自浣熊分离犬细小病毒-2相关病毒的制作方法

专利名称：自浣熊分离犬细小病毒-2相关病毒的制作方法
自浣熊分离犬细小病毒-2相关病毒序列表
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发明背景 发明领域。本发明总体上涉及针对犬细小病毒类似病毒(canine parvovirus-like virus)的改良疫苗。具体而言，本发明提供适于幼犬的疫苗，所述疫苗基于分离自浣熊的新型细小 病毒。
背景技术：
犬细小病毒(CPV)主要是感染狗、尤其是幼年狗的肠道病原体。细小病毒在狗和大于4-5周龄的幼犬中的感染特征为急性腹泻、发热和白细胞减少症；在更小的幼犬中的感染特征为心肌病。在未接种疫苗的狗中，该病的死亡率极高。尽管可得到针对CPV的疫苗，但因为CPV是单链DNA病毒并具有极强的变异能力，所以该病毒显示出改变其抗原性的显著的能力(Parrish和Kawaoka 2005),从而逃避由疫苗所提供的免疫保护。因此,持续监测流行病毒的抗原型和基因型并相应地调整疫苗组分很有必要。新生幼犬通过其母亲哺乳来获得抵抗疾病例如CPV感染的免疫力，尤其是在生下来后的头两天。哺乳的幼犬摄入最早产生的乳汁即初乳，初乳中的抗体传给幼犬。对于狗以及很多其它哺乳动物，初乳所给予的免疫力在大约第五周龄时失去其影响。给幼犬接种疫苗时的一个特殊挑战是根据提供保护的时间范围给予疫苗，此时间范围要与母体抗体提供保护的时间重叠并要始于母体抗体衰弱。当前，幼犬的疫苗方案通常从约6周龄开始,此后约每3周加强免疫(booster) —次,例如在9、12和15周。然而，为使本方案提供充分保护，首次疫苗剂量必须能立刻引起保护性免疫应答。由于幼犬免疫系统的不成熟和产生免疫应答必需的时间周期，这完全是不切实际的。充分保护通常要直到给予整个疫苗接种过程后才能发挥。CPV导致的基于年龄的死亡率示于

图1，其显示CPV导致的最大死亡率发生在疫苗方案完成之前。简单的答案可能是在甚至更早例如在2-3周时开始疫苗接种程序。然而，这将是无效的，因为对于幼犬，其母亲已经接种过疫苗或以其它方式暴露于具有相同抗原决定簇的病毒株，传给幼犬的母体抗体将会中和疫苗中的病毒，从而阻止幼犬自身免疫系统对病毒的应答。兽医学中另一个挑战是癌症的治疗,例如狗的癌症治疗。用于癌症治疗现有工具有很多局限，尤其是对老年狗。给予溶瘤细小病毒来杀死癌细胞，作为有效的癌症治疗显不巨大前景(Rommelaere 等，<9 & Growth Factor Reviews 21:185-195，2010 ;和Rommelaere等的美国专利号7，179，456，其全部内容通过引用并入本文)，并可能应用于犬类。然而，针对细小病毒的已有抗体的存在(例如由于接种疫苗)将致使这种方法失效，因为细小病毒会被既有抗体中和。另外，目前很少进行狗的基因治疗，但如果确定了合适的核酸载体，这将是用于治疗数种病症的有前景的方法。迄今为止，现有技术无法提供对这些问题的解决方法。发明概述
本发明基于新型细小病毒(分离自美国的浣熊)的发现。核苷酸和氨基酸序列分析表明，所述病毒代表犬细小病毒2型(CPV-2)的一个独特变异株。这种命名为“AR08071304” (本文也称为浣熊细小病毒、“RPV”、“08071304”和“细小病毒-2 (浣熊)”等)的新型CPV-2可用作针对犬细小病毒的疫苗的组分。具体而言，所述变异株可用作针对非常幼小的狗(例如仍处于哺乳期或正在断奶过程中的幼犬)的疫苗组分，因此解决了如何提供适当的幼犬疫苗方案的问题。该浣熊细小病毒不会被狗中既有犬细小病毒-2抗体完全中和。另外，由于受体或宿主生物例如狗中已有抗体中和作用的缺失，该浣熊细小病 毒可用作基因治疗的溶瘤剂和载体(vector)(载体(carrier)、溶媒)。所述病毒变异株与目前流行的主要CPV-2病毒有相近的同源性。因此，给予含有所述新变异株的疫苗可能导致也提供针对已知流行CPV-2病毒的保护的免疫应答。然而，新分离株(isolate)与可能已暴露于母亲狗的(例如通过疫苗制剂或先前CPV暴露)已知的CPV-2病毒之间有一些抗原性差异。具体而言，变异株衣壳蛋白VP-2的第232位氨基酸残基是Thr (由ACA编码)，第300位氨基酸残基是Asp (由GAT编码)。这些序列上的差异足以导致变异株独有的免疫反应概况(profile)。因此，当将新型病毒作为疫苗给予幼犬时，传给幼犬的母体抗体(例如来自先前接种过/已被暴露的母亲)不大可能完全使其失活。因此，幼犬自身免疫系统的免疫应答将会经由免疫接种在暴露于本发明RPV时而被引发，且免疫应答可能对目前流行的CPV普遍有广泛的保护性。此外，该浣熊细小病毒似乎是食肉动物细小病毒的天然嵌合体。虽然编码RPV VP-2蛋白的核苷酸序列与犬细小病毒-2a (CPV-15)具有最高的总同源性得分(3309)，但它与猫泛白细胞减少症(felinepanleukopaenia)病毒、早先分离的综熊细小病毒和水紹肠炎病毒(mink enteritisvirus)也有很高的同源性。这类嵌合序列先前并未在犬或猫细小病毒序列中观测到，但现在相似的细小病毒似乎在美国的浣熊种群中流行(参见以下实施例部分)。这种RPV将为数种食肉动物物种提供广泛的免疫保护，因此适于用作广谱细小病毒疫苗。在罕见的不同寻常的情况下，狗或猫可能死于感染异源非减毒食肉动物的活细小病毒；然而，本文所述使用本发明RPV的好处远远超过这个最小风险。