专利名称：双重可变结构域免疫球蛋白及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及多价和多特异性结合蛋白、制备方法、和具体而言涉及其在诊断、预防和/或治疗急性和慢性炎性疾病、癌症及其他疾病中的用途。
背景技术：
工程改造的蛋白，例如能够结合2种或更多抗原的多特异性抗体是本领域已知的。此种多特异性结合蛋白可以使用细胞融合、化学缀合、或重组DNA技术来产生。基于2种不同杂交瘤细胞系的体细胞融合，已使用四源杂交瘤(quadroma)技术(參见 Milstein，C.和 A.C. Cuello (1983) Nature, 305 (5934):第 537-40 页)生产了双特异性抗体，所述杂交瘤细胞系表达具有双特异性抗体的所需特异性的鼠单克隆抗体(mAbs)。因为2种不同免疫球蛋白(Ig)重和轻链在所得到的杂种-杂交瘤(或四源杂交瘤)细胞系内随机配对，所以产生最高达10种不同Ig种类，其中只有一种是功能性双特异性抗体。错配对副产品的存在和显著減少的生产得率意味着需要复杂的纯化程序。双特异性抗体也可以通过2种不同mAbs的化学缀合来生产(參见，Staerz, U. D.,等人(1985)，Nature 314 (6012):第628-31页)。这种方法不产生均质制剂。其他方法已使用2种不同mAbs或较小抗体片段的化学缀合(參见Brennan, Μ.,等人(1985), Science229 (4708) 第 81-3 页)。用于产生双特异性抗体的另ー种方法是用异双功能交联剂偶联2种亲本抗体，但所得到的双特异性抗体经受显著的分子异质性，因为交联剂与亲本抗体的反应不是定点的。为了获得更均质的双特异性抗体制剂，2种不同Fab片段已以定点方式在其铰链半胱氨酸残基上进行化学交联(參见Glennie，M.J.，等人(1987)，J Immunol 139 (7):第2367-75页)。但这种方法产生Fab’ 2片段，而不是全IgG分子。已开发了广泛多样的其他重组双特异性抗体形式(參见Kriangkum, J.,等人(2001), Biomol Eng 18 (2):第31-40页)。在它们当中，串联单链Fv分子和双抗体(diabody)、及其各种衍生物是最广泛使用的。常规地，这些分子的构建从识别不同抗原的 2 个单链 Fv (scFv)片段开始(參见 Economides, A. N.,等人(2003), Nat Med 9 (I):第47-52页)。串联scFv分子(taFv)代表用另外的肽接头简单连接2个scFv分子的简单形式。这些串联scFv分子中存在的2个scFv片段形成分开的折叠实体。各种接头可以用于连接2个scFv片段和接头具有最高达63个残基的长度(參见Nakanishi，K.，等人(2001)，Annu Rev Immunol 19 :第423-74页)。尽管亲本scFv片段可以以可溶形式在细菌中正常 表达，然而，常常观察到串联scFv分子在细菌中形成不溶性聚集体。因此，重折叠规程或哺乳动物表达系统的使用常规应用于生产可溶性串联scFv分子。在近期研究中，报道了通过转基因兔和牛体内表达针对⑶28的串联scFv和黑素瘤相关蛋白聚糖(參见Gracie，J. A.，等人(1999)，J Clin Invest. 104 (10):第 1393-401 页)。在这个构建体中，2 个 scFv 分子通过CHl接头进行连接，且得到最高达100 mg/L的双特异性抗体血清浓度。使用各种策略包括结构域顺序变化或使用具有变化长度或柔性的中间接头，以允许在细菌中可溶性表达。少数研究现在已报道了使用非常短的Ala3接头或长的富甘氨酸/丝氨酸接头，在细菌中表达可溶性串联scFv分子(參见Leung，B. P.，等人(2000)，J Immunol 164 (12)第 6495-502 页；Ito, A.，等人(2003)，J Immunol 170 (9):第 4802-9 页；Kami, A.，等人(2002)，J Neuroimmunol 125 (1-2):第134-40页)。在另ー个近期研究中，包含长度为3或6个残基的随机化中间接头的串联scFv谱(repertoire)曬菌体展示,用于富集以可溶和活性形式在细菌中生产的那些分子。这种方法导致分离具有6个氨基酸残基接头的串联scFv 分子(參见 Arndt，M.和 J. Krauss (2003)，Methods Mol Biol 207 :第 305-21 页)。这种接头序列是否代表串联scFv分子可溶性表达的一般解决方案仍不清楚。然而，这项研究证明串联scFv分子的噬菌体展示与定向诱变组合是富集这些分子的有力工具，所述分 子可以以活性形式在细菌中表达。双特异性双抗体(Db)利用双抗体形式用于进行表达。通过使连接VH和VL结构域的接头长度减少至约5个残基，由scFv片段生产双抗体(參见Peipp,M.和T. Valerius(2002), Biochem Soc Trans 30 (4):第507-11页)。接头尺寸的这种减少通过使VH和VL结构域交叉配对促进2条多肽链的ニ聚化。双特异性双抗体通过在相同细胞内表达2条多肽链来生产，所述2条多肽链具有结构VHA-VLB和VHB-VLA (VH-VL构型)、或VLA-VHB和VLB-VHA(VL-VH构型)。在过去已生产了大量品种繁多的不同双特异性双抗体，并且它们中的大多数以可溶形式在细菌中表达。然而，近期的比较研究证明可变结构域的方向可以影口向活性结合位点的表达和形成(參见Mack,M.,等人(1995), Proc Natl Acad Sci U S A 92
