含有虾青素的组合物的制备方法

专利名称：含有虾青素的组合物的制备方法
技术领域：
本发明涉及含有虾青素的组合物的制备方法。特别是涉及使含有3-羟基-3'， 4' - 二脱氢-β，Ψ-胡萝卜素-4-酮(HDCO)的含有虾青素的组合物中的HDCO相对于虾青素的相对量降低的方法。
背景技术：
虾青素是一种天然存在的类胡萝卜素，可作为改善养殖鱼的肉和皮肤颜色的饲料用添加剂广泛使用，同时，近年来作为功能性食品原材料备受关注。已知虾青素是通过属于法夫酵母属(Xanthophyllomyces)(原名红法夫酵母属(Phaffia))、短波单胞杆菌属(Brevundimonas)、红球藻属(Haematococcus)、衣藻属(Chlamydomonas)、单针藻属(Monoraphidium)、赤细菌属(Erythrobacter) > ff lif M (Agrobacterium)、副球菌属(Paracoccus)、盘蜷纲(Labyrinthulea)等的微生物的细胞生产的，此外还可以通过化学合成制备。3-羟基-3'，4' - 二脱氢_β，Ψ-胡萝卜素-4-酮(下文简称为HDC0)是类胡萝卜素中的一种，是可在虾青素生物合成体系中发现的副产物。由于HDCO的生物学功能未知，因此，在含有虾青素的组合物作为例如饲料、食品、食品添加剂或药物使用之时，优选所述组合物中的HDCO相对于虾青素的相对量较低。一方面，据报告，在希望通过突变改良法夫酵母属(Xanthophyllomyces)(原名 红法夫酵母属(PhafTia))的酵母而提高虾青素含量的情况下，随着虾青素含量升高，HDCO 相对于虾青素的相对量也有升高的倾向(专利文献1)。关于获得HDCO相对于虾青素的相对量低的含有虾青素的组合物的方法，专利文献1公开了从诱发偶然突变的法夫酵母属(Xanthophyllomyces)酵母株中获得同时实现高虾青素含量和低HDCO含量的突变株的方法，和由所述突变株获得含有虾青素的组合物的方法。专利文献1中记载了获得目标突变株的方法，从红色菌落(虾青素含量高，且具有相对于虾青素较高的HDCO含量)的固体物中，通过视觉选择强烈着色为桔色的菌落，所述桔色菌落虾青素含量高，且具有相对于虾青素较低的HDCO含量。然而，由于虾青素含量低的突变株等菌落的红色变弱，仅根据菌落颜色选择目标菌株是非常困难的，目标的实现受偶然性左右，并且需要大量的时间和劳动力。现有技术文献专利文献专利文献1 日本专利第3202018号公报

发明内容
发明要解决的问题实际上，本发明人考虑到，以提高虾青素含量为目的，对法夫酵母属(Xanthophyllomyces)进行突变改良的结果如下文所示，所获得的高虾青素含量菌株中的 HDCO的量，相对于虾青素都超过10%，获得如专利文献1的突变株的频率非常低。因此，本发明的目的是提供一种极为简单的方法，以减少含有HDCO的含有虾青素的组合物中HDCO 相对于虾青素的相对量。解决问题的方法本申请发明人为了解决上述问题，进行了深入的研究，结果发现将含有虾青素和 HDCO的组合物与pH 3以下的酸性介质和/或pH 9以上的碱性介质接触，使所述组合物中的HDCO相对于虾青素的相对量降低，从而完成了本发明。换言之，本申请发明涉及使含有虾青素和HDCO的组合物与pH 3以下的酸性介质和/或pH 9以上的碱性介质接触，使所述组合物中的HDCO相对于虾青素的相对量降低的方法。此外，涉及含有虾青素的组合物的制备方法，所述方法包括使含有虾青素和HDCO的组合物与PH 3以下的酸性介质和/或pH 9以上的碱性介质接触，使所述组合物中HDCO相对于虾青素的相对量降低的步骤。进一步的，涉及包含通过上述方法获得的含有虾青素的组合物的饲料、食品、食品添加剂及药物。发明的效果按照本申请发明，可以有效降低含有虾青素和HDCO的组合物中的HDCO相对于虾青素的相对量。HDCO相对于虾青素的相对量降低了的含有虾青素的组合物，可用作例如饲料、食品、食品添加剂或药物。发明的