虽然本发明不以任何进化模型或理论为前提，但对本文公开的遗传数据的一个有趣解释是，本发明的RPV可能代表当今犬和猫细小病毒的祖先。病毒学界关于狗细小病毒-2的起源一直有争论，在该理论范围内，本发明的RPV应是犬细小病毒-2的“活化石”。不管怎样，本文所述RPV编码一种独特的VP-2蛋白，该蛋白包含猫和犬细小病毒氨基酸序列的嵌合体。因此，本发明的RPV是猫和犬细小病毒二者“祖先”的候选者，即这些后面出现的食肉动物细小病毒起源于这种RPV。或者，本发明的RPV可能代表细小病毒进化“交叉点”的嵌合中间体。不管怎样，这种RPV提供针对异源细小病毒的交叉免疫的途径，否则用更多物种中的任一种-特化的犬和猫细小病毒，目前不能获得所述交叉免疫途径。此外，本发明的RPV微弱地凝集猪红细胞(转铁蛋白)；不共享一些关键性表位(例如VP-2蛋白序列的第300位氨基酸残基)；和在猫肾脏细胞系中生长不好(参见以下实施例)。总之，这些标志与在时间上居先的病毒相一致，或是犬和猫细小病毒进化级联的早期中间体。
本发明提供包含ATCC编号PTA-11400的细小病毒_2 (浣熊)特征的细小病毒。另夕卜，本发明提供包含细小病毒的疫苗，所述细小病毒包含具ATCC编号PTA-11400的细小病毒-2 (浣熊)的特征。在一个实施方案中，所述疫苗进一步包含选自以下的一种或多种抗原组分犬瘟热病毒(CDV)、犬腺病毒2型、犬副流感病毒、犬冠状病毒、犬疱疹病毒、犬轮状病毒、钩端螺旋体H印tospira)的一种或多种血清变型和其中VP-2蛋白的第232位氨基酸不是Thr及VP-2蛋白的第300位氨基酸不是Asp的犬细小病毒_2。在一些实施方案中，所述钩端螺旋体的一种或多种血清变型选自以下问号钩端螺旋体犬型血清型interrogans serovar、问号钩端螺旋体黄痕出血型 {Leptospira interrogans serovar icteroAaefflorrAagiae)、问号钩端螺方定体波莫那型血清型^Leptospira interrogans serovar pomona)和基氏钩端螺旋体感冒伤寒型血清型{Leptospira kirschneri serovar grippotyphosa)。本发明亦提供包含核苷酸序列SEQ ID NO: I或SEQ ID NO: I的部分的分离核酸；其中SEQ ID NO: I的部分编码包含以下氨基酸残基的VP-2蛋白的抗原区SEQ ID NO: 3的第232位氨基酸残基、SEQ ID NO: 3的第300位氨基酸残基或SEQ ID NO: 3的第232位氨基酸残基和第300位氨基酸残基两者。在其它实施方案中，本发明提供包含该核酸的免疫原性组合物，其中所述核酸存在于杀死的或减毒的细小病毒颗粒或低代数浣熊细小病毒(RPV)中。在一些实施方案中，所述杀死的细小病毒颗粒包含具ATCC编号PTA-11400的细小病毒-2 (浣熊)的特征。在其它实施方案中，所述减毒的细小病毒颗粒存在于适于舌上溶解的固态载体中。在又其它实施方案中，免疫原性组合物适于皮下给予。本发明亦提供引发动物抵抗细小病毒感染的免疫应答的方法。所述方法包括将包含核酸的免疫原性组合物给予动物的步骤，所述核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO: I或SEQ ID NO: I的部分；其中所述SEQ ID NO: I的部分编码包含以下氨基酸残基的VP-2蛋白的抗原区SEQ ID NO: 3的第232位氨基酸残基、SEQ ID NO: 3的第300位氨基酸残基或SEQ ID NO: 3的第232位氨基酸残基和第300位氨基酸残基二者。在一些实施方案中，所述核酸存在于杀死的或减毒的细小病毒颗粒中或者存在于被杀死的或减毒的细小病毒颗粒中的低代数RPV中。在一些实施方案中，所述被杀死的细小病毒颗粒包含具ATCC编号PTA-11400的细小病毒_2(浣熊)的特征。在一些实施方案中，所述减毒的细小病毒颗粒存在于适于舌上溶解的固态载体中，并且在一些实施方案中，所述动物是幼犬。在其它实施方案中，所述免疫原性组合物适于皮下给予。本发明进一步提供基本上纯化的细小病毒VP-2蛋白或其抗原性片段，所述蛋白第232位氨基酸为苏氨酸残基，第300位氨基酸为天冬氨酸残基；其中所述抗原性片段至少包含所述VP-2蛋白的部分，所述部分具有在第232位氨基酸的苏氨酸残基；或在第300位氨基酸的天冬氨酸残基；或在第232位氨基酸的苏氨酸残基和第300位氨基酸的天冬氨酸残基二者。在一些实施方案中，所述基本上纯化的细小病毒VP-2蛋白包含氨基酸序列SEQID NO: 3。本发明亦提供包含编码SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 3的部分的氨基酸序列的核苷酸序列的表达载体；其中所述SEQ ID NO: 3的部分是包含以下氨基酸残基的VP-2蛋白的抗原性区域SEQ ID NO: 3的第232位氨基酸残基、SEQ ID NO: 3的第300位氨基酸残基或SEQ ID NO: 3的第232位氨基酸残基和第300位氨基酸残基两者。在一些实施方案中，所述表达载体是重组病毒表达载体。在其它实施方案中，所述重组病毒表达载体是金丝雀痘病毒表达载体。本发明亦提供杀死哺乳动物中肿瘤细胞的方法。该方法包括将包含足以感染和杀死哺乳动物中所述肿瘤细胞的量的细小病毒的组合物给予哺乳动物的步骤，其中细小病毒包含ATCC编号PTA-11400的细小病毒-2 (浣熊)的特征。