(15):第7021-5页)。然而，在细菌中的可溶性表达代表超过串联scFv分子的重要优点。然而，因为2条不同多肽链在单个细胞内表达，所以可以生产无活性同ニ聚体连同活性异ニ聚体。这使另外纯化步骤的执行成为必需，以获得双特异性双抗体的均质制剂。促使双特异性双抗体产生的ー种方法是结进孔(knob-into-hole)双抗体的生产(參见Holliger, P. , T.Prospero 和 G. Winter (1993), Proc Natl Acad Sci U S A 90 (14):第 6444-8. 18 页)。该方法对于针对HER2和⑶3的双特异性双抗体进行了证明。通过用Phe交换Val37和用Trp交换Leu45将大结引入VH结构域内，且在抗HER2或抗⑶3可变结构域中，通过使Phe98突变为Met和使Tyr87突变为Ala在VL结构域中产生互补孔。通过使用这种方法，双特异性双抗体的生产可以从经由亲本双抗体的72%增至经由结进孔双抗体的超过90%。重要的是，作为这些突变的结果生产得率只有轻微減少。然而，对于几种构建体观察到抗原结合活性的減少。因此，这种相当精细的方法需要分析各种构建体，以鉴定产生具有不变结合活性的异ニ聚分子的那些突变。此外，此种方法需要免疫球蛋白序列在恒定区的突变修饰，因此生成非天然和非自然形式的抗体序列，这可以导致免疫原性増加、体内稳定性差、以及不希望有的药物代谢动力学。单链双抗体(scDb)代表改善双特异性双抗体样分子形成的可替代策略(參见Holliger, P.和 G. Winter (1997), Cancer Tmmunol Immunother 45 (3-4):第 128-30页；ffu, A. Μ.,等人(1996), Immunotechnology 2 (I):第 21-36 页)。双特异性单链双抗体通过用另外的中间接头连接2条双抗体形成多肽链来产生，所述另外的中间接头长度为约15个氨基酸残基。因此，分子量对应于単体单链双抗体(50 — 60 kDa)的所有分子都是双特异性的。几项研究已证明双特异性单链双抗体在细菌中以可溶和活性形式表达，其中大多数纯化的分子呈现为单体(參见Holliger, P.和G. Winter (1997), Cancer TmmunolImmunother 45 (3-4):第 128-30 页；ffu, A. Μ.，等人(1996)ImmunotechnoI. 2 (I):第 21-36页；Pluckthun, A.和P. Pack (1997) Immunotechnol. 3(2):第 83-105 页；Ridgway, J. B.,等人(1996), Protein Engin. 9 (7):第617-21页)。因此,单链双抗体组合了串联scFvs(所有単体都是双特异性的)和双抗体(在细菌中可溶性表达)的优点。更近地，双抗体已与Fe融合以产生更Ig样的分子，称为双-双抗体(di-diabodies)(參见 Lu，D.，等人(2004)，J Biol Chem 279 (4):第 2856-65 页)。此外，已描述了在IgG重链中包含2个Fab重复且能够结合4个抗原分子的多价抗体构建体(參见 TO 0177342A1，和 Miller，K.，等人(2003)，J Immunol 170 (9):第 4854-61 页)。本领域需要能够结合2种或更多抗原的改良的多价结合蛋白。美国专利申请系列号11/507，050提供了能够以高亲和カ结合2种或更多抗原的结合蛋白新家族，其被称为双重可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig )。本发明提供能够结合2种或更多抗原的另外的新结合蛋白。发明概沭
本发明涉及能够结合2种或更多抗原的多价结合蛋白。本发明提供了能够以高亲和カ结合2种或更多抗原的结合蛋白新家族。在一个实施方案中，本发明提供了包含多肽链的结合蛋白，其中多肽链包含VDl- (Xl)n-VD2-C- (X2)n，其中VDl是第一个可变结构域，VD2是第二个可变结构域，C是恒定结构域，Xl代表氨基酸或多肽，X2代表Fe区和η是O或I。在一个实施方案中，结合蛋白中的VDl和VD2是重链可变结构域。在另ー个实施方案中，重链可变结构域选自鼠重链可 变结构域、人重链可变结构域、CDR嫁接的重链可变结构域、和人源化重链可变结构域。在另一个实施方案中，VDl和VD2能够结合相同抗原。在另ー个实施方案中，VDl和VD2能够结合不同抗原。在另ー个实施方案中，C是重链恒定结构域。