肽的反应条件。条件的选择可取决于本发明的应用而变化。当靶标多肽由噬菌体粒子组成时，需要特别注意。在整个说明书和实施例部分提供了指导。应选择反应条件(如反应温度、分子骨架浓度、溶剂和/或pH)以允许靶标多肽的反应基团与分子骨架的有效反应，但将编码多肽的核酸留在允许解码(例如排序)和/ 或繁殖经分离的分子(例如通过PCR或通过噬菌体繁殖或任何其他合适的技术)的条件中。此外，反应条件应将噬菌体外壳蛋白质留在允许该噬菌体外壳蛋白质繁殖噬菌体的条件中。可在分子骨架附接之前用还原剂还原噬菌体编码的多肽的硫醇基团。在这种具体实施方案中，特别是在噬菌体展示具体实施方案中，或特别是当还原剂为TCEP时，过量的还原剂适当地通过过滤(例如噬菌体的过滤)去除。这是特别有利的，因为本发明人首次公开了用于去除还原剂的常规技术(如PEG/NaCl沉淀)可有时产生与分子骨架的次佳反应，可能是由于靶标多肽的经还原的侧官能团的再氧化。因此，通过还原以及之后经由过滤提纯(还原剂的去除)而制备靶标多肽的具体实施方案的优点在于，实现了多肽的经还原 (因此反应性)的反应基团的优良保存。在本发明中，应用如下反应条件所述反应条件在一方面允许将编码多肽有效连接至分子骨架，并在另一方面将附加的核酸(和噬菌体外壳蛋白质)留在允许其繁殖或解码的条件中。所述反应条件为例如反应温度、分子骨架浓度、溶剂组成或PH。在本发明的一个具体实施方案中，半胱氨酸残基的硫醇基团用作反应基团以将多肽连接至分子核。对于一些化学反应，多肽的硫醇基团需要被还原。通过添加还原剂(例如三(羧乙基)膦(TCEP))而有效地还原在噬菌体展示的多肽中的硫醇基团。由于过量的还原剂可妨碍附接反应，因此通过过滤噬菌体，或通过PEG沉淀而大量除去过量的还原剂， 尽管在附接反应过程中需要低浓度(10微摩尔或更低)以保持还原条件。在去除TCEP之后适当地通过反应缓冲液的脱气而防止硫醇基团的再氧化。也适当地通过金属离子经由螯合，例如与乙二胺四乙酸(EDTA)螯合形成络合物而防止硫醇基团的再氧化。最适当地，通过螯合以及使用脱气缓冲液而防止或抑制硫醇基团的再氧化。在本发明的一个具体实施方案中，将多肽附接至分子骨架通过如下实现使多肽的反应基团(如噬菌体编码多肽的硫醇基团)与分子骨架反应1小时。适当地，它们在30°C下反应。适当地，它们在10 μ M的浓度下与分子骨架(如三(溴甲基)苯)反应。适当地，反应在水性缓冲液中。适当地，反应在pH 8下。适当地，反应缓冲液含有乙腈。适当地，反应缓冲液含有20%乙腈。最适当地，反应的特征在于如上条件的两个或更多个。适当地，反应的特征在于如上条件的三个或更多个。适当地，反应的特征在于如上条件的四个或更多个。适当地，反应的特征在于如上条件的五个或更多个。适当地，反应的特征在于如上条件的六个或更多个。 适当地，反应的特征在于如上条件的每一个。优化这些反应条件以使多肽的硫醇基团与三(溴甲基)苯的反应基团定量反应。 在相同反应条件下，约20%的噬菌体粒子保持感染性以将基因编码带入细菌细胞中以用于繁殖和解码。在一个具体实施方案中，可通过如下将分子骨架(如TBMB)附接至靶标多肽(如噬菌体编码多肽)在30°C下，多肽的硫醇基团与在含有20%乙腈的水性缓冲液pH 8中浓度为10μ M的TBMB(即三(溴甲基)苯)反应(孵育)1小时。本发明人也公开了反应中的分子骨架浓度对噬菌体感染性的影响。特别地，本发明适当地使反应中所用的分子骨架浓度达到最小。换言之，在与噬菌体的多肽反应之时，所用的分子骨架的浓度越低，则分子骨架(总是假设其为足够的)与噬菌体多肽的结合越好。 以此方式使存在的分子骨架达到最少的优点是，在偶联分子骨架之后噬菌体感染性的优良保存。例如，当分子骨架为ΤΒΜΒ，大于100 μ M的分子骨架浓度可危害感染性。因此，适当地，当分子骨架为TBMB时，则适当地，在键合至多肽之时存在的TBMB浓度为100 μ M以下。(C)根据本发明的肽配体的用途根据本发明的方法选择的肽配体可用于活体内治疗和预防应用、活体外和活体内诊断应用、活体外试验和试剂应用等。通常，肽配体的用途可代替抗体的用途。根据本发明所选择的配体在Western分析和通过标准免疫组织化学程序的原位蛋白质检测中具有诊断用途；为了用于这些应用， 所选谱系的配体可根据本领域已知的技术进行标记。另外，当复合至色谱固定相(如树脂) 时，这种多肽配体可预备用于亲合力色谱程序中。所有这些技术是本领域技术人员公知的。 根据本发明的肽配体具有类似于抗体的结合能力，并可在这种试验中代替抗体。诊断用途包括通常设置抗体的任意用途，包括测试条试验、实验室试验和免疫诊断试验。根据本发明制得的肽配体的治疗和预防用途涉及将根据本发明所选的配体给药至受体哺乳动物，如人类。优选具有至少90至95%同质性的基本上纯的肽配体用于给药至哺乳动物，最优选98至99%或更高的同质性用于医药用途，特别是当所述哺乳动物为人类时。