在一些实施方案中，所述哺乳动物是对于犬细小病毒-2血清反应阳性的狗。在其它实施方案中，所述方法通过选自静脉内和瘤内的给药途径来实施。在又其它实施方案中，所述细小病毒是低代数的细小病毒。图I. CPV-2基因型分布和就狗年龄而言的CPV感染致死案例数量。图2A和B.编码新型AR08071304 CPV-2变异株的VP-2蛋白的核酸序列。A，核苷酸序列(SEQ ID NO: I)的较长形式，其编码含599个氨基酸的蛋白质。位于第1753-1755 位核苷酸的内部终止密码子以粗体和下划线表示。B，核苷酸序列(SEQ ID NO: I)的较短形式，其编码含584个氨基酸的蛋白质。在A和B两者中，编码第232位(核苷酸第694-696位)Thr的核苷酸和编码第300位(核苷酸第898-900位)Asp的核苷酸都带下划线。图3A和B.新型AR08071304 CPV-2变异株的VP-2蛋白的氨基酸序列。A. (SEQID NO: 3)为全部599个编码氨基酸均被翻译的较长形式的蛋白质；B，(SEQ ID NO: 4)为在终止密码子处发生终止的较短形式的蛋白质。两种蛋白质中分别为Thr和Asp的第232和300位氨基酸均加框。图4A-C.以下的示意图A，浣熊细小病毒(RPV) DNA ；B, RPV开放阅读框排列；C，RPV与真核细胞的结合。图5A和B. A，浣熊细小病毒与细胞表面转铁蛋白受体(TFR)结合的示意图；B，制备自主性细小病毒载体的一般策略的不意图。图6.新近分尚的淀熊细小病毒与其它类似病毒的关联性。图7.新近分离的浣熊细小病毒的VP-2蛋白中处于关键表位的氨基酸。图8.比较新近分离的浣熊细小病毒的VP-2蛋白与其它食肉动物细小病毒的VP-2蛋白的系统发育树。CPV =犬细小病毒；RPV =浣熊细小病毒；FPV =猫细小病毒；PV=细小病毒；MEV =水貂肠炎病毒；FPL =猫泛白细胞减少症病毒；Aleu =阿留申水貂病细小病毒(Aleutian mink disease parvovirus) ；MVC =犬微小病毒(minute virus ofcanine)。详述
本发明提供包含分离自受感染浣熊的新型细小病毒变异株的减毒形式的疫苗和病毒治疗制剂。虽然所述疫苗制剂适于给予各种各样的食肉动物(例如狗、猫、水貂、浣熊及犬科(canidae)、综熊科(procyonidea)、融科(mustelidae)和灵猫科(viveridae)成员等)，但其特别可用于给予很年幼的狗(幼犬)。这是因为新型变异株与现有疫苗中所用的CPV变异株迥异，以致使母体抗体(对给予疫苗的应答而产生并在哺乳期传给幼犬)不大可能识别和灭活病毒。同样地，对包括成年狗在内的狗中的其它应用(例如作为癌症治疗和作为基因治疗载体)，RPV将避开来自早先疫苗接种的先前存在的抗体，因此逃避即时的免疫清除。要注意的是，在浣熊分离株的VP-2蛋白中，第232位氨基酸残基是Thr (由ACA编码)，而第300位残基是Asp (由GAT编码)。因此，RPV中这两个氨基酸残基与其它所有已知CPV分离株的VP-2蛋白的所述氨基酸残基完全不同，这可能是造成该RPV的独特特性(例如抗体反应性，参见以下实施例)的原因。由于减毒，病毒不会导致疫苗受体患病。另一方面，新型分离株与当前流行的病毒足够相似(例如VP-2蛋白的氨基酸序列一致性为约99%)，换言之，将所述病毒给予年幼动物很可能会导致抗体的产生，至少其中一些抗体会与已知流行病毒交叉反应，从而为接种疫苗的年幼动物提供抵抗那些病毒的保护作用。本文所述核酸序列(SEQ ID NO: I)包含在1753-1755位核苷酸的内部终止密码子(见图2A)。因此，由此翻译的VP-2蛋白有两种不同形式。一种形式如图3A (SEQ ID NO3)所示，由终止密码子的通读(“读漏(leakiness)”)造成，因此比图3B所示的终止于终止密码子的第二种形式更长(599个氨基酸)。所述蛋白的第二种形式只包含584个氨基酸(SEQ ID NO: 4)。第一种形式，即VP-2的较长形式，终止密码子未被翻译而被“跳过”，导致产生599个氨基酸的蛋白质。本文所用术语“VP-2”蛋白既包括VP-2的第一种较长形式，也包括VP-2的第二种较短形式，在本发明实践中，两种形式的蛋白质都可能被使用。这两种形式的蛋白质可用蛋白质印迹检测。另外，在本发明实践中，可使用两种核酸序列(SEQID N0S: I和2)，例如，序列之一或两者都可用于疫苗制剂、用于载体等。在一些实施方案中，氨基酸序列SEQ ID NO: 3由核苷酸序列SEQ ID NO: I编码。在其它实施方案中，氨基酸序列SEQ ID NO: 4由SEQ ID NO: 2编码。在本发明又其它实施方案中，可通过终止密码子的消除(缺失)(例如通过基因工程)来修饰SEQ ID NO: 1，以便由此翻译氨基酸序列SEQ ID NO: 3。这种新型RPV也可充当其它动物和人感染的适当加强免疫的模型。例如，基于可利用的信息，在人流感(HlNl)中，疫苗应答视已有抗体的存在而变化。如果人具有已有抗体，效价不会上升但抗体亲和性会增加。如果人不具有已有效价，那么这个人会形成中和保护性免疫的应答。所述新型分离株于2010年10月7日以俄克拉荷马州立大学的名义作为细小病毒-2 (浣熊)保藏在弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(2010年10月12日收到ATCC的收到确认)，指定ATCC保藏号PTA-11400。