例如，Xl是接头，条件是Xl不是CHl0 例如，Xl 是选自下述的接头AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQ ID NO: I)；AKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO: 2)；AKTTPKLGG(SEQ ID NO: 3)；SAKTTPKLGG (SEQ ID NO: 4)；SAKTTP (SEQ IDNO: 5)；RADAAP (SEQ ID NO: 6)；RADAAPTVS (SEQ ID NO: 7)；RADAAAAGGPGS (SEQ ID NO:8) ；RADAAAA (G4S)4 (SEQ ID NO: 9);SAKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 10) ；ADAAP (SEQID NO: 11)；ADAAPTVSIFPP (SEQ ID NO: 12)；TVAAP (SEQ ID NO: 13)；TVAAPSVFIFPP (SEQID NO: 14)；QPKAAP (SEQ ID NO: 15)；QPKAAPSVTLFPP (SEQ ID NO: 16)；AKTTPP (SEQ IDNO: 17)；AKTTPPSVTPLAP (SEQ ID NO: 18)；akttap (SEQ ID NO: 19)；akttapsvyplap (SEQID NO: 20)；ASTKGP (SEQ ID NO: 21 )；ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 22)，GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 23) ；GENKVEYAPALMALS (SEQ ID NO: 24) ；GPAKELTPLKEAKVS (SEQ ID NO:25);以及GHEAAAVMQVQYPAS (SEQ ID NO: 26)。在一个实施方案中，X2是Fe区。在另ー个实施方案中，X2是变体Fe区。在一个实施方案中，此处公开的结合蛋白包含多肽链，其中多肽链包含VDl- (Xl)n-VD2-C- (X2)n，其中VDl是第一个重链可变结构域，VD2是第二个重链可变结构域，C是重链恒定结构域，Xl是接头，条件是它不是CHl，且X2是Fe区。在一个实施方案中，结合蛋白中的VDl和VD2是轻链可变结构域。在一个实施方案中，轻链可变结构域选自鼠轻链可变结构域、人轻链可变结构域、CDR嫁接的轻链可变结构域、和人源化轻链可变结构域。在一个实施方案中，VDl和VD2能够结合相同抗原。在另ー个实施方案中，VDl和VD2能够结合不同抗原。在一个实施方案中，C是轻链恒定结构域。在另ー个实施方案中，Xl是接头，条件是Xl不是CL1。在一个实施方案中，Xl是选自下述的接头AKTTPKLEEGEFSEAR (SEQ ID NO: I) ；AKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO:2) ；AKTTPKLGG (SEQ ID NO: 3) ；SAKTTPKLGG (SEQ ID NO: 4) ；SAKTTP (SEQ ID NO: 5)；RADAAP (SEQ ID NO: 6) ；RADAAPTVS (SEQ ID NO: 7) ；RADAAAAGGPGS (SEQ ID NO: 8)； RADAAAA(G4S)4 (SEQ ID NO: 9) ；SAKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 10) ;ADAAP (SEQ IDNO: 11)；ADAAPTVSIFPP (SEQ ID NO: 12)；TVAAP (SEQ ID NO: 13)；TVAAPSVFIFPP (SEQ IDNO: 14)；QPKAAP (SEQ ID NO: 15)；QPKAAPSVTLFPP (SEQ ID NO: 16)；AKTTPP (SEQ ID NO:17)；AKTTPPSVTPLAP (SEQ ID NO: 18)；akttap (SEQ ID NO: 19)；akttapsvyplap (SEQ IDNO: 20) ；ASTKGP (SEQ ID NO: 21) ；ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 22) ；GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 23) ；GENKVEYAPALMALS (SEQ ID NO: 24) ；GPAKELTPLKEAKVS (SEQ ID NO:25);以及GHEAAAVMQVQYPAS (SEQ ID NO: 26)。在一个实施方案中，结合蛋白不包含X2。在一个实施方案中，可变重链和可变轻链均包含相同接头。在另ー个实施方案中，可变重链和可变轻链包含不同接头。在另ー个实施方案中，可变重链和可变轻链均包含短(约6个氨基酸)接头。在另ー个实施方案中，可变重链和可变轻链均包含长(多于6个氨基酸)接头。在另ー个实施方案中，可变重链包含短接头而可变轻链包含长接头。在另ー个实施方案中，可变重链包含长接头而可变轻链包含短接头。在一个实施方案中，此处公开的结合蛋白包含多肽链，其中所述多肽链包含VDl- (Xl)n-VD2-C- (X2) n，其中VDl是第一个轻链可变结构域，VD2是第二个轻链可变结构域，C是轻链恒定结构域，Xl是接头，条件是它不是CH1，且X2不包含Fe区。在另ー个实施方案中，本发明提供了包含2条多肽链的结合蛋白，其中所述第一条多肽链包含VDl- (Xl)n-VD2-C- (X2)n，其中VDl是第一个重链可变结构域，VD2是第二个重链可变结构域，C是重链恒定结构域，Xl是接头，条件是它不是CH1，且X2是Fe区；且所述第二条多肽链包含VDl- (Xl)n-VD2-C- (X2) n，其中VDl是第一个轻链可变结构域，VD2是第二个轻链可变结构域，C是轻链恒定结构域，Xl是接头，条件是它不是CHl，且X2不包含Fe区。