具体实施例方式本申请发明中使用的含有虾青素和HDCO的组合物，只要含有这两种化合物即可， 对这些化合物以外的组成没有特别的限制，例如，可列举同时生产两种化合物的细胞培养液、培养上清液、细胞体和细胞体的破碎物、干燥物、提取物等，以及它们的部分纯化物等。 此外，只要含有HDC0，含有化学合成制备的虾青素的组合物也相当于本发明使用的含有虾青素和HDCO的组合物。同时生产两种化合物的细胞可列举属于例如法夫酵母属(Xanthophyllomyces) (原名红法夫酵母属(Phaffia))、短波单胞杆菌属(Brevundimonas)、红球藻属 (Haematococcus)、衣藻属(Chlamydomonas)、单针藻属(Monoraphidium)、赤细菌属(Erythrobacter)、农杆菌属(Agrobacterium)、副球菌属(Paracoccus)、盘蜷纲 (Labyrinthulea)等的微生物，其突变株、其基因重组菌株及其自身克隆株的细胞，但不限于此。 关于属于盘蜷纲(Labyrinthulea)的微生物，可列举例如属于破囊壶菌属 (Thraustochytrium)、裂殖壶菌属(Schizochytrium)禾口 Labyrinthula 属的微生物。用于本申请发明的酸性介质指在用玻璃电极法测定pH时，显示为pH 3以下、优选 2以下、更优选1以下、进一步优选0.5以下、更进一步优选0. 1以下的液体，例如通过将酸性物质溶解在适当的溶剂中而获得的。只要可获得本发明的效果，则对酸性物质没有特殊的限制，可列举例如氯化氢、硫酸、磷酸、硝酸等无机酸，甲酸、醋酸等有机酸，氯化氢和硫酸是特别优选的。可以单独使用这些酸性物质，也可以任意的组合使用。用于本发明的碱性介质指在用玻璃电极法测定pH时，显示为pH 9以上、优选10 以上、更优选11以上、进一步优选12以上、更进一步优选13以上、更进一步优选13. 5以上、更进一步优选13. 9以上的液体，例如通过将碱性物质溶解在适当的溶剂中而获得的。只要可获得本发明的效果，则对碱性物质没有特殊的限制，可列举例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化镁等碱金属或碱土金属的氢氧化物，氨水，胺类等，氢氧化钠是特别优选的。可以单独使用这些碱性物质，也可以任意的组合使用。只要可获得本发明的效果，则对溶解酸性物质和/或碱性物质的溶剂没有特殊的限制，可列举例如水、乙醇、丙酮、甲醇或其混合溶剂等，水是优选的。此外，在含有虾青素和 HDCO的组合物中所含的溶剂也可用作构成酸性介质和/或碱性介质的溶剂。在以上述方法进行测定的情况下，酸性介质显示为pH3以下、优选2以下、更优选 1以下、进一步优选0.5以下、更进一步优选0. 1以下，只要可以获得本发明的效果，也可以含有除上述酸性物质和溶剂以外的化合物。此外，在以上述方法测定的情况下，碱性介质显示为pH 9以上、优选10以上、更优选11以上、进一步优选12以上、更进一步优选13以上、 更进一步优选13. 5以上、更进一步优选13. 9以上，只要可以获得本发明的效果，也可以含有除上述碱性物质和溶剂以外的化合物。只要可以获得本发明的效果，关于对使含有虾青素和HDCO的组合物与酸性介质和/或碱性介质接触的步骤，其实施方法没有特殊的限制，例如可以将含有虾青素和HDCO 的组合物，和酸性介质和/或碱性介质装入合适的容器、反应罐等中，必要时通过混合来实施。此外，也可以在配管中实施混合。此时，适当调节所述混合物的温度是优选的。