使用磷脂酶制备蛋糕的方法和包含磷脂酶的制蛋糕面糊和蛋糕混合料组合物的制作方法

专利名称：使用磷脂酶制备蛋糕的方法和包含磷脂酶的制蛋糕面糊和蛋糕混合料组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用磷脂酶变体制备蛋糕的方法。
背景技术：
WO 98/26057公开了一种来自尖镰孢(Fusarium oxysporum)的脂肪酶/磷脂酶，及其在焙烤中的用途。Soragni等，2001，EMBO J. 20 =5079-5090公开了来自勃氏块菌(Tuber borchii)的磷脂酶(TbSPl)，及其编码基因的cDNA的核苷酸序列。WO 2004/097012 公开了一种来自镶片镰孢(Fusarium venentatum)的磷脂酶,及其编码基因的核酸序列。WO00/32758公开了具有磷脂酶和半乳脂肪酶活性的脂肪分解酶变体及其在焙烤中的用途。WO2008/025674公开了磷脂酶用于减少蛋糕中使用的蛋的量的用途。

发明内容
本发明涉及使用磷脂酶制备蛋糕的方法，其中所述磷脂酶在对应于SEQID NO 2的成熟多肽的位置 1、6、30、31、33、38、39、42、43、44、45、47、52、59、61、64、65、77、84、102、106、110、116、119或120的一个或多个位置包含改变，和/或磷脂酶N和/或C端的氨基酸延伸。在一个实施方案中，本发明提供了制备蛋糕的方法，包括a)制备包含蛋黄卵磷脂(egg yolk lecithin)和本发明的磷脂酶的制蛋糕面糊；b)焙烤所述制蛋糕面糊以制作蛋糕。所述磷脂酶可以以任何合适的方式应用于蛋糕的制备，包括，例如，将磷脂酶直接添加至制蛋糕面糊，将磷脂酶添加至用于制备制蛋糕面糊的成分(在制成制蛋糕面糊之前)，或处理与制蛋糕面糊分离的蛋糕成分如蛋黄、蛋黄卵磷脂或非蛋蛋白(non-eggprotein)，接着将经处理的成分包含在制蛋糕面糊中。所述磷脂酶亦可以包含一种或多种制蛋糕面糊成分的干混合料的形式施加。本发明还提供了与用于常规蛋糕配方中的蛋或蛋蛋白(egg protein)的量相比，使用减少量的蛋或蛋蛋白(例如蛋黄卵磷脂)制备蛋糕的方法。相应地，在另一个实施方案中，所述方法包括将制蛋糕面糊与本发明的磷脂酶相接触，其中所述制蛋糕面糊含有按重量计0. 3-1. 5%的蛋卵磷脂(egg lecithin)或按重量计5-25%的全蛋(whole egg)。在另一个实施方案中，本方法进一步包括将所述制蛋糕面糊与非蛋磷脂或蛋白源和本发明的磷脂酶的组合相接触。 在另一个实施方案中，本方法进一步包括将所述制蛋糕面糊与非蛋磷脂或蛋白源和本发明的磷脂酶的组合相接触，同时还在蛋糕配方中使用减少量的蛋或蛋蛋白。还在另一个实施方案中，本方法进一步包括将所述制蛋糕面糊与非蛋磷脂或蛋白源和本发明的磷脂酶的组合相接触，其中所述制蛋糕面糊含有按重量计0. 3-1. 5%的蛋卵磷脂或按重量计5-25%的全蛋。本发明还涉及包含本发明的磷脂酶的制蛋糕面糊组合物，以及涉及包含本发明的磷脂酶和一种或多种制蛋糕面糊成分的组合物干混合料。发明详述定义磷脂酶活性术语“磷脂酶活性”在本文中定义为催化脂肪酰基基团从磷脂释放的酶活性。磷脂酶亦可催化脂肪酰基基团从其他脂质的释放。就本发明而言，可在LEU测定法中通过水解大豆卵磷脂(来自大豆的L-a-磷脂酰胆碱，Sigma P5638)来确定磷脂酶活 性。将20g/L卵磷脂，3. 2mM脱氧胆酸钠，6. 4mM氯化钙的反应混合料在40°C进行的反应(2分钟)中维持在pH 8. O。磷脂酶活性表示为在释放的脂肪酸的中和过程中，相对于标样，维持恒定PH所需的滴定剂消耗率(0. IM NaOH)。变体术语“变体”在本文中定义为具有磷脂酶活性的多肽，其包含在一个或多个(几个)特定位置处一个或多个(几个)氨基酸残基的改变(取代、插入和/或缺失，或者N或C端延伸)。改变的多核苷酸是通过人为介入获得的，即修饰多核苷酸序列，例如SEQID NO :1中公开的多核苷酸序列；或其同源序列。所述变体亦可通过基因合成或任何其他适于获得编码所述变体磷脂酶的目标核酸序列的方法来制备。野生型酶术语“野生型”指由天然存在的微生物如在自然界中发现的细菌、酵母或丝状真菌表达的磷脂酶，且编码该野生型酶的核酸序列未经人为介入所改变。亲本酶术语“亲本(parent) ”用于本文中意指经受修饰例如取代、插入、缺失和/或截短以产生本发明酶变体的磷脂酶。该术语还指与变体比较和比对的多肽。所述亲本可为天然存在的(野生型)多肽或变体。