一旦如所需提纯、部分或达到同质，所选多肽可诊断地或治疗地(包括体外地)使用，或用于开发和进行试验程序、免疫荧光染色等(Lefkovite和Pernis，(1979和1981) Immunological Methods,第 I 禾口第 II 卷，Academic Press, NY)。本发明的肽配体通常在如下中具有用途预防、抑制或治疗炎症状态、变应性过敏症、癌症、细菌或病毒感染，以及自体免疫疾病(其包括但不限于I型糖尿病、多发性硬化症、风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、克罗恩病和重症肌无力)。在本申请中，术语“预防”涉及在引发疾病之前保护组合物的给药。“抑制”指在诱导事件之后，但在疾病的临床表现之前组合物的给药。“治疗，，涉及在疾病症候变得明显之后保护组合物的给药。可用于筛选肽配体抵御或治疗疾病的效力的动物模型体系是可得的。用于测试在易感小鼠中的全身性红斑狼疮(SLE)的方法是本领域已知的(Knight 等人(1978) J Exp. Med.，147 1653 ；Reinersten 等人(1978) New Eng. J :Med.，299 :515)。 通过使用来自另一物种的可溶性AchR蛋白质诱发疾病在S几/J雌性小鼠中测试重症肌无力(MG) (Lindstrom等人(1988)Adv. Inzn7unol. ,42 :233)。通过注射II型胶原而在易感小鼠品系中诱发关节炎(Stuart等人(1984)Ann. Rev. Immunol. ,42 :233)。通过注射分枝杆菌热应激蛋白而在易感大鼠中诱发佐剂性关节炎的模型已被描述(Van Eden等人(1988)Nature, 331 171)0通过如所述给药甲状腺球蛋白而在小鼠中诱发甲状腺炎(Maron等人 (1980)J. Exp. Med.，152 :1115)。胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)天然发生，或可在某些小鼠品系中诱发，如由Kanasawa等人(1984) Diabetologia, 27 :113描述的那些。在小鼠和大鼠中的EAE作为人类中的MS的模型。在该模型中，通过给药髓鞘碱性蛋白而诱发脱髓鞘疾 ^) ( #JAL Paterson (1986) Textbook of Immunopathology，Mischer 等人编辑，Grune and Stratton, New York,第 179-213 页；McFarIin 等人(1973) Science, 179 :478 ；和 Satoh 等人(1987) J ；Immunol.，138 :179)。通常，本发明的肽配体以提纯的形式与药物适当的载体一起使用。通常，这些载体包括水溶液或醇/水溶液、乳状液或悬浮体、包括盐水的任意载体和/或缓冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠和乳酸林格氏。如果需要将多肽复合物保持在悬浮体中，合适的生理可接受的赋形剂可选自增稠剂，如羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶和海藻酸盐。静脉注射载体包括流体和营养素补充剂和电解质补充剂，如基于林格氏葡萄糖的那些。防腐剂和其他添加剂，如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体也可存在(Mack(1982) Remington' s Pharmaceutical Sciences，第 16 片反)。本发明的多肽配体可用作单独给药的组合物或与其他试剂结合使用。这些其他试剂可包括抗体、抗体片段和各种免疫治疗药物，如环孢霉素、氨甲喋呤、阿霉素或顺钯， 以及抗毒素。药物组合物可包括各种细胞毒素或其他试剂与如下物质结合的“混合物 (cocktails)”:本发明的所选抗体、受体或其结合蛋白质，或甚至具有不同特异性的根据本发明的所选多肽的组合，如使用不同靶标配体选择的多肽，无论其是否在给药之前集合。根据本发明的药物组合物的给药途径可为本领域普通技术人员通常已知的任意给药途径。对于治疗(包括但不限于免疫疗法)，可根据标准技术将本发明的所选抗体、 受体或其结合蛋白质给药至任意患者。给药可通过任何适当的模式，包括非肠道地、静脉注射地、肌内注射地、腹腔内地、经皮地、经由肺部途径，或者适当地，通过使用导管直接注入。给药的剂量和频率取决于患者的年龄、性别和症状，其他药物的同时给药、非适应症 (counter-indications)和临床医生考虑的其他参数。本发明的多肽配体可被冻干以在使用之前储存和在合适的载体中重新组成。该技术已显示为有效的，并可使用本领域已知的冻干和重新组成技术。本领域技术人员将了解冻干和重新组成可导致不同程度的活性损失，且用量可能需要上调以补偿。可给药含有本发明的多肽配体或其混合物的组合物以用于预防和/或治疗处理。 在某些治疗应用中，将所选细胞的群体的实现至少部分抑制、抑制、调节、杀灭的足够量或一些其他可测量参数定义为“治疗有效剂量”。