上限温度通常是140°C，优选100°C， 更优选90°C，进一步优选70°C。下限温度通常是_20°C，优选0°C，进一步优选10°C，更进一步优选30°C。超过上述的上限温度时，虾青素有趋于不稳定的倾向，在低于上述的下限温度时，有难以操作的倾向。此外，只要可以获得本发明的效果，对于使含有虾青素和HDCO的组合物与酸性介质或碱性介质接触的时间没有特殊的限制，上限时间通常是12000分钟，优选1200分钟，更优选300分钟。下限时间通常是1分钟，优选10分钟，更优选60分钟。对于含有虾青素和HDCO的组合物所接触的酸性介质和/或碱性介质的pH、接触时的温度、接触的时间，可以选择它们的任意组合，只要可以获得本发明的效果，则对所述组合没有特殊的限制。可以根据含有虾青素和HDCO的组合物形态、使用的酸性介质和/或碱性介质的种类、使用的酸性介质和/或碱性介质的PH，接触处理时的混合条件等，选择适当的组合。可以用HPLC分析所述组合物，根据在471nm的吸光度下检测获得的分析图表上的虾青素的峰面积和HDCO的峰面积，通过以下计算公式算出含有虾青素和HDCO的组合物中， HDCO相对于虾青素的相对量HDCO相对于虾青素的相对量(％ ) = (HDC0的峰面积/虾青素的峰面积)X 100上述HPLC分析可以通过如下实施，使用例如YMC Carotenoid (4. 6 X 250mm ；YMC 公司)作为柱子，将柱温设定为20°C，流动相使用A液甲醇/甲基-叔丁醚/1%磷酸水溶液=82/15/3，和B液甲醇/甲基-叔丁醚/水/磷酸=7/90/3/0. 03，样品注入后的 0-30分钟为A液100%, 30-90分钟为A液100%向B液100%的线性梯度，90-95分钟为B 液100%的条件，按1. Oml/分钟的流速进行通液。可以按照下述条件，使用HPLC对含有虾青素和HDCO的组合物进行分析，例如必要时将所述组合物溶解在恰当的溶剂中，注入HPLC装置中。溶解所述组合物的溶剂可以使用例如二甲基亚砜、丙酮、氯仿、二氯甲烷、甲醇或其任意组合而成的混合溶剂，但只要可以溶解所述组合物，就没有特别的限制。此外，在所述组合物含有具有虾青素生产能力的细胞培养液、细胞体或其破碎物等这些对上述溶剂呈现非溶解性的成分的情况下，可以例如通过将在上述溶剂中机械破碎所述组合物而获得的提取物注入HPLC装置中，再进行所述分析。 上述机械破碎的方法可列举例如使用玻璃珠的方法、压力破碎方法。本发明使用的含有虾青素和HDCO的组合物，只要含有这两种化合物即可，没有特别的限制，可列举例如以上述方法计算的HDCO相对于虾青素的相对量优选在1 %以上，更优选在5%以上的组合物。从最大限度发挥本发明的效果的观点出发，更优选HDCO相对于虾青素的相对量在10%以上，特别优选在15%以上。如上所述，在改良法夫酵母属(Xanthophyllomyces)(原名红法夫酵母属 (Phaffia))的微生物以提高虾青素含量的情况下，HDCO相对于虾青素的相对量也有提高的趋势。因而，本发明中使用的含有虾青素和HDCO的组合物优选虾青素含量在2000μ g/ g干细胞以上的法夫酵母属(Xanthophyllomyces)微生物的细胞，或者从该细胞中获得的含有虾青素的组合物。更优选的是虾青素含量在3000 μ g/g干细胞以上，进一步优选的是虾青素含量在5000 μ g/g干细胞以上，更进一步优选虾青素含量在8000 μ g/g干细胞以上，特别优选虾青素含量在10000 μ g/g干细胞以上的法夫酵母属(Xanthophyllomyces) 的微生物的细胞，或者从所述细胞中获得的含有虾青素的组合物。在这些法夫酵母属 (Xanthophyllomyces)的微生物中，或者在从所述微生物中获得的含有虾青素的组合物中， HDCO相对于虾青素的相对量优选在10%以上，更优选在15%以上。