举例而言，所述亲本多肽可为天然存在的多肽的氨基酸序列中经修饰或改变的变体。亲本亦可为等位变体，其为由任意的占据相同染色体基因座的基因的两种或更多种可选形式所编码的多肽。分离的术语“分离的”，如用于“分离的多肽”或“分离的磷脂酶变体”或“分离的多核苷酸”用于本文中指从来源(微生物)分离的多肽或变体。在一个方面，所述变体或多肽如通过SDS-PAGE确定，为至少I %纯，优选至少5%纯，更优选至少10%纯，更优选至少20%纯,更优选至少40%纯,更优选至少60%纯,甚至更优选至少80%纯,并且最优选至少90%纯。在一个方面，所述分离的多核苷酸如通过琼脂糖电泳确定，为至少1%纯，优选至少5%纯,更优选至少10%纯,更优选至少20%纯,更优选至少40%纯,更优选至少60%纯,甚至更优选至少80%纯，并且最优选至少90%纯，并且甚至最优选至少95%纯。基本上纯的术语“基本上纯的在本文中指多肽制备物，所述多肽制备物含有按重量计至多10%,优选至多8%,更优选至多6%,更优选至多5%,更优选至多4%,更优选至多3 %，甚至更优选至多2 %，最优选至多I %，并且甚至最优选至多0. 5%的与其天然或重组结合的(associated)的其它多肽材料。因此，优选所述基本上纯的变体或多肽是按存在于制备物中的全部多肽材料的重量计至少92%纯，优选至少94%纯，更优选至少95%纯，更优选至少96%纯,更优选至少96%纯,更优选至少97%纯,更优选至少98%纯,甚至更优选至少99 %，最优选至少99. 5 %纯，并且甚至最优选100 %纯。本发明的变体磷脂酶优选为基本上纯的形式。例如，这能够通过如下实现通过公知的重组方法或通过经典纯化方法制备所述变体磷脂酶。术语“基本上纯的多核苷酸”用于本文中指多核苷酸制备物，其不含其它外来的或不期望的核苷酸，并且处于适合在遗传工程多肽生产体系中使用的形式。因此，基本上纯的多核苷酸含有按重量计至多10%，优选至多8%，更优选至多6%，更优选至多5%，更优选至多4 %，更优选至多3 %，甚至更优选至多2 %，最优选至多I %，并且甚至最优选至多0.5%的与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。然而，基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻译区，如启动子和终止子。优选基本上纯的多核苷酸是按重量计至少90%纯,优选至少92%纯,更优选至少94%纯,更优选至少95%纯,更优选至少96%纯，更优选至少97%纯，甚至更优选至少98%纯，最优选至少99%，并且甚至最优选至少99. 5%纯的。本发明的多核苷酸优选为基本上纯的形式，即所述多核苷酸制备物基本上(essentially)不含与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或它们的任何组合。
成熟多肽术语“成熟多肽”在本文中定义为以其在翻译和任何翻译后修饰(如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等)之后的最终形式存在的具有磷脂酶活性的多肽。对于具体基因，成熟多肽可随着产生该多肽所使用的宿主的不同而不同。成熟多肽编码序列术语“成熟多肽编码序列”在本文中定义为编码具有磷脂酶活性的成熟多肽的核苷酸序列。同一性两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“同一性”来描述。就本发明而言，两个氨基酸序列之间的同一性程度使用如EMBOS S程序包(EMB0SS The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000, Trends inGenetics 16 :276-277 http: //emboss. orR)(优选版本 3. 0. 0 或更新的版本)的 Needle程序中执行的 Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48 443-453)来测定。使用的可选参数是缺口打开罚分为10，缺口延伸罚分为0.5，和EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比同一性并且是如下计算的(相同的残基X100)/(比对的长度-比对中的缺口总数)就本发明而言，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的同一性程度使用如EMBOS S程序包(EMB0S S The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000，见上http://emboss. orR)(优选版本3. 