本发明亦提供包含ATCC保藏号PTA-11400特征的分离的细小病毒及其后代。本发明进一步包括包含于2010年10月7日保藏的ATCC保藏号PTA-11400特征的杀死的或减毒的细小病毒及减毒的细小病毒的后代， 以及包含上述病毒的疫苗和免疫原性组合物。本发明亦提供在伊利诺州分离并在CRFK中繁殖的其它RPV。(10071199-A和10071199-C)，其部分序列在实施例部分给出。因此，本发明亦包括在美国(例如在阿肯色州和伊利诺州)流行的浣熊细小病毒，其共同特征在于它们不与犬细小病毒单克隆抗体(MoAb) 3B10反应，MoAb最常用于诊断。3B10特异针对VP-2的第300位氨基酸，其通常为甘氨酸。因此，这些RPV的VP-2在第300位氨基酸具有突变，所述突变包括在该MoAb足迹之内并阻止MoAb识别所述蛋白。另外，这些病毒与其它食肉动物细小病毒-2的VP-2具有约98%的同源性。然而，可以完全确认，即使只是关键位点的少量突变也可对病毒特性产生巨大影响(例如参见Qu等2005，其中阐述了冠状病毒刺突蛋白两个关键氨基酸残基的突变改变了其向性)。该病毒(例如参见实施例I和5)的系统发育研究表明该RPV [细小病毒-2 (浣熊)]与犬CPV-2亲缘很近，事实上可能是犬CPV-2的变异株。照此而论，家养的成年狗也可能对所述病毒敏感，并可能受益于接受包括该变异株的疫苗。由于浣熊的行为特征，将新近分离自浣熊的细小病毒传播到家养宠物例如狗和其它野生动物有可能发生。例如，浣熊智力高，很快适应新的食物来源。它们是杂食性的，视季节和可获得性而定，以各种各样的植物和动物为食。由于它们对城市地区的迅速融入和适应，浣熊通常与家养狗和猫相互交流并亲密接触。浣熊有出色的领悟能力，能容易地学习，例如打开容器，找出和打开储存的动物性食品等。由于这种行为，它们可能能够将细小病毒传播给家养食肉动物。浣熊也与其它野生动物例如臭鼬相互交流，因此也有种间相互交流和传播细小病毒的可能性。因此，成年狗和其它家养宠物将受益于接受包括本文所述浣熊病毒的疫苗，即使它们以前接种过另一细小病毒疫苗；而其它物种无论家养与否，也将受益于接受所述疫苗。益处是双重的1)接种疫苗将提供对感染这种特定CPV的免疫力；和2)这种CPV与其它细小病毒足够相似(例如与其它食肉动物细小病毒约99%的同源性)，接种疫苗也将可能引发和加强至少一些针对其它细小病毒的免疫力。在一些实施方案中，本发明的疫苗和免疫原性组合物本质上是单价的，即包含单一药剂，其为本文所述细小病毒分离株(例如带有细小病毒-2 (浣熊)的特征，其为于 2010年10月7日保藏的ATCC保藏号PTA-11400)，或本文所述分离株的减毒或杀死的形式，或这些中任一种的后代。在其它实施方案中，所述疫苗和免疫原性组合物是多价的，即它们包含多种抗原剂，其中一种是本发明的分离株。多价组合物的示例性另外成分包括但不限于以下的一种或多种犬瘟热病毒(CDV);犬腺病毒2型；犬副流感病毒；犬冠状病毒；犬疱疹病毒；犬轮状病毒；一种或多种钩端螺旋体血清变型；和其VP-2基因序列不同的犬细小病毒-2，即其VP-2蛋白第232位氨基酸不是ThrJP /或VP-2蛋白第300位氨基酸不是Asp,或其中编码VP-2蛋白第232位氨基酸Thr的密码子不是ACA，和/或编码VP-2蛋白第300位氨基酸Asp的密码子不是GAT。示例性的CDV包括但不限于作为US2010/0196420发布的美国专利申请12/696,983 (Kapil)所述的⑶V，其全部内容通过引用并入本文。示例性的钩端螺旋体血清变型包括但不限于问号钩端螺旋体犬型血清型、问号钩端螺旋体黄疸出血型血清型、问号钩端螺旋体波莫那型血清型和基氏钩端螺旋体感冒伤寒型血清型。此夕卜，本发明分离株可能与多种不同抗原联合，例如那些已知多价疫苗，例如Galaxy DA2PPV或 Nobivac DA2PPv + L4 等。在特定实施方案中，本发明疫苗的受体是幼年动物(例如幼犬)，给予的方式是经由“幼犬棒棒糖”。用于将疫苗组合物给予年幼狗(或其它物种的幼体)的幼犬棒棒糖，在Kapil等于2010年7月15日提交的同时待审PCT申请号PCT/US2010/042142中有详细描述，其全部内容通过引用并入本文。简言之，幼犬棒棒糖或类似装置用于将疫苗递送到舌头的背侧，即舌上。具体而言，疫苗制剂以将疫苗递送到舌基底细胞或邻近舌基底细胞的方式来给予。基底细胞受疫苗中的减毒细小病毒感染，建立抗原库(例如病毒贮库)，抗原库在幼犬中逐渐地、随时间推移从非常年幼时开始释放减毒细小病毒。这种方法利用了舌头是相对免疫免除的(缺乏免疫应答)的事实。例如，疫苗可能包括在手握“幼犬棒棒糖”中，其由照料者舌上给予，例如通过手持已放入幼犬口内的附着有固体疫苗制剂的棍、线或其它递送溶媒来给予。固体制剂包括固体惰性载体；且细小病毒分散或遍布于固体载体中，通过幼犬先天性吸吮反应逐渐溶解载体，并将细小病毒释放到舌。在一个实施方案中，本发明包含具以下核苷酸序列的核酸和包含所述核酸的疫苗编码RPV的VP-2蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列例如在SEQ ID NO: I或者SEQ IDNO: 2 (参见图2A和B)中所展示；或编码足以引发疫苗受体产生对RPV的免疫应答的抗原区或表位的核苷酸序列的部分。具体而言，所述核酸序列将包括编码VP-2蛋白的第232位和第300位的密码子中的一个或两个。