在本发明中，在使HDCO相对于虾青素的相对量减少的步骤，S卩，在使其接触酸性介质和/或碱性介质的步骤的前后，以上述方法计算的HDCO相对于虾青素的相对量(％ ) 通常减少0. 1百分点(pp)以上，优选0. 5pp以上，更优选Ipp以上，进一步优选2pp以上， 更进一步优选3pp以上，更进一步优选4pp以上，更进一步优选5pp以上。减少1个百分点 (PP)以上是指按照(处理前的组合物中HDCO相对于虾青素的相对量(％))_(处理后的组合物中 HDCO相对于虾青素的相对量(％ ))计算的数值是1以上。根据本发明制备的、HDCO相对于虾青素的相对量降低了的含有虾青素的组合物， 在必要时将酸性介质和/或碱性介质中和后，视情况而定以常规的操作与其分离，在必要时进行清洗，可以将其用作能够作为饲料、食品、食品添加剂或药物的含有虾青素的组合物。此外，也可将上述获得的组合物进一步纯化后，用于上述用途。上述的常规操作可以按照下述方法实施，例如存在可以溶解本申请发明组合物、 且可以与酸性介质和/或碱性介质相分离的溶剂的情况下，通过将本申请发明的组合物溶解在该溶剂中，将组合物溶解于该溶剂中得到的溶液与酸性介质和/或碱性介质分离后进行水洗，并将该溶剂蒸馏除去，所述本申请发明的组合物使HDCO相对于虾青素的相对量降低了的组合物。此外，在没有可以溶解所述组合物的溶剂的情况下，上述常规操作可以按照下述实施，通过例如连续离心分离或过滤等操作，将所述组合物与酸性介质和/或碱性介质分离，必要时进行水洗。但是，上述的常规操作并不限于此。可以进一步加工如此获得的含有虾青素的组合物，成为适合作为饲料、食品、食品添加剂或药物的制品形式，所述制品也包含在本发明中。在本申请发明中，所述饲料指给予例如鱼、甲壳类、贝类等水产动物，鸡、鹌鹑、鸭等家禽类，牛、猪、羊等畜牧动物，狗、猫等宠物等的饲料或添加剂等，但并不限于此。此外， 在本申请发明中，所述食品除主食以外，还包括着色剂、添加剂等，但并不限于此。如上所述，根据本申请发明，可以有效的降低含有虾青素和HDCO的组合物中的 HDCO相对于虾青素的相对量，可以从含有虾青素和HDCO的组合物，有效的获得适合作为饲料、食品、食品添加剂、药物等使用的、混入更少HDCO的含有虾青素的组合物。
实施例下文通过实施例对本申请发明做以更具体的说明，但不是将本申请发明的范围限定于此。[用于分析虾青素和HDCO的提取方法]在含有虾青素和HDCO的组合物是例如微生物菌体等的情况下，获得含有虾青素和HDCO的提取物的方法可以利用使用玻璃珠的机械破碎方法。通过该方法获得的含有虾青素和HDCO的提取物可提供至使用了 HPLC装置的分析。将所述组合物装入可以密封的1. 5ml容积的塑料制容器中，通过离心分离获得沉淀。将沉淀水洗后，通过再次的离心分离去除上清液。向获得的沉淀中加入Ig玻璃珠(直径0.5mm)、lml丙酮，用Multi Beads shocker (安井器械公司制造)处理。然后，通过过滤器过滤(- 7毛少^ 7 7 ^义夕一 S，0.45 μ m，Millipore公司生产)去除固体和玻璃珠后，可以获得提取出虾青素、HDCO的丙酮溶液。此外，Multi Beads shocker对所述组合物的破碎是重复30秒破碎和30秒冷却 (4°C )各5次，分析时使用确认已充分破裂的所述组合物。[虾青素生产菌中的HDCO的相对量]用N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(NTG)将红发夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)NBRC 101 菌株(由独立行政法人制品评价技术基础机构生物遗传资源部门，〒四2-0818千叶县木更津市KAZUSA镰足2_5_8获得)进行诱变处理后，挑选琼脂平板上红色强的菌落，获得虾青素含量提高的突变株。