实现该剂量所需的含量将取决于疾病的严重性和患者自身免疫系统的一般状态，并通常为每千克体重0. 005至5. Omg所选肽配体，更通常使用0. 05至2. Omg/kg/剂量的剂量。对于预防应用，含有本发明的多肽配体或其混合物的组合物也可类似给药或略微较低剂量地给药。含有根据本发明的多肽配体的组合物可在预防和治疗环境中使用，以协助在哺乳动物中所选靶标细胞群体的改变、灭活、杀灭或去除。另外，所选的本文所述的多肽谱系可选择性地在体外或活体外使用以从细胞的异质集合杀灭、耗尽或有效去除靶标细胞群体。 根据标准技术，可将来自哺乳动物的血液与所选肽配体在体外组合，由此从血液杀灭或去除不希望的细胞以返还至哺乳动物。实施例在如下实施例中，本申请人描述第一谱系的肽配体的独立成员的改变；可使用类似的方法改变全部谱系。在一些情况中，有可能使用类似的化学和库格式以制备两个谱系。 因此，可根据本发明改变通过半胱氨酸残基与三溴甲基苯缀合的肽配体的第一谱系，以产生在类似条件下与三溴甲基均三甲苯缀合的相同的肽的第二谱系。此外，由于化学和反应条件适用于噬菌体展示，因此第一和第二谱系均可在噬菌体上展示和选择。然而，尽管类似于制备合成肽，但通过与其他骨架(例如通过骨架的碘乙酰基或丙烯酰基部分反应的那些骨架)缀合而进行的改变可能不适于噬菌体展示；如果不适于， 则必须使用不同的库格式。耐受更大范围的化学和更极端的反应条件的一种格式为合成肽阵列。作为参考，参见例如 Min&Mrksich. Current Opinion in Chemical Biology，第 8 卷， 第5期，2004年10月，第554-558页。如果所需的选择因素(因此库尺寸)不大，则该格式是特别便利的，因为可便利排列的肽的数目为数百或数千，而不是可通过噬菌体展示选择的数百万或数十亿。因此，其适用于改善榜样肽的性质，例如改进蛋白酶抗性或对靶标的结合亲和力。合成肽阵列也是用于与多个骨架物种反应的高度合适的格式；以此方式，相同组的多肽可与不同的骨架物种使用以增加第二谱系的结构多样性。合成肽的使用也高度适用于将肽的反应基团改变成不是在生物肽合成过程中通常引入的那些反应基团，例如，将半胱氨酸改变成高半胱氨酸。如果噬菌体展示可用于产生第一和第二谱系，不需要(或不便利)确定第一谱系的每个成员的序列以进行产生第二谱系所需的变化。然而，如果噬菌体展示用于第一谱系， 且合成肽阵列用于第二谱系，则需要确定第一谱系的多肽序列以指定第二谱系的那些多肽序列。在此情况中，编码每一个展示多肽缀合物的区域的噬菌体核酸可易于排序。参照如下实施例进一步描述本发明。实施例实施例1.利用MDM2的抗蛋白酶双环肽MDM2为识别p53 (肿瘤抑制剂)的反式激活结构域，从而导致p53被蛋白酶体泛素化和降解的酶(一种E3泛素连接酶)。p53-MDM2相互作用的nutlin抑制剂可导致p53 通路的活体内活化，已提出这种试剂可具有作为抗癌试剂的可能性。在本文，本申请人描述两个双环肽(PEP10和PEP48)对MDM2 (靶标“抗原”)的选择。每个合成肽的亲和力在 250-750nM 范围内。除非另外指出，方案通常遵循在Heinis等人，2009，Nature Chemical Biology 5， 502-507中早期描述的那些。在Heinis等人的工作中，两个靶标(激肽释放酶和组织蛋白酶G)均为蛋白酶，且激肽释放酶抑制剂相当抵抗由激肽释放酶所导致的蛋白水解，尽管其包含激肽释放酶分裂位点。MDM2不是蛋白酶，因此不清楚所选的肽是否也抗蛋白酶。由于该原因和其他原因(细节参见下文)，本申请人在噬菌体肽谱系与TBMB (包括在还原条件下)反应之后，以及在利用MDM2的谱系选择之前包括了一个或多个蛋白酶(糜蛋白酶)步骤。如噬菌体ELISA所示，两个所选的噬菌体肽PEP10和PEP48显示抗蛋白水解。噬菌体制备和提纯
制得多样性为至少虹109克隆的噬菌体肽库，并以一些修改如前所述缀合TBMB。1.使用如前所述的cx6噬菌体库(其由TGl细胞制得)感染非抑制剂品系 HB2151 (Carter，Bedouelle&ffinter. 1985. Nucleic Acids Res. 13 :4431-43)，并将感染细胞铺板。在约8ml hTY培养基、30ug/ml氯霉素、10%甘油(ν/ν)中从板上刮去细菌。2.将约0. 8ml的原液加入具有30ug/ml氯霉素的800ml hTY培养基中，以获得在 600nm约0. 1的0D。培养物在30°C下孵育，并在2升烧瓶中在200rpm下摇动16小时。3.细胞培养物在4°C下在4，OOOrpm(Heraeus Megafuge 2R)下离心30分钟。将上清液转移至200ml冷20% PEG, 2. 5M NaCL中。将混合物置于冰上1小时。4.沉淀的上清液/噬菌体混合物在4°C下旋转30分钟，丢弃上清液。5.将噬菌体再悬浮于:35ml PBS,5mM EDTA 中，然后在 4000rpm (Heraeus Megafuge 2R)下旋转15分钟以去除细胞碎屑。