这些密码子分别为ACA和GAT，分别编码Thr和Asp。在另一个实施方案中，本发明包含具以下核苷酸序列的核酸和包含所述核酸的疫苗编码VP-2蛋白的核苷酸序列，所述VP-2蛋白包含如SEQ ID NO: 3 (或者，包含在SEQ IDNO: 3之内的SEQ ID NO: 4，参见图3A和B)所展示的氨基酸序列，或如SEQ ID NO: 3所展示的氨基酸序列的部分，其包括足以引发疫苗受体对抗原区或表位产生免疫应答的抗原域或表位。具体而言，所述蛋白或其部分将包括RPV VP-2蛋白的分别为Thr和Asp的第232位和第300位氨基酸残基中的一个或两个。本发明亦包括如本文所述的所述序列的变体和/或衍生物，和包括变体和/或衍生物的疫苗制剂。例如，本领域技术人员可认识到，由于遗传密码的冗余，可利用非SEQ ID NO: I的序列来编码SEQ ID NO: 3所展示的氨基酸序列。另外，尽管SEQ ID NO: I所展示的核苷酸序列代表单链(ss)DNA，但本发明亦包括基于、来源于或互补于这些序列的相应的双链(ds) DNA、互补DNA和任何形式的RNA (例如mRNA、·RNA/DNA杂交链等)。所述序列既可能是有义序列也可能是反义序列。另外，只要序列编码分别为Thr和Asp的第232位和第300位氨基酸残基中的一个或两个，以下序列亦预期用于所述疫苗中显示出与SEQ ID NO: I至少约50%的同源性的序列，优选约60%，更优选约70、80或90%的同源性，甚至约95、96、97、98、99%或更高的同源性的序列。所述序列可能因例如在一个或多个位置含有编码同一氨基酸的替代密码子而不同。另外，亦预期编码AR08071304 VP_2蛋白抗原区或表位的这些序列的部分。具体而言，预期包括编码分别为Thr和Asp的第232位和第300位氨基酸残基中的一个或两个的密码子的核苷酸序列。在一个实施方案中，编码第232位Thr氨基酸残基的密码子是ACA，编码第300位Asp残基的密码子是GAT。另外，亦包括编码表现出与SEQ ID NO: 3有70%或更优选约80、90或95%或甚至更高的同一性(例如96、97、98或99%的同一性)的氨基酸序列的序列，只要所述序列编码分别为Thr和Asp的第232位和第300位氨基酸残基中的一个或两个或其变体和/或衍生物(包括更短的抗原区或表位)即可。所述SEQ ID NO:3的变体和/或衍生物和/或其抗原区或表位可不同，例如因含有保守或非保守氨基酸的取代或缺失(特别是氨基端或羧基端缺失)或各种插入等，只要得到的蛋白质/肽是抗原性的并引发疫苗受体的免疫应答即可。所述抗原区或表位优选长度至少约10个氨基酸，包含分别为Thr和Asp的第232位和第300位氨基酸的一个或多个，参考如图3所示的VP-2蛋白的氨基酸残基编号。然而，抗原区可能包含整个AR08071304 VP-2基因/蛋白质。另外，亦预期与本文公开的序列(或这些序列的部分)在严格条件下(特别是高度严格条件下)杂交的核酸序列，只要所述序列编码分别为Thr和Asp的第232位和第300位氨基酸残基中的一个或两个即可。严格条件指的是允许核酸序列与特定序列杂交的杂交条件。一般而言，高严格条件指的是允许含至少50个核苷酸并优选含约200个或更多个核苷酸的核酸序列与特定序列在约65°C下于包含约I M盐的溶液中杂交的杂交条件，所述溶液优选6 X SSC或具有相当的离子强度的任何其它溶液，并在65°C下于包含约O. I M盐或更低浓度的盐的溶液中洗涤，优选O. 2 X SSC或具有相当的离子强度的任何其它溶液。这些条件允许检测具有约90%或更高的序列同一性的序列。一般而言，较低严格条件指的是允许含至少50个核苷酸并优选含约200个或更多个核苷酸的核酸序列与特定序列在约45°C下于包含约I M盐的溶液中杂交的杂交条件，所述溶液优选6 X SSC或具有相当离子强度的任何其它溶液，并在室温下于包含约I M盐的溶液中洗涤，优选6 X SSC或具有相当离子强度的任何其它溶液。这些条件允许检测具有高达50%的序列同一性的序列。为了鉴定同一性在50%-90%之间变化的序列，本领域技术人员能够改良这些杂交条件。因此，本发明亦提供含有并表达本文所公开的核酸序列(或其编码抗原肽和/或多肽的部分)的各式重组和/或表达载体。所述载体可用于疫苗制剂，或可用于其它目的，例如在实验室环境下操作所公开的序列。所述载体和表达系统实例包括但不限于各种细菌(例如大肠杆菌iBscherichia coif)、或基于益生菌(probiotic)的(例如乳杆菌ilactobaciIIusY)表达载体；各种重组病毒载体，例如腺病毒、杆状病毒、金丝雀痘载体等；毕赤酵母(Pichia)和酵母表达系统等。所述重组载体和表达系统可能用于例如疫苗制齐U，或用于其它目的，例如用于实验室中操作序列，或用于研究或诊断目的。本发明亦预期嵌合蛋白和编码所述嵌合蛋白的基因，所述蛋白包含本发明RPV的VP-2蛋白或其抗原区或表位。在某些实施方案中，所述表位大小在至少约5-约20或更多个氨基酸的范围内。所述嵌合蛋白(或编码它们的核酸序列)可能包括其它有用的氨基酸序列，例如佐剂、作为疫苗靶标的其它蛋白，例如来自其它生物体，其导致食肉动物特别是犬科动物等的疾病。编码所述蛋白的核酸可能包括接头或间隔子序列，例如在抗原区或表位之间。亦包括编码和/或表达所述嵌合(或融合)蛋白的重组和/或表达载体。制备适于接种以抵抗细小病毒的疫苗的若干方法为本领域已知。