0. 0或更新的版本)的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch, 1970,见上)来测定。使用的可选参数是缺口打开罚分为10，缺口延伸罚分为0. 5，和EDNAFULL(NCBI NUC4. 4的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比同一性并且是如下计算的(相同的脱氧核糖核苷酸X100)/(比对的长度-比对中的缺口总数)同源序列术语“同源序列”在本文中定义为用勃氏块菌(Tuber borchii)磷脂酶A2 (SEQ ID NO :2),在 tfasty 检索(Pearson, W. R. , 1999,于 Bioinformatics Methods andProtocols, S. Misener 和 S. A. Krawetz 编，185-219 页)中给出小于 0. 001 的 E 值(或预期分数)的预测多肽。或者，术语“同源序列”用于本文中定义为与SEQ ID NO :1的成熟多肽编码序列，或者SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :2的成熟多肽具有至少75%，优选至少80%，更优选至少85%,更优选至少90%,更优选至少91 %,更优选至少92%,甚至更优选至少93 %，最优选至少94 %，并且甚至最优选至少95 %，如至少96 %，至少97 %，至少98 %，或甚至至少99%同一性的核苷酸序列/多肽序列。多肽片段术语“多肽片段”在本文定义为从成熟多肽或其同源序列的氨基和/或羧基末端缺失了一个或多个(几个)氨基酸的多肽；其中所述片段具有磷脂酶活性。在一个方面，片段含有成熟多肽或其同源序列的至少90个氨基酸残基，更优选至少100个氨基酸残基，并且最优选至少110个氨基酸残基。亚序列术语“亚序列(subsequence) ”在本文中定义为从成熟多肽编码序列或其同源序列的5'和/或3'端缺失了一个或多个(几个)核苷酸的多核苷酸序列；其中所述亚序列编码具有磷脂酶活性的多肽片段。等位变体(allelic variant):术语“等位变体”在本文中表示占据相同染色体基 因座的基因的任何两种或更多种可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种 群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。编码序列当用于本文时术语“编码序列”意指直接指定其多肽产物的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开读框确定，所述开读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子如GTG和TTG开始，并且以终止密码子如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成的或重组的多核苷酸。cDNA :术语“cDNA”在本文中定义为能够通过反转录从得自真核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体,其通过一系列的步骤加工然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。这些步骤包括通过称为剪接的过程去除内含子序列。因而源自mRNA的cDNA没有任何内含子序列。核酸构建体术语“核酸构建体”用于本文指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子分离自天然存在的基因，或将所述核酸分子以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式修饰以含有核酸的区段或所述核酸分子是合成的。当所述核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。调控序列(control sequence):术语“调控序列”在本文定义为包括编码本发明多肽的多核苷酸表达所必需的所有组分。各个调控序列对于编码所述多肽的多核苷酸可以是天然的或外源的，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的多核苷酸编码区的连接。可操作地连接术语“可操作地连接”在本文表示这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的适当位置，使得调控序列指导多肽编码序列的表达。表达术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