将上清液转移至新的50ml i^lcon管中。使用TBMB的噬菌体改性1.将5ml的8mM TCEP (在H2O中)加入噬菌体中以获得ImM TCEP的最终浓度。试管被颠倒数次以混合，并在42°C水浴中孵育1小时。2.通过第二次PEG沉淀去除TCEP。加入IOml的20% PEG, 2. 5MNaCL (脱气溶液)， 混合，在冰上孵育45分钟，并在4°C，4000rpm下旋转30分钟。3.小心去除上清液，将丸粒再悬浮于12ml PBS,5mM EDTA，IOuM TCEP (脱气缓冲液)中。4.将在乙腈中的:3ml 50uM TBMB加入12ml还原噬菌体中以获得IOuM的最终 TBMB浓度。试管被颠倒数次，并置于30°C水浴中1小时。噬菌体在冰上冷却，并用1/5体积的 20% PEG，2. 5M NaCL 沉淀 30 分钟。通过在 4000rpm(Hereaus Megafuge 2R)下旋转 20分钟而收集噬菌体。去除上清液，将噬菌体再悬浮于PBS中。将噬菌体转移至aiil Eppendorf管中，并在13000rpm(Eppendorf台式离心机)下旋转10分钟。将上清液转移至新的Eppendorf管中，测量噬菌体感染性。噬菌体选择通用方案第一回合的选择1.利用固定于链霉亲和素涂布的DynabeacKDynal Biotech)的表面上的生物素化MDM2(bio-MDM2)肽(res 2-125)来选择如上经提纯和化学缀合的噬菌体。首先洗涤 80 μ 1的珠子，并用在PBS(PBSM)中的2% (w/v)Marve 11奶粉封闭(block)40分钟，随后在 Iml总体积中用IOOnM bio_MDM2孵育20分钟。2.使用PBSM孵育化学改性的噬菌体(IOici-IO11TU) 40分钟。3.使用在PBS (PBST)中的0. 1 % Tween从过量的Ag中洗涤来自步骤1的封闭的 Ag-涂布的珠子，并在Iml总体积中用封闭的噬菌体孵育30分钟。4.未结合的噬菌体使用PBST洗涤10次，随后用PBS洗涤2次。在每个第三洗涤步骤之后，将噬菌体涂布的珠子转移至新的Eppendorf管中。5.通过在转轮上用500 μ 1的50mM甘氨酸pH 2. 2孵育10分钟而洗脱噬菌体。洗脱的噬菌体用250 μ 1的IM Tris, ρΗ7· 5中和。6.在无摇动下在37°C下用IOml的HB2151细胞孵育375 μ 1的噬菌体90分钟。7.然后在37°C下摇动感染细胞30分钟，随后将其在氯霉素板(20x20cm)上铺板。
8.在如上所述的hTY、氯霉素、10%甘油中从板上刮去菌落，在-80°C下将其储存为甘油原液。使用一部分细胞制备用于第二回合选择的噬菌体。第二回合的选择第二回合的选择类似于第一回合的选择，不同的是一些修改。1.使用亲和素涂布的磁珠代替链霉亲和素涂布的磁珠。2.在选择中所用的抗原量为20nM。3.化学改性的噬菌体(IOiciIxIOiciTU)首先用50ug/ml的糜蛋白酶处理2分钟，随后用PBSM封闭40分钟。4.未结合的噬菌体使用PBST洗涤15次，随后用PBS洗涤2次，其他方面如上所述。噬菌体选择变体方案使用如上所述的通用方案选择克隆48，而根据引入的修改方案发育克隆10。修改如下1.在第一回合中，化学改性的噬菌体用50ug/ml的糜蛋白酶预处理2分钟，随后用 PBSM封闭40分钟。2.在第二回合中，化学改性的噬菌体首先用5mM DTT还原20分钟，随后用50ug/ ml的糜蛋白酶孵育2分钟，并用PBSM封闭40分钟。肽合成来自噬菌体克隆48和噬菌体克隆10的编码肽使用自由N-和C-末端合成。PEPlO :H-Ser-Cys-Glu-Leu-Trp-Asn-Pro-Lys-Cys-Arg-Leu-Ser-Pro-Phe-Glu-Cys-Lys-Gly-0 H ； PEP48 H-Ser-Cys-Val-Arg-Phe-Gly-Trp-Thr-Cys-Asp-Asn-Ser-Trp-His—Gly-Cys—LyS-Gly-OH0以0. Immo 1的规模在CEM Liberty微波肽合成仪上利用Fmoc化学进行合成。 使用在DMF中的PyBOP和在NMP中的DIPEA(分别为1当量和2当量)活化使用5倍过量的Fmoc-氨基酸的Fmoc-Gly-PEG PS树脂。侧链保护基团如下=ArgO^bf)、Asn(Trt)、 Asp (OtBu)、Cys (Trt)、Glu (OtBu)、Lys (Boc)、Ser (tBu)、Thr (tBu)、Trp (Boc)。使用含有 0. IM HOBt的20 % ν/ν哌啶/DMF进行Fmoc-脱保护。H-肽基-树脂使用DMF洗涤，然后用丙-2-醇洗涤，并真空干燥。使用 94 2.5 2.5 1 v/v/v/vTFA/EDT/H20/iPr3SiH 2 小时实现侧链保护基团的分裂以及从载体(support)分裂。过滤肽/TFA混合物以去除载体，所述肽/TFA混合物用水稀释，并用K2O洗涤(5次)，将水性层冻干。