例如，参见Appel等的美国专利4，193，990和4，193，99KCarmichaeI等的美国专利4，303，645,Wood等的美国专利4，971，793,Valdes等的美国专利5，882，652和Parrish等的美国专利5，885，585，其中每一个都提供了多种合适的配制疫苗的策略。这些专利中每一个的全部内容通过引用并入本文。要制备疫苗，通常会用到含有所述核酸序列(例如病毒中天然存在的ssDNA，或通过基因工程移入非天然病毒载体的ssDNA或其它等同物形式(例如dSDNA、SS或dsRNA、RNA-DNA杂交链等))的病毒载体。实例包括RPV (或其它)病毒连同合适的生理学载体，所述病毒“被杀死”、灭活或以另外方式减毒以使其不会导致被给予的动物严重疾病症状。优选不会因给予而出现疾病症状。然而，本领域技术人员应认识到，许多有效的疫苗组合物在给予时或给予后会导致某些不适或相对较小的痛楚。然而，保护完全发作的疾病的好处远远超过这个可能性。作为备选，可以利用不会自然感染或一般不会导致被接种动物疾病 的异型病毒。灭活本发明抗原(例如本发明RPV)的方式的实例包括但不限于加热、甲醛、福尔马林、二亚乙基胺、辐射和丙内酯处理。其它适合的疫苗组分例如药理学可接受的载体为本领域技术人员所熟知，用作疫苗的所述组合物的制备也一样。通常所述组合物被制备成液体溶液剂或混悬剂，但亦预期固态形式，例如片剂、丸剂、粉剂等等。亦可制备适于给予前在液体中成为溶液剂或混悬剂的固态形式，或适于在口中溶解的固态形式。也可乳化制剂。活性成分可与药学上可接受并与所述活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂为例如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等等，或其组合。另外，所述组合物可含有少量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、PH缓冲剂等等。如果期需给予口服形式的组合物，则可添加各种增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散剂或粘合剂等等。本发明组合物可含有任何所述另外成分，以使提供的组合物处于适于给予的形式。制剂中可翻译的核酸的最终量可能变化。然而，一般而言，该量将为约I-99%O所述组合物可进一步包含佐剂，所述佐剂的合适的实例包括但不限于Seppic、QuilA、Alhydrogel 等。为了作为疫苗给予，通常将核酸包括在病毒或病毒颗粒之内，整个颗粒将是疫苗组分。如本领域技术人员所理解，当疫苗含有毒粒(例如本发明RPV)时，这些病毒将被灭活(被杀死的)或减毒，即病毒在细胞中培养数代之后获得，以使颗粒不会导致疾病症状，或仅仅导致轻微的、无生命威胁的症状。本领域技术人员亦可认识到，存在使病毒减毒的其它方法，这些方法中的任何一种均可用于本发明实践以开发本文所公开的变异株病毒的合适形式。例如，可能引进干扰病毒毒性、繁殖能力等的各种突变。或者，可在异源载体中递送SEQ ID NO: I所展示的核苷酸序列(或本文所述的其编码抗原区和表位的片段，例如SEQ ID NO: 2)，所述异源载体例如不同病毒(例如不会导致疫苗受体物种疾病的病毒)，或另一类型的构建体，将所述构建体设计为导致疫苗受体表达所编码蛋白而不导致疾病症状。所述病毒的实例包括但不限于猫泛白细胞减少症病毒(FPV)、各种疱疫病毒、非病原性“孤儿病毒(orphan viruse) ”、肠道病毒例如肠道病毒属 等。亦预期其它形式的疫苗。例如，亦预期“空”病毒颗粒疫苗(无核酸)，同样预期包含不被装配为衣壳的蛋白质的疫苗。亦可通过用柱、盘等中包被转铁蛋白的珠子淘选而基本上或部分纯化和/或浓缩的本发明RPV。本发明RPV可在极高效价下安全地给予。例如，疫苗中CPV-2的通常剂量为每次注射约10，000个病毒颗粒。当使用RPV时，其给予量的范围为每次注射约10，000个颗粒-每次注射约100，000个颗粒，或甚至更高，例如每次注射约100，000个直至1，000, 000个颗粒。或者，疫苗制剂可包括如在SEQ ID NO: 3或SEQ ID MO: 4中展示的VP-2蛋白(多肽、肽等)序列或其抗原区或表位。另外，亦预期以下序列用于疫苗中表现出与上述SEQ ID NO: 3或SEQ ID MO: 4至少约50%的同一性、优选约60%、更优选约70、80或90%的同一性或相似性，或甚至约95、96、97、98或99%或更高的同一性或相似性的序列，或其抗原区或表位，只要序列包括分别为Thr和Asp的第232位和第300位氨基酸残基中的一个或两个即可。术语“同一性”和“相似性”为本领域所知，当使用术语“同一性”时，通常指的是基于待比较的序列中相应的相同位置间的相同匹配的序列比较。术语“相似性”指的是氨基酸序列之间的比较，其不但考虑相应位置相同的氨基酸，而且也考虑相应位置功能相似的氨基酸(例如Asp和Glu，两个都拥有在中性pH下通常带负电的侧链，因此可能功能相似)。因此，多肽序列之间的相似性表明除序列上的相似性外还有功能上的相似性。本发明所包含的序列可能与明确公开的那些序列不同，例如，如本领域技术人员所知悉的那样，具有保守氨基酸取代(例如带正电荷的氨基酸可相互取代，脂肪族氨基酸可相互取代等)，只要氨基酸序列保持在给予疫苗受体时引发有效、合适的免疫应答的能力即可。另外，本发明亦包含作为SEQ ID NO: 3中短连续序列(即代表SEQ IDNO: 3部分的截短或局部序列)的抗原区或表位，但是其仍保持引发疫苗受体抵抗犬细小病毒感染症状发展的有效、合适的免疫应答的能力。所述抗原区通常长度范围为约5-10个氨基酸，但是也可为约15、20、25、30、35、40、45或甚至50个氨基酸或长度更长，通常应包含第232位和第300位氨基酸中的一个或两个。