表达载体术语“表达载体”在本文定义为线性的或环状的DNA分子，其包含编码本发明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。宿主细胞如本文中所使用的术语“宿主细胞”包括任何细胞类型，所述细胞类型对于用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。改善的性质术语“改善的性质”在本文中定义为与变体磷脂酶相关的与亲本磷脂酶相比改善的特征。此类改善的性质包括但不限于，改变的温度依存性活性概貌(profile)、热稳定性、pH活性、pH稳定性、底物特异性、产物特异性和化学稳定性。用于测量这些性质的方法在本领域是公知的。热稳定性可例如通过示差扫描量热法(DSC)来测量。改善的产物特异性术语“改善的产物特异性”在本文中定义为相对于亲本显示改 变的产物概貌的变体磷脂酶，其中所述改变的产物概貌相对于亲本改善了所述变体在给定应用中的性能。术语“产物概貌”在本文中定义为由酶水解产生的反应产物的化学组成。在一个实施方案中，所述改善的产物特异性是当与亲本比较时，增加的针对蛋磷脂酰乙醇胺(PE)的活性对针对磷脂酰胆碱(PC)的活性的比值(即PE/PC比值)。蛋糕术语“蛋糕”在本文中定义为任何基于面粉和化学发酵的焙烤产物。术语“制蛋糕面糊”在本文中定义为混合和/或焙烤之前的蛋糕成分的综合。在制蛋糕面糊中，常规成分及其通常量(表示为按面糊重量计的％)为-蛋白，一般为蛋黄卵磷脂，例如以全蛋、蛋黄或蛋粉形式0.6-3%的蛋卵磷脂或10-50%的全蛋。-面粉(未处理的，经热处理的，氯化的)15-30%-淀粉(经修饰的，天然的)0-10%-糖15-25%-乳化剂(脂肪酸的甘油一酯和甘油二酯，脂肪酸的丙二醇酯，脂肪酸的甘油一酯和甘油二酯的乳酸酯，硬脂酰-2-乳酸钠(sodium stearoyl-2-lactylate)) :0. 1-1%-焙烤粉(含有苏打和酸或酸性盐(acidicsalt)) 0. 5-1%-水胶体(豆角胶，瓜尔胶，他拉胶，黄胞胶，角叉菜胶，阿拉伯胶，纤维素，改性纤维素，果胶)0-1%-植物脂肪(例如，油、人造黄油(margarine)、起酥油、脂肪糊(fatpaste)、脂肪粉(powdered fat)) 5~30%-水至100%改善的蛋糕性质改善的蛋糕性质包括改善的体积和质地(texture)性质,例如焙烤产物的粘聚性(cohesiveness)、弹性(springiness)和回弹(resiliency)。蛋糕的改善的体积可测量为不带模(tin)的蛋糕体积除以同一蛋糕通过本领域公知的菜籽顶替法(rape seed displacement method)测得的质量。比体积的单位为毫升每克。蛋糕的改善的质地可如Bourne M. C. (2002), 2ed. , Food Texture andViscosity Concept and Measurement, Academic Press 中所述进行测量。蛋糕的改善的粘聚性和弹性可如下所述进行测量以2mm/秒的变形速率和3秒的连续变形间等待时间进行用圆柱状探子(probe) (IOOmm)进行的圆柱状蛋糕瓤(cakecrumb)样品(45mm)的两个连续的变形,其中最大变形为产物初始高度的50%。将力作为时间的函数记录。粘聚性计算为第二变形曲线下面积(下降+上升)和第一变形曲线下面积(下降+上升)之间的比值。弹性计算为第二变形的降低的高 度与第一变形的降低的高度的比值，其中变形间等待时间为3秒。回弹计算为变形之后第一上升曲线下面积和第一下降曲线下面积之间的比值。蛋糕的改善的弹力(elasticity)可如下所述进行测量以2mm/秒的变形速度用圆柱状探子穿入蛋糕瓤直至总变形为样品起始高度的25%，并维持目标变形恒定20秒。将力作为时间的函数记录。弹力计算为在恒定变形20秒之后测得的力与为了获得目标变形而施加的力之间的比值(表示为百分比)。改善的蛋糕性质可通过将使用本发明的磷脂酶制备的蛋糕与在相同条件下(例如相同配方)但不用磷脂酶处理而制备的对照蛋糕相比较来确定。