在 Phenomenex Jupiter 5 μ C18 300Α 250x4. 6mm 柱上进行反相 HPLC。缓冲液 A :0. 1% TFA/H20 ；缓冲液B 含有10%缓冲液A的CH3CN。所述柱子用10%缓冲液B恒溶剂成分地洗脱2分钟，然后在25分钟内用10-90%的线性梯度恒溶剂成分地洗脱。检测在 215/230nm 处；流量为 1. 5ml/min。将肽冻干，并通过质谱检测。PEP 10MALDI-T0F质量(M+H) :2099. 9Da(理论 2098. 4Da. )PEP48MALDI-T0F 质量(M+H) :2043. 8Da(理论2042. 8Da.)。然后使所述肽与 TBMB缀合。TBMB-肽缀合物的合成进行初始反应以模拟在噬菌体选择过程中所用的条件。通常，将5mg经提纯的肽溶解于Iml水中，并加入0. 8ml 50mM NH4HCO3,随后加入足够的TCEP以使最终浓度达到IOm TCEP0将溶解于MeCN中的TBMB (以肽的重量计3当量)加入反应。反应静置1. 5小时，然后通过HPLC监测。当结束时，反应通过HPLC提纯。通常获得0.5至1.5mg的最终产物。 然而，该方法产生数个副产物，主要的一个副产物具有+250道尔顿的额外质量。这对应于 TCEP加成至所需产物，且该产物的产量随反应时间而增加。另外，通过MALDI-T0F质谱观察到对应于加成又一 TBMB的其他更高质量的产物，但并未分离所述产物。基于TCEP加合物的形成，发展了优选的方法。在从树脂分离肽之后，或者通过 HPLC直接提纯肽，或者在HPLC提纯之前用TCEP/DTT预处理肽15分钟。如上所述，使用 50mMNH4HC03 (4ml)和在MeCN中加入的TBMB中和在HPLC洗脱缓冲液中(通常6ml)的来自 HPLC提纯的产物。加入10% THF产生澄清溶液，因此加速了反应。反应通过质谱监测，但通常在1-2小时内结束。存在最低限度的来自该反应的副产物(尽管通过质谱观察到产物 +16的存在)。所述反应要求在HPLC提纯之前浓缩以去除有机溶剂，否则产物往往会用溶剂前沿洗脱。来自该方法的产物的产量通常为每3mg肽0.5至1.5mg，但这并未优化。结合试验噬菌体ELISA试验将O.eyg/mL的生物素化的MDM2肽(res 2_125)固定于链霉亲和素涂布的板 (Roche)上。使用PBSM(但在奶粉中4%)来封闭板，在室温下在所述板上孵育线性或 TBMB-缀合的噬菌体(在存在或不存在5mM DTT下在PBSM中107TU/孔)50分钟。类似地， 噬菌体首先在5mM DTT中还原20分钟，用糜蛋白酶(在PBS中50ug/ml)处理2分钟，与 PBSM (最终浓度)混合，并在室温下在所述板上孵育50分钟。使用anti-M13-HRP单克隆抗体(1 5000，Amersham)检测噬菌体。结果定量显示，噬菌体克隆10和克隆48均结合至MDM2作为环状缀合物而不是作为未缀合的肽(无论是否用DTT预处理)。此外，缀合肽的结合抗蛋白水解。应注意5mM DTT可还原糜蛋白酶的二硫键，从而导致其作为蛋白酶失活。为了确保糜蛋白酶在试验条件下为活性的，本申请人孵育了带有线性肽的对照噬菌体，所述线性肽在用5mM DTT如上进行预处理之后结合MDM2。在本申请人的实验条件下，当蛋白水解时，对照噬菌体的结合活性失去。在其他实验中，本申请人在PBS中在室温下在糜蛋白酶(0. lmg/ml-lmg/ml)的存在下使用高达0.2mM-5mM TCEP 2分钟。这些条件也允许本申请人区分噬菌体上的线性肽和环状肽。荧光各向异性测量在配备有通过实验室软件控制的Hamilton Microlab滴定仪的Horiki Jobin Yvon荧光计上运行滴定实验。所用的λεχ和Xem分别为和350nm。激发和发射的狭缝宽度为5nm和15nm，对于每个测量使用积分时间10s。使用肽10、48中的色氨酸的内荧光来测量它们对MDM2 (res 2-125)的结合亲和力。实验在PBS，5mM DTT中在23°C下进行。 通常，将250 μ 1的MDM2 (150微摩尔)滴定至1. 2ml的肽(1微摩尔)中。通过使用平衡Kd =[Α] [B]/[AB]的二次解用标准1 1结合模型分析滴定数据。Kd为解离速率，且[A]和 [B]分别指滴定剂(MDiC)和荧光肽10和48的浓度。拟合方程含有额外的项以解释线性漂移。结果(图2和下文)表示每个肽的亲和力为次微摩尔的，并在250-750nM范围内。重复对PEP48的测量。PEP 10+MDM2，测得 λ ex = 295nm, Kd = 267nM ；PEP48+MDM2，测得 λ ex = 280nm, Kd = 760nM ；PEP48+MDM2，测得 λ ex = 295nm, Kd = 567nM竞争试验PEP48噬菌体与MDM2的结合受到Kd = 3. 3nM的在p53位点结合至MDM2的肽 pMI (TSFAEYffNLLSP)的竞争(Pazgier 等人，2009 PNAS，106，4665-4670)。