在具体实施方案中，双重可变结构域(DVD)结合蛋白包含4条多肽链，其中首先2条多肽链分别包含VDl- (Xl) n-VD2-C- (X2) n，其中VDl是第一个重链可变结构域，VD2是第二个重链可变结构域，C是重链恒定结构域，Xl是接头，条件是它不是CH1，且X2是Fe区；且其次2条多肽链分别包含VDl- (Xl)n-VD2-C- (X2)n，其中VDl是第一个轻链可变结 构域，VD2是第二个轻链可变结构域，C是轻链恒定结构域，Xl是接头，条件是它不是CH1，且X2不包含Fe区。此种双重可变结构域(DVD)蛋白具有4个抗原结合部位。在另ー个实施方案中，此处公开的结合蛋白能够结合一种或多种靶。在一个实施方案中，靶选自细胞因子、细胞表面蛋白、酶和受体。在另ー个实施方案中，结合蛋白能够调节ー种或多种靶的生物学功能。在另ー个实施方案中，结合蛋白能够中和一种或多种靶。本发明的结合蛋白能够结合选自淋巴因子、单核因子、多肽激素、受体或肿瘤标记的细胞因子。例如，本发明的DVD-Ig能够结合下述的两种或更多种肿瘤坏死因子a(TNFa )、白细胞介素1β (IL-Ιβ )、神经生长因子(NGF)、IL-6受体(IL-6)和前列腺素Ε2 (PGE2)(也见表2)。在具体实施方案中，结合蛋白能够结合选自下述的靶对NGF和PGE2、NGF和TNF-a、以及NGF和IL-I β (參见实施例2. I至2. 12)。在一个实施方案中，能够结合NGF (seq. I)和IL-6R的结合蛋白包含选自SEQ IDNO: 44和SEQ ID NO: 46的DVD重链氨基酸序列；以及选自SEQ ID NO: 45和SEQ ID NO:47的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合NGF (seq. I)和IL-6R的结合蛋白包含SEQ ID NO: 44的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO:45的DVD轻链氨基酸序列。在另ー个实施方案中，能够结合NGF (seq. I)和I L-6R的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO: 46的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO: 47的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合NGF (seq. 2)和PGE2的结合蛋白包含选自SEQ IDNO: 48和SEQ ID NO: 50的DVD重链氨基酸序列；以及选自SEQ ID NO: 49和SEQ ID NO:51的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合NGF (seq. 2)和PGE2的结合蛋白包含SEQ ID NO: 48的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO:49的DVD轻链氨基酸序列。在另ー个实施方案中，能够结合NGF (seq. 2)和PGE2的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQID NO: 50的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO: 51的DVD轻链氨基酸序列。在ー个第二实施方案中，能够结合NGF (seq. 2)和PGE2的结合蛋白包含选自SEQ ID NO: 52和SEQ ID NO: 54的DVD重链氨基酸序列；以及选自SEQ ID NO: 53和SEQID NO: 55的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合NGF (seq. 2)和PGE2的结合蛋白包含SEQ ID NO: 52的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO:53的DVD轻链氨基酸序列。在另ー个实施方案中，能够结合NGF (seq. 2)和PGE2的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO: 54的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO: 55的DVD轻链氨基酸序列。在ー个第三实施方案中，能够结合NGF (seq. 2)和PGE2的结合蛋白包含选自SEQ ID NO: 56和SEQ ID NO: 58的DVD重链氨基酸序列；以及选自SEQ ID NO: 47和SEQID NO: 59的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合NGF (seq. 2)和PGE2的结合蛋白包含SEQ ID NO: 56的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO:57的DVD轻链氨基酸序列。