在另一个实施方案中，将所述磷脂酶变体用于在蛋糕配方中使用减少量的蛋时，获得商业上合适的蛋糕，如具有合适的体积、质地、粘聚性、弹性和弹力的蛋糕。当蛋糕配方中蛋的量减少时，所述蛋糕的性质(例如体积和质地，包括粘聚性、弹性和弹力)趋于变劣。本发明的变体磷脂酶可用于抵消该变劣，其通过将所述变体磷脂酶添加至制蛋糕面糊，优选地，与非蛋磷脂或蛋白源组合添加。相应地，变体磷脂酶可在蛋糕配方中的蛋的量减少时，如与常规蛋糕配方相比，用于蛋糕配方中的蛋的量(根据蛋卵磷脂或作为全蛋测量)减少了至少10 %,至少20 %，至少30 %，至少40 %，至少50 %，至少60 %，至少70 %，至少80%，至少90%，或至少95%时，产生商业上可接受的蛋糕性质。常规蛋糕配方一般使用按重量计0. 3-1. 5%的蛋卵磷脂或按重量计5-25%的全蛋。变体命名的惯例就本发明而言，将SEQ ID NO :2的成熟多肽中公开的磷脂酶的氨基酸序列用于确定在另一种磷脂酶(变体或亲本)中相应的氨基酸残基。就编号而言，SEQ ID N0:2的成熟多肽为SEQ ID NO 2的前肽的氨基酸91至210。SIGNALIP3. 0程序预测SEQ ID NO 2的氨基酸I至19为信号肽。就编号方式而言，成熟多肽的第一个氨基酸命名为编号或位置1，且相应地，依照本发明的磷脂酶变体，SEQ ID NO 2的成熟多肽(以及氨基酸编号方式)为SPASDTDRLL YSTSMPAFLT AKRNKNPGNL DffSDDGCSNS PDRPAGFNFLDSCKRHDFGY RNYKKQRRFT EPNRKRIDDN FKKDLYNECA KYSGLQSffKGVACRKIANTY YDAVRS FGffL将另一种磷脂酶的氨基酸序列与SEQ ID NO :2的成熟多肽中公开的磷脂酶比对，并基于该比对，可确定与公开于SEQ ID NO :2的成熟多肽中的磷脂酶的氨基酸序列中任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置号。多肽序列的比对可使用，例如，“ClustalWlThompson，J. D. , Higgins, D. G.和 Gibson, T. J. ,1994, CLUSTAL W!Improving the sensitivityof progressive multiple sequence alignment through sequence weighting,positions-specific gap penalties and weight matrix choice, Nucleic AcidsResearch 22 :4673-4680)得到。DNA序列的比对可以使用所述多肽比对作为模板，将氨基酸用来自所述DNA序列的对应密码子替代来进行。
通常使用的逐对序列比较算法(pairwisesequence comparison algorithm)足以检测出未分歧到少于大约20-30%序列同一性的多肽序列间的相似性(Doolittle,1992，Protein Sci. I 191-200 ；Brenner 等，1998，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95，6073-6078)。然而，具有相同折叠(fold)和相似生物学功能的、真正同源的多肽经常分歧到传统的基于序列的比较无法检测出其关系的程度(Lindahl and Elofsson, 2000, J. Mol.Biol. 295 :613-615)。在基于序列的搜索中较高的敏感度可使用采用多肽家族的概率表现(probabilistic representation)(序型)搜索数据库的搜索程序来获得。举例而言，PSI-BLAST程序通过迭代的(iterative)数据库搜索过程来产生序型，并能够检测出较远的同源物(Atschul 等，1997, Nucleic Acids Res. 25 :3389-3402)。当目标多肽的家族或超家族在蛋白质结构数据库中具有一个或多个(几个)代表时，甚至可达成更高的敏感度。程序如 GenTHREADER(Jones 1999，J. Mol. Biol. 287 :797-815 ；McGuffin 和 Jones, 2003,Bioinformatics 19:874-881)使用来自不同来源(PSI-BLAST、二级结构预测(secondarystructure prediction)、结构比对序型(structural alignment profile)以及溶解势(solvation potential))的信息作为预测所查询序列(query sequence)结构折叠(structural fold)的神经网络的输入。