将 0. 6 μ g/ml 的生物素化的MDM2肽(res 2-125)固定至链霉亲和素涂布的板(Roche)上。用PBSM来封闭板。将TBMB-缀合的噬菌体(在1 % PBSM中IO7TU/孔)与一系列浓度的pDI (从6. 94nM至 IuM)预混，并在室温下在所述板上孵育75分钟。使用anti-M13-HRP单克隆抗体(1 5000， Amersham)检测噬菌体。通过添加pMI肽(估计IC50 = 125nM)来抑制PEP48噬菌体与 MDM2的结合。实施例2氧化HQ5-TBMB缀合物至其亚砜和砜如在Heinis 等人，2009，Nature Chemical Biology 5，502-507 中所述合成 HQ5-TBMB。将大约Img的HQ5-TBMB溶解于Iml的IxPBS中，将过氧化氢加至0. 3%的浓度。反应在室温下放置过夜。MALDI质谱显示对应于1、2和3个氧原子的加入的一系列峰， 但显示不完全的反应。反应调节至1 % H2O2并放置8小时，此时可见+3 (氧)产物为主要的，但反应仍然是不完全的。使用高达50W的功率，反应在微波合成器中加热，最初在冰上冷却直至37°C的温度。在15分钟之后，质谱基本上显示在1992处的单峰，其对应于3个氧原子的加入，并因此对应于亚砜。在这些条件下几乎没有加入另外的氧原子的迹象。HPLC 基本上显示单峰。比较氧化衍生物的抑制激肽释放酶的能力。酶购自Sigma Aldrich，底物购自 Bachem AG。试验缓冲液由 IOmM Tris pH 7.4、 150mM NaClUOmM MgCl2UmM CaCl2^O. 1% BSA,0. 01% Triton XlOO 禾口 5% DMSO 组成。在加入底物之前在RT下用抑制剂孵育酶30分钟。所有实验在30°C下记录90分钟。在exc/em 350/450nm波长处在BMG Pherastar酶标仪上进行试验。激肽释放酶作为1080yg/mL的溶液购得，并在试验缓冲液中稀释至0.3 nM的工作浓度。底物 Z-Phe-Arg-AMC在DMSO中以IOmM的原液浓度溶解，并用试验缓冲液稀释至300 μ M的工作浓度。抑制剂在试验缓冲液中溶解至60 μ M的原液浓度。将50 μ L的每个试剂引入孔中， 以获得150 μ L/孔的最终体积。在试验中激肽释放酶的最终浓度为0. InM,底物为100 μ Μ。抑制剂的最终浓度为0.5ηΜ、1ηΜ、&ιΜ、5ηΜ、8ηΜ、10ηΜ、20ηΜ、50ηΜ、80ηΜ、100ηΜ、 200nM、500nM、800nM、1 μ Μ、2 μ Μ、5 μ Μ、8 μ Μ、10 μ M 禾口 20 μ Μ。对于每个浓度的抑制剂，通过绘制荧光=f (时间)数据，并通过拟合线性趋势线而获得反应的初始速率。通过绘制初始速率=f([I])而获得抑制曲线，并可评价IC5tl值。在HQ5-TBMB以13nM的IC50抑制激肽释放酶的条件下，初步结果显示氧化的 PK15-TBMB以约2. 4 μ M的IC50抑制激肽释放酶。因此核与肽的附接的性质的改变对配体的亲和力具有显著影响。应注意，预期在三个位点处亚砜的形成产生受限肽(constrained peptide)的立体异构体，因为使用单个氧原子的氧化在硫原子处产生手性中心。所述立体异构体有可能不同在于它们与靶标的相互作用，因此IC50值为每个立体异构体的IC50值的平均。随后确立用于将缀合物氧化为砜的条件。将H(15-TBMB(%ig)溶解于Iml水中， 加入单过氧邻苯二甲酸镁(10当量，在0.5ml水中IOmg)。反应通过MALDI-TOF MS监测， 直至在45分钟内反应结束，然后通过HPLC提纯。产量1. 8mg,分子量测量值2038 (计算值 2038)。产物通过HPLC提纯。应注意在该情况中，硫不再是手性中心，因此预期单个分子物种。该氧化的HQ5-TBMB以1. 3微摩尔的IC50抑制激肽释放酶。预期硫的氧化改变了掩埋在硫周围的键角，以及在核周围的原子堆积。两种作用均导致结合亲和力的改变。实施例3三甲基均三甲苯和三乙基均三甲苯核的使用在与使用三(溴甲基)苯(Heinis等人，2009)先前描述的那些条件类似的条件下，使HQ5与三(溴甲基)均三甲苯缀合，并通过HPLC提纯。根据实施例1中所述的程序， 比较所述缀合物抑制激肽释放酶的能力。在HQ5-TBMB以13nM的IC50抑制激肽释放酶的条件下，初步结果显示六甲基苯缀合物以150nM的IC50抑制激肽释放酶。PK15也如上所述与三(溴乙基)均三甲苯缀合，这导致进一步的抑制损失，IC50为约400nM。因此核的性质的改变对配体的亲和力具有显著影响。在此情况中，三个甲基或乙基基团的额外体积有可能改变了核周围的堆积，并因此改变了结合亲和力。实施例4.基于碘乙酰基(IAc)和丙烯酰基(Acr)官能团的其他骨架核的使用。所有骨架前体结构示于表1中。然后用硫醇反应性官能团将它们改性以产生最终骨架，也如表1所示。