在本发明的一个实施方案中，所述疫苗受体是幼犬。所述“幼犬”，我们意指小于约8周龄的年幼狗。通常在例如2-3周龄时将疫苗给予幼犬，接着在4和6周时给予加强剂量。在一些实施方案中，8周后不再使用该疫苗，因为从那以后，接着可使用无母体抗体干扰的针对其它已知流行病毒的疫苗。尽管在一些实施方案中，所述疫苗受体是幼犬，但本领域技术人员应认识到，情况不一定需要总是这样。可将疫苗给予任何年龄的狗及对细小病毒感染敏感的其它动物物种(特别是食肉动物)，包括成年和幼年动物二者。实例包括但不限于犬科动物(canid)(例如野生犬科动物，例如狼、野狗物种、郊狼、狐狸例如灰狐、敏狐和红狐等)、臭鼬、猫(包括家养猫和小猫及猫类的较大物种，而不管是家养的还是野生的，例如山猫(bobcat)、美洲狮、狮、虎等)、水貂、红熊猫(red panda)等；各种浣熊科动物，包括浣熊、长鼻浣熊(coatis)、蜜熊(kinkajous)、犬综熊(olingos)、圈尾猫(ringtails)和蓬尾综熊(cacomistles)等。所述动物可能是家养的(例如宠物)、“工作”动物(例如服务性动物)、牲畜、野外的动物、 圈养的或保护区、动物园、收容所的动物等，只要它们能得益于疫苗给予即可。可通过本领域技术人员所熟知的很多合适手段中的任意一种给予本发明免疫原性/疫苗制剂，包括但不限于通过注射；胃肠外给予，例如肌内、皮下、腹腔内、皮内给予等等；通过如上所述口服“幼犬棒棒糖”；鼻内；通过摄取含有抗原的食物制品等。然而，在优选实施方案中，成年受体的给予方式是通过注射，和如上所述，幼体的注射方式是经由吮吸时溶解于口中的固体制剂。可单独给予或与其它药剂或免疫原性组合物联合给予本发明组合物，例如作为多组分疫苗的一部分。另外，给予可能是单个事件，或可在不同时间间隔给予多次加强剂量以加强免疫应答。在给予幼犬的情况下，典型给予方案是(如上所述)在例如2-3周龄时初次免疫，接着是在4和6周龄时加强剂量。优选地，给予是预防性的，即在暴露于病毒发生之前；或疑似已暴露于病毒，但也可能在此事实后给予，即在已知或疑似暴露之后；或给予是治疗性的，例如在与病毒感染有关的疾病症状已经发生之后。本发明亦提供在有需要的患者或个体中引发免疫应答的方法，以及给患者或个体(特别是食肉动物例如幼年犬科动物，例如幼犬)接种以抵抗细小病毒感染的方法。所述方法包括将一个或多个剂量的免疫弓I发制剂或疫苗制剂给予受体。所给予的剂量足以引发免疫应答，优选对由所给予的核酸编码的抗原的保护性免疫应答。或者，在给予本文所述的一种或多种氨基酸序列的情况下，免疫应答是针对氨基酸序列中存在的抗原。优选免疫应答是保护性的，不会有因给予而发生的疾病症状。然而，本领域技术人员应认识到，很多有效的疫苗组合物在给予时会导致一些相对较小的症状，或一旦受体被致病生物体感染，减弱但不消除疾病的所有症状。然而，针对完全发作的疾病而受保护的好处远远超过这些可能性。在其它实施方案中，用本发明浣熊细小病毒作为基因递送系统。本文所述浣熊细小病毒(RPV)是自主复制细小病毒(ARP)。业已阐述用ARP作为基因递送工具和表达载体(参见Maxwell等的美国专利5，585，254)。因为本发明RPV和接种过CPV或已天然暴露于CPV的狗的血清无抗原性反应，所以该RPV非常适于用作犬亦用于其它物种(参见以下)的基因载体和/或表达载体。将基因工程改造的RPV用于将“外源”或“异源”核酸序列携带进入目的细胞内，所述“外源”或“异源”核酸序列即不是源于RPV但在目的细胞中编码和表达的序列，或以另外方式提高或促进表达目的多肽或肽的序列。例如，可编码一种或多种免疫原，并可将RPV给予受试者以引发对所述一种或多种免疫原(例如对受试者接种疫苗)的免疫应答。RPV是含有无包膜单链DNA的小病毒。和脊椎动物其它自主细小病毒一样，RPV基因组有两个开放阅读框ORFl和0RF2，两侧是DNA复制所需的末端反向重复(ITR)(图4A)。ORFl和0EF2的表达分别由启动子P4和P38驱动(图4B)。ORFl编码非结构(NS)蛋白NSl和NS2，0RF2编码衣壳蛋白VP-1、VP-2和VP-3 (图4C)。NSl是病毒DNA复制和启动子反式激活所必需的例如驱动VP-I和VP-2转录的多功能蛋白质。NS2为复制、病毒产生和子代毒粒从核释出(nuclear egress)所必需。细小病毒颗粒具有二十面体对称,直径约20 nm。所述颗粒包含约50%的蛋白质和约50%的DNA，且中和表位存在于颗粒的暴露表面。有可能将异源序列插入犬细小病毒衣壳蛋白例如VP-2蛋白中，并且使用相同或相似的策略对本发明RPV进行基因工程改造。(Austin等，Tropic determinant for canineparvovirus and feline panleukopenia virus functions through the capsid proteinVP-2 (通过衣壳蛋白VP-2发挥功能的犬细小病毒和猫泛白细胞减少症病毒的向性决定子)，Journal of General Virology (1997)，78，925-928)。表 I 列出了位于编码 VP-2·的基因内的限制位点。这些限制位点中的一个或多个可能被用于外源DNA的插入。表I浣熊细小病毒VP-2的限制性图谱