在另ー个实施方案中，能够结合NGF (seq. 2)和PGE2的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO: 58的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO: 59的DVD轻链氨基酸序列。在一个第四实施方案中，能够结合NGF (seq. 2)和PGE2的结合蛋白包含选自SEQ ID NO: 60和SEQ ID NO: 62的DVD重链氨基酸序列；以及选自SEQ ID NO: 61和SEQID NO: 63的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合NGF (seq. 2)和PGE2的结合蛋白包含SEQ ID NO: 60的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID N0:61的DVD轻链氨基酸序列。在另ー个实施方案中，能够结合NGF (seq. 2)和PGE2的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO: 62的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO: 63的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合NGF (seq. 2)和TNF-a的结合蛋白包含选自SEQID NO: 64和SEQ ID NO: 66的DVD重链氨基酸序列；以及选自SEQ ID NO: 65和SEQ IDNO:67的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合NGF (seq. 2)和TNF-a的结合蛋白包含SEQ ID NO: 64的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO:65的DVD轻链氨基酸序列。在另ー个实施方案中，能够结合NGF (seq. 2)和TNF-a的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO: 66的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO: 67的DVD轻链氨基酸序列。在ー个第二实施方案中，能够结合NGF (seq. 2)和TNF-α的结合蛋白包含选自SEQ ID NO: 68和SEQ ID NO: 70的DVD重链氨基酸序列；以及选自SEQ ID NO: 69和SEQID NO: 71的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合NGF (seq. 2)和TNF-α的结合蛋白包含SEQ ID NO: 68的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO:69的DVD轻链氨基酸序列。在另ー个实施方案中，能够结合NGF (seq. 2)和TNF-α的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO: 70的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO: 71的DVD轻链氨基酸序列。在ー个第三实施方案中，能够结合NGF (seq. 2)和TNF-α的结合蛋白包含选自SEQ ID NO: 72和SEQ ID NO: 74的DVD重链氨基酸序列；以及选自SEQ ID NO: 73和SEQID NO: 75的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合NGF (seq. 2)和TNF-α的结合蛋白包含SEQ ID NO: 72的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO:73的DVD轻链氨基 酸序列。在另ー个实施方案中，能够结合NGF (seq. 2)和TNF-α的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO: 74的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO: 75的DVD轻链氨基酸序列。在一个第四实施方案中，能够结合NGF (seq. 2)和TNF-α的结合蛋白包含选自SEQ ID NO: 76和SEQ ID NO: 78的DVD重链氨基酸序列；以及选自SEQ ID NO: 77和SEQID NO: 79的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合NGF (seq. 2)和TNF-α的结合蛋白包含SEQ ID NO: 76的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO:77的DVD轻链氨基酸序列。