类似地,Gough 等，2000, J. Mol. Biol. 313 :903-919的方法可用于将未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型进行比对。这些比 对能够继而用于生成目标多肽的同源性模型，而这些模型可就其准确度使用多种为此目的开发的工具加以评价。对于已知结构的蛋白质，可获取数种工具和资源以供检索(retrieve)和生成结构比对。举例而言，已将SCOP超家族的蛋白质进行了结构比对，且这些比对是可获取并可下载的。两个或更多蛋白质结构可使用多种算法，如距离比对矩阵(distance alignmentmatrix)(Holm 和 Sander,1998, Proteins 33 :88-96)或组合延伸(combinatorialextension) (Shindyalov 和 Bourne, 1998, Protein Eng. 11 :739-747)进行比对，且这些算法的实施可另外用于寻求具有目标结构的结构数据库，以发现可能的结构同源物(例如Holm和Park, 2000, Bioinformatics 16 :566-567)。这些结构比对可用于在相同结构超家族内的蛋白质中预测结构和功能上对应的氨基酸残基。该信息，与来源于同源性建模与序型搜索的信息一同，可用于在将目标突变从一个蛋白质移到一个接近的或较远的蛋白质时预测哪个残基会突变。在描述本发明的不同磷脂酶变体时，为了参照方便起见，采用了下面所述的命名法。在所有情况下，使用得到认可的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。取代对于氨基酸取代，使用下述命名法:原始氨基酸，位置，取代的氨基酸，或者位置和取代的氨基酸。相应地，在位置52处用半胱氨酸取代丝氨酸命名为“Ser52Cys”或“S52C”，或者“52Cys”或“52C”。多重突变通过加法符号(“ +，，)分隔，例如“S52C+D84C”或“52C+84C”，代表在位置52和84处的突变分别为用半胱氨酸(C)取代丝氨酸(S)，和用半胱氨酸(C)取代天冬氨酸(D)。在一个位置处可选的取代可通过逗号辨别，例如Ser33Glu，Asp或S33E，D代表用谷氨酸(E) j天冬氨酸(D)取代丝氨酸(S)，亦可为33E，D。逾失对于氨基酸缺失，使用下述命名法原始氨基酸，位置*，或者简单地，位置*。相应地，在位置52处丝氨酸的缺失命名为“Ser52*”或“S52*”，或者“52*”。多重缺失通过加法符号(“ +，，)分隔，例如 “Ser52*+Asp84*” 或 “S52*+D84*”。
通入对于氨基酸插入，使用下述命名法原始氨基酸，位置，原始氨基酸，新插入的氨基酸，或者位置和新插入的氨基酸。相应地，在位置52处的丝氨酸之后的赖氨酸插入命名为“Ser52SerLys”或“S52SK”，或者，“52SerLys”或“52SK”。多个氨基酸的插入命名为[原始氨基酸，位置，原始氨基酸，新插入的氨基酸#1，新插入的氨基酸#2等，或者，位置和新插入的氨基酸#1，新插入的氨基酸#2等]。举例而言，在位置52处的丝氨酸之后赖氨酸和丙氨酸的插入表示为“Ser52SerLysAla”或“S52SKA”或“52SLK”。在此类情况下，插入的氨基酸残基通过将小写字母添加至插入的氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号来进行编号。因此，在上述实例中，序列会是
权利要求
1.一种制备蛋糕的方法，所述方法包括 a)制备包含蛋黄卵磷脂和亲本磷脂酶变体的制蛋糕面糊，其中所述变体磷脂酶在对应于 SEQ ID NO 2 的成熟多肽的位置 1、6、30、31、33、38、39、42、43、44、45、47、52、59、61、64、65、77、84、102、106、110、116、119或120的一个或多个位置包含改变，其中所述变体磷脂酶具有磷脂酶活性，并包含与SEQ ID NO 2的成熟多肽或SEQ ID NO 3的成熟多肽具有至少50%同一性的氨基酸序列；和 b)焙烤所述制蛋糕面糊以制作蛋糕。