骨架前体三羟甲基乙烷(用于THME(IAc3))、季戊四醇(用于PE(IAc4))、三乙醇胺(用于TEA(IAc3))、苯乙烯R-环氧化物(用于TPEA(IAc3))、三甲酰基苯基)胺(用于TPBA(IAc3))、水杨酰胺(T0HPT(IAc3))、氰脲酰氯和Boc-哌嗪(用于TPT(Acr3))获自 Sigma Aldricho使用微波辐射以获得提高的反应速率，通过苯乙烯R-环氧化物与氨在甲醇QM， Sigma)中的缩合而进行用于TPEA(IAciB)的前体的合成，如在!^avretto等人和Nugent等人(分别为 Tet. Let.，2002，43，2581-2584 ；和 J. Am. Chem. Soc.，1994，116，6142-6148)中所述。如所述使用快速柱色谱和TLC进行粗产物(R，R，R)-三(2-苯基)-乙醇胺的提纯。从市售醛(三(4-甲酰基苯基)胺，0. 1毫摩尔)，通过在20mL THF中用NaBH4还原 (在RT下1小时)，用ImL HAc (100% )淬灭，并用DCM/H20相提取而制得用于TPBA (IAc3) (三-(4-羟甲基苯基)胺)的前体。将所得三-(4-羟甲基苯基)胺保留在DCM溶液中以用于进一步改性(参见下文)。通过水杨酰胺在270°C下缩合3小时而获得前体三(邻-羟苯基)三嗪，如Johns 等人(J. Org. Chem.，1962，27 (2)，第 592-594 页)和 Cousin 等人(Bull. Soc. Chim. France 1914，(4)15,416)中所述。将黄色粗产物(3g)溶解于浓缩NaOH(aq)中，用稀硫酸沉淀。黄色沉淀通过离心收集，反复用H2O和KOH洗涤，然后用DCM洗涤，并干燥。然后将产物置入热DMF中，当冷却至-20°C时沉淀三(邻-羟苯基)三嗪作为小的暗黄色晶体簇。从氰脲酰氯和N-boc哌嗪制得用于TPT (Acrf)(三-(Boc-哌嗪)_1，3，5三嗪)的 Boc-保护的前体，如 Chouai 等人(J. Org. Chem.，2008，73 (6)，第 2357-2366 页)详述。使用6N HCl在MeOH中12小时而实现Boc去除。粗三-哌嗪-三嗪通过标准酸/碱提取，之后通过使用DCM/H20作为溶剂的相提取而进行提纯。
碘乙酰基和丙烯酰基基团为已确定的选择性硫醇-反应基团(Hermanson， Bioconjugate ^Techniques，第 2 版，Academic Press，2008)。使用这些基团的优点在于，它们不需要附近的芳族体系(如使用TBMB的情况即是如此)，因此扩大了可用于硫醇-反应性骨架的范围和化学空间。表1中的所有骨架前体含有羟基基团(或者在用于TPT(Acrf)的前体的情况中，
含有仲胺基团)。在羟基上引入碘乙酰基硫醇-反应性官能团通过如下两步法实现 OO
权利要求
1.一种改变第一多肽配体或第一组多肽配体的构象以制备第二多肽配体或第二组多肽配体的方法，每个多肽配体包含由共价连接至分子骨架的环序列分隔的至少两个反应基团，所述分子骨架与所述反应基团形成共价键，所述方法包括自多肽和所述第一配体或第一组配体的结构骨架组装所述第二配体或第二组配体，加上如下步骤之一(a)改变至少一个反应基团；或(b)改变所述分子骨架的性质；或(c):改变至少一个反应基团和所述分子骨架之间的键；或(d) (a)、(b)或(c)的任意组合。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述反应基团包含硫原子。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述反应基团为半胱氨酸或蛋氨酸。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述反应基团被改变为半胱氨酸、硒代半胱氨酸或蛋氨酸。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述经改变的分子骨架为不对称的。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述分子骨架包含两个或更多个骨架反应基团， 所述骨架反应基团能够与多肽上的反应基团形成共价键，且所述两个或更多个反应基团不相同。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述骨架反应基团之一为正交的。
8.根据如上权利要求任一项所述的方法，其中所述骨架反应基团选自苄基卤、α-卤代羧酸和丙烯酰基部分。
9.根据权利要求1所述的方法，其中在组装所述多肽和所述分子骨架之后，将分子骨架和多肽之间的至少一个键化学改性。
10.根据权利要求9所述的方法，其中将所述多肽和所述分子骨架之间的至少一个硫醚连接氧化以形成亚砜或砜。
11.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述第一组多肽变体为第一谱系的多肽变体。