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ApaIO
ApaLII1022
ApoI9154 160 43 747 784 179 926 1409 142权利要求
1.一种细小病毒，其包含ATCC编号_的细小病毒-2 (综熊)的特征。
2.一种疫苗，其包含细小病毒，所述细小病毒包含具有ATCC编号_的细小病毒-2 (浣熊)的特征。
3.权利要求2的疫苗，其进一步包含选自以下的一种或多种抗原组分犬瘟热病毒(CDV)、犬腺病毒2型、犬副流感病毒、犬冠状病毒、犬疱疹病毒、犬轮状病毒、钩端螺旋体的一种或多种血清变型和犬细小病毒_2，在所述犬细小病毒-2中，VP-2蛋白的第232位氨基酸不是Thr且VP-2蛋白的第300位氨基酸不是Asp。
4.权利要求3的疫苗，其中所述钩端螺旋体的一种或多种血清变型选自以下问号钩端螺旋体犬型血清型、问号钩端螺旋体黄疸出血型血清型、问号钩端螺旋体波莫那型血清型和基氏钩端螺旋体感冒伤寒型血清型。
5.分离的核酸，其包含核苷酸序列SEQID NO: I或SEQ ID NO: I的一部分；其中所述SEQ ID NO: I的一部分编码包含SEQ ID NO: 3的第232位氨基酸残基、SEQ ID NO: 3的第300位氨基酸残基或包含SEQ ID NO: 3的第232位氨基酸残基和第300位氨基酸残基两者的VP-2蛋白的抗原区。
6.包含权利要求5的核酸的免疫原性组合物，其中所述核酸存在于被杀死的或减毒的细小病毒颗粒或低代数RPV中。
7.权利要求6的免疫原性组合物，其中所述被杀死的细小病毒颗粒包含具有ATCC编号_的细小病毒-2 (浣熊)的特征。
8.权利要求6的免疫原性组合物，其中所述减毒的细小病毒颗粒存在于适于舌上溶解的固体载体中。
9.权利要求6的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物适于皮下给予。
10.引发动物抵抗细小病毒感染的免疫应答的方法，所述方法包括将包含核酸的免疫原性组合物给予所述动物的步骤，所述核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO: I或SEQ ID NO: I的一部分；其中所述SEQ ID NO: I的一部分编码包含SEQ ID NO: 3的第232位氨基酸残基、SEQ ID NO: 3的第300位氨基酸残基或包含SEQ ID NO: 3的第232位氨基酸残基和第300位氨基酸残基两者的VP-2蛋白的抗原区。
11.权利要求10的方法，其中所述核酸存在于被杀死的或减毒的细小病毒颗粒或者被杀死或减毒的细小病毒颗粒中的低代数RPV。
12.权利要求11的方法，其中所述被杀死的细小病毒颗粒包含具有ATCC编号_的细小病毒-2 (浣熊)的特征。
13.权利要求11的方法，其中所述减毒的细小病毒颗粒存在于适于舌上溶解的固体载体中。
14.权利要求10的方法，其中所述免疫原性组合物适于皮下给予。
15.权利要求13的方法，其中所述动物是幼犬。
16.基本上纯化的细小病毒VP-2蛋白或其抗原性片段，所述VP-2蛋白在第232位氨基酸具有苏氨酸残基，在第300位氨基酸具有天冬氨酸残基，其中所述抗原性片段至少包含所述VP-2蛋白的一部分，其具有第232位氨基酸的苏氨酸残基；或第300位氨基酸的天冬氨酸残基；或第232位氨基酸的苏氨酸残基和第300位氨基酸的天冬氨酸残基二者。
17.权利要求16的基本上纯化的细小病毒VP-2蛋白或其抗原性片段，其中所述基本上纯化的细小病毒VP-2蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO: 3。
18.表达载体，其包含编码SEQID NO: 3或SEQ ID NO: 3的一部分的氨基酸序列的核苷酸序列；其中所述SEQ ID NO: 3的一部分是VP-2蛋白的抗原性区域，其包含SEQ IDNO: 3的第232位氨基酸残基、SEQ ID NO: 3的第300位氨基酸残基或包含SEQ ID NO: 3的第232位氨基酸残基和第300位氨基酸残基两者。
19.权利要求18的表达载体,其为重组病毒表达载体。
20.权利要求19的表达载体,其为金丝雀痘病毒表达载体。
21.杀死哺乳动物中肿瘤细胞的方法，所述方法包括将包含足以感染并杀死所述哺乳动物中所述肿瘤细胞的量的细小病毒的组合物给予所述哺乳动物的步骤，所述细小病毒包含ATCC编号的细小病毒-2 (浣熊)的特征。
22.权利要求21的方法，其中所述哺乳动物是对犬细小病毒-2血清反应阳性的狗。
23.权利要求21的方法，其中所述方法通过选自静脉内给予和瘤内给予的给药途径来实施。
24.权利要求23的方法，其中所述细小病毒是低代数细小病毒。
全文摘要
提供了针对犬细小病毒的疫苗制剂。所述疫苗包括分离自浣熊的新型犬细小病毒-2和相关核酸及蛋白质。
文档编号C12N7/04GK102971417SQ201080056571
公开日2013年3月13日 申请日期2010年10月14日 优先权日2009年10月14日
发明者S.卡皮尔 申请人:俄克拉荷马州大学评议会