2.权利要求I的方法，其中所述变体包含与SEQID NO 2的成熟多肽或SEQ ID NO 3的成熟多肽具有至少60%同一性，与SEQ ID NO 2的成熟多肽或SEQ ID NO 3的成熟多肽具有至少65%同一性，与SEQ ID NO :2的成熟多肽或SEQ ID NO :3的成熟多肽具有至少70%同一性，与SEQ ID NO :2的成熟多肽或SEQ ID NO :3的成熟多肽具有至少75%同一性，与SEQ ID NO :2的成熟多肽或SEQ ID NO :3的成熟多肽具有至少80%同一性，与SEQ IDNO :2的成熟多肽或SEQ ID NO :3的成熟多肽具有至少85%同一性，与SEQ ID NO:2的成熟多肽或SEQ ID NO 3的成熟多肽具有至少90%同一性，与SEQ ID NO 2的成熟多肽或SEQID NO 3的成熟多肽具有至少91%同一性，与SEQ ID NO 2的成熟多肽或SEQ ID NO 3的成熟多肽具有至少92%同一性，与SEQ ID NO 2的成熟多肽或SEQ ID NO 3的成熟多肽具有至少93%同一性，与SEQ ID NO :2的成熟多肽或SEQ ID NO :3的成熟多肽具有至少94%同一性，与SEQ ID NO :2的成熟多肽或SEQ ID NO :3的成熟多肽具有至少95%同一性，与SEQ ID NO :2的成熟多肽或SEQ ID NO :3的成熟多肽具有至少96%同一性，与SEQ ID NO:2的成熟多肽或SEQ ID NO 3的成熟多肽具有至少97%同一性，与SEQ ID NO 2的成熟多肽或SEQ ID NO :3的成熟多肽具有至少98%同一性，或与SEQ IDNO 2的成熟多肽或SEQID NO 3的成熟多肽具有至少99%同一性的氨基酸序列。
3.权利要求I的方法，其中所述亲本磷脂酶自真菌获得。
4.权利要求I的方法，其中所述亲本磷脂酶自块菌属(Tubeer)获得。
5.权利要求I的方法，其中所述亲本磷脂酶是自勃氏块菌(Tuberborchii)获得的磷脂酶。
6.权利要求I的方法，其中所述亲本磷脂酶是自白色块菌(Tuberalbidum)获得的磷脂酶。
7.权利要求I的方法，其中所述亲本磷脂酶包含SEQID NO 2的成熟多肽的氨基酸序列或SEQ ID NO :3的成熟多肽的氨基酸序列。
8.权利要求I的方法，其中所述面糊包含按重量计0.1-1. 5%的蛋卵磷脂或按重量计5-25%的全蛋。
9.权利要求I的方法，其中所述面糊包含非蛋蛋白。
10.权利要求9的方法，其中所述面糊包含按重量计至少0.5%的非蛋蛋白。
11.权利要求9的方法，其中所述面糊包含按重量计至少0.5-6. 0%的非蛋蛋白。
12.权利要求9的方法，其中所述非蛋蛋白选自下组小麦蛋白、酪蛋白、乳清蛋白、小麦谷蛋白和豆类蛋白。
13.权利要求I的方法，其中所述面糊包含非蛋磷脂。
14.权利要求9的方法，其中所述面糊包含按重量计0.3-1. 5%的蛋卵磷脂或按重量计5-25%的全蛋。
15.权利要求I的方法，其中所述磷脂酶以干混合料的形式添加至所述制蛋糕面糊。
16.权利要求I的方法，其中将所述磷脂酶添加至制蛋糕面糊的成分，然后添加至制蛋糕面糊。
17.一种包含亲本磷脂酶变体的制蛋糕面糊，其中所述变体磷脂酶在对应于SEQ IDNO 2 的成熟多肽的位置 1、6、30、31、33、38、39、42、43、44、45、47、52、59、61、64、65、77、84、·102、106、110、116、119或120的一个或多个位置包含改变，其中所述变体磷脂酶具有磷脂酶活性，并包含与SEQ ID NO 2的成熟多肽或SEQ ID NO 3的成熟多肽具有至少50%同一性的氨基酸序列。
18.一种制蛋糕面糊干混合料，其包含制蛋糕面糊成分和亲本磷脂酶变体，其中所述变体磷脂酶在对应于SEQ ID NO 2的成熟多肽的位置1、6、30、31、33、38、39、42、43、44、45、·47、52、59、61、64、65、77、84、102、106、110、116、119 或 120 的一个或多个位置包含改变，其中所述变体磷脂酶具有磷脂酶活性，并包含与SEQ ID NO 2的成熟多肽或SEQ ID NO 3的成熟多肽具有至少50%同一性的氨基酸序列。
全文摘要
本发明涉及使用磷脂酶变体制备蛋糕的方法，以及包含该磷脂酶变体的蛋糕和蛋糕混合料组合物。
文档编号C12N9/20GK102803480SQ201080035417
公开日2012年11月28日 申请日期2010年6月8日 优先权日2009年6月10日
发明者L.德玛利亚, J.文德, M.T.简森, I.范海森当克, G.范德比斯特 申请人:普拉托斯股份有限公司