12.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述第二组多肽变体为第二谱系的多肽变体。
13.—种自第一多肽配体产生一组或一个谱系的不同多肽配体的方法，所述第一多肽配体包含由共价连接至分子骨架的环序列分隔的至少两个反应基团，所述分子骨架与所述反应基团形成共价键，所述方法包括自多肽和所述第一配体或第一组配体的骨架组装一组或一个谱系的配体，并加上如下步骤之一a)改变至少一个反应基团；或b)改变所述分子骨架的性质；或c):改变至少一个反应基团和所述分子骨架之间的键；或d) (a)、(b)或(c)的任意组合；或e)结合(a)至(d)的任一步骤改变多肽序列。
14.一种增加第一谱系的多肽配体的构象多样性的方法，所述第一谱系的多肽配体包括多个多肽，所述多肽包含由共价连接至分子骨架的环序列分隔的至少两个反应基团，所述分子骨架与所述反应基团形成共价键，所述方法包括自多肽和所述第一谱系的骨架组装第二谱系的肽配体，加上如下步骤之一(a)改变至少一个反应基团；或(b)改变所述分子骨架的性质；或(c):改变至少一个反应基团和所述分子骨架之间的键；或(d) (a), (b)或(c)的任意组合，(e)结合(a)至(d)的任一步骤改变多肽序列。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述第二谱系自所述第一谱系的多肽和至少两个结构上不同的分子骨架物种组装。
16.一种提供多肽配体的方法，所述多肽配体包括在三个或更多个氨基酸残基处共价连接至分子骨架的多肽，所述方法包括如下步骤a.提供第一谱系的多肽；b.将所述多肽缀合至分子骨架以形成第一谱系的多肽缀合物，所述分子骨架在两个或更多个氨基酸残基处结合至所述多肽；c.筛选所述第一谱系以用于结合靶标，并选择结合至靶标的第一谱系成员；d.根据权利要求1，将另外的变化引入所述多肽配体，从而产生第二谱系的多肽缀合物；以及e.筛选所述第二谱系以改进结合至靶标。
17.一种用于选择具有增加的蛋白酶抗性的肽配体的方法，其包括如下步骤a.提供第一谱系的多肽；b.将所述多肽缀合至分子骨架以形成第一谱系的多肽缀合物，所述分子骨架在两个或更多个氨基酸残基处结合至所述多肽；c.筛选所述第一谱系以用于结合靶标，并选择结合至靶标的第一谱系成员；d.根据如上所述的本发明的第一方面，将另外的变化引入所述多肽配体，从而产生第二谱系的多肽缀合物；e.使所述第二谱系经受蛋白酶抗性选择；以及f.任选地，筛选所述第二谱系以用于结合至靶标。
18.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中一个或多个多肽组或多肽谱系由一个或多个核酸分子库编码。
19.根据权利要求1至18任一项所述的方法，其中所述谱系的筛选使用基因展示系统进行。
20.根据权利要求22所述的方法，其中所述基因展示系统为噬菌体展示。
21.通过根据前述权利要求任一项所述的方法制得的一个谱系的肽配体。
22.根据权利要求1至17任一项所述的方法，其中任意组或谱系由合成肽制得。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述第二组或第二谱系由合成肽制得。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述合成肽在固相上排列。
25.通过根据权利要求22至M任一项所述的方法制得的一组肽配体。
26.通过根据权利要求1至20任一项所述的方法制得的多肽缀合物，其包括含有至少两个反应基团的多肽，每一个所述反应基团由共价连接至分子骨架的环序列分隔，所述分子骨架包含与所述反应基团形成共价键的至少两个骨架反应基团，其中至少两个所述骨架反应基团不同。
27.根据权利要求沈所述的多肽配体，其具有3000道尔顿以下的分子量。
28.根据权利要求沈或权利要求27所述的多肽配体，其中掩埋在多肽至分子骨架的任意两个相邻附接点之间的多肽环的长度为0和9个氨基酸之间，且在所述附接点的第一个和最后一个之间的多肽序列的长度小于27个氨基酸。
全文摘要
本发明涉及一种改变第一谱系的多肽配体的构象多样性以制备第二谱系的多肽配体的方法，所述第一谱系的多肽配体包括多个多肽，所述多肽包含由共价连接至分子骨架的环序列分隔的至少两个反应基团，所述分子骨架与所述反应基团形成共价键，所述方法包括自多肽和所述第一谱系的结构骨架组装所述第二谱系，加上如下改变之一(a)改变至少一个反应基团；或(b)改变所述分子骨架的性质；或(c)改变至少一个反应基团和所述分子骨架之间的键；或(d)(a)、(b)或(c)的任意组合。
文档编号C12N15/10GK102471772SQ201080035488
公开日2012年5月23日 申请日期2010年8月12日 优先权日2009年8月12日
发明者C·埃尼, D·P·托伊费尔, D·洛克斯, E·伯纳德, P·G·温特 申请人:医疗研究局