对所获得的突变株重复进行同样的操作，获得虾青素含量进一步提高的突变株。如此获得虾青素含量提高的突变株红发夫酵母 (Xanthophyllomyces dendrorhous) KNK-Ol 株、KNK_02_1 株、ΚΝΚ-02-2 株和 KNK-O3 株。所获得突变株的虾青素含量和HDCO相对于虾青素的相对量如表1所示。如下进行突变株的培养。在500ml容积的坂口烧瓶中加入30ml培养基(磷酸铵1. 3 %、磷酸钾 0.7(%、琥珀酸0.6(%、酵母提取物0.3(%、？!1 5. 4)，用高压灭菌锅进行灭菌。接种虾青素生产菌株，在20°C振荡培养180小时。在培养开始时，添加0. 3g葡萄糖，之后每12小时补充 0. 3g葡萄糖。[表 1]
权利要求
1.含有虾青素的组合物的制造方法，该方法包括下述步骤使含有虾青素和3-羟基-3’，4’_ 二脱氢-β，Ψ-胡萝卜素-4-酮(HDCO)的组合物与ρΗ 3以下的酸性介质和/ 或PH 9以上的碱性介质接触，从而使所述组合物中的HDCO相对于虾青素的相对量降低。
2.权利要求1所述的方法，其中，所述含有虾青素和HDCO的组合物选自具有虾青素生产能力的细胞、细胞的一部分、细胞提取物、和/或它们的部分纯化物。
3.权利要求2所述的方法，其中，所述具有虾青素生产能力的细胞为属于法夫酵母属 (Xanthophy 1 lomyces)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、红球藻属(Haematococcus)、衣藻属(Chlamydomonas)、单针藻属(Monoraphidium)、赤细菌属(Erythrobacter) > ^kffliiM (Agrobacterium)、副球菌属(Paracoccus)、盘蜷纲(Labyrinthulea)的微生物的细胞。
4.权利要求2所述的方法，其中，所述具有虾青素生产能力的细胞为属于法夫酵母属 (Xanthophyllomyces)的微生物。
5.权利要求4所述的方法，其中，所述属于法夫酵母属(Xanthophyllomyces)的微生物的虾青素含量为2000 μ g/g干细胞以上。
6.权利要求1 5中任一项所述的方法，其中，所述含有虾青素和HDCO的组合物中的 HDCO相对于虾青素的相对量为1 %以上。
7.权利要求1 6中任一项所述的方法，其中，所述酸性介质的ρΗ为2以下。
8.权利要求1 6中任一项所述的方法，其中，所述碱性介质的ρΗ为10以上。
9.权利要求1 8中任一项所述的方法，其中，在与酸性介质和/或碱性介质接触后， HDCO相对于虾青素的相对量降低0. 1 %以上。
10.饲料、食品、食品添加剂或药物，其包含通过权利要求1 9中任一项所述的方法获得的含有虾青素的组合物。
全文摘要
本发明涉及通过使含有虾青素和3-羟基-3′，4′-二脱氢-β，Ψ-胡萝卜素-4-酮(HDCO)的组合物与pH 3以下的酸性介质和/或pH 9以上的碱性介质接触，使所述组合物中的HDCO相对于虾青素的相对量降低的方法；并且涉及含有虾青素的组合物的制备方法，所述制备方法包括通过上述相对量降低方法以降低HDCO的相对量的步骤，根据本发明，可以以简单的方法降低包含在含有虾青素的组合物中的生物学功能未知的HDCO的相对量。
文档编号A23L1/30GK102471795SQ20108003542
公开日2012年5月23日 申请日期2010年8月11日 优先权日2009年8月11日
发明者井上博晶, 木崎宪之, 难波弘宪 申请人:株式会社钟化