在另ー个实施方案中，能够结合NGF (seq. 2)和TNF-α的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO: 78的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO: 79的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合NGF (seq. 2)和ILl-β的结合蛋白包含选自SEQID NO: 80和SEQ ID NO: 82的DVD重链氨基酸序列；以及选自SEQ ID NO: 81和SEQ IDNO: 83的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合NGF (seq. 2)和ILl-β的结合蛋白包含SEQ ID NO: 80的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO: 81的DVD轻链氨基酸序列。在另ー个实施方案中，能够结合NGF (seq. 2)和ILl-β的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO: 82的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO: 83的DVD轻链氨基酸序列。在ー个第二实施方案中，能够结合NGF (seq. 2)和ILl-β的结合蛋白包含选自SEQ ID NO: 84和SEQ ID NO: 86的DVD重链氨基酸序列；以及选自SEQ ID NO: 85和SEQID NO: 87的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合NGF (seq. 2)和ILl-β的结合蛋白包含SEQ ID NO: 84的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO: 85的DVD轻链氨基酸序列。在另ー个实施方案中，能够结合NGF (seq. 2)和ILl-β的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO: 86的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO: 87的DVD轻链氨基酸序列。在ー个第三实施方案中，能够结合NGF (seq. 2)和ILl-β的结合蛋白包含选自SEQ ID NO: 88和SEQ ID NO: 90的DVD重链氨基酸序列；以及选自SEQ ID NO: 89和SEQID NO: 91的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合NGF (seq. 2)和ILl-β的结合蛋白包含SEQ ID NO: 88的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO: 89的DVD轻链氨基酸序列。在另ー个实施方案中，能够结合NGF (seq. 2)和ILl-β的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO: 90的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO: 91的DVD轻链氨基酸序列在一个第四实施方案中，能够结合NGF (seq. 2)和ILl-β的结合蛋白包含选自SEQ ID NO:92和SEQ ID NO: 94的DVD重链氨基酸序列；以及选自SEQ ID NO: 93和SEQID NO: 95的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合NGF (seq. 2)和ILl-β的结合蛋白包含SEQ ID NO: 92的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO: 93的DVD轻链氨基酸序列。在另ー个实施方案中，能够结合NGF (seq. 2)和ILl-β的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO: 94的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO: 95的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合NGF (seq. 2)和IL-6R的结合蛋白包含选自SEQ IDNO:96和SEQ ID NO: 98的DVD重链氨基酸序列；以及选自SEQ ID NO: 97和SEQ ID NO:99的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合NGF (seq. 2)和IL-6R的结合蛋白包含SEQ ID NO: 96的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO: 97的DVD轻链氨基酸序列。在另ー个实施方案中，能够结合NGF (seq. 2)和IL-6R的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO: 98的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO: 99的DVD轻链氨基酸序列。在另ー个实施方案中，本发明提供包含多肽链的结合蛋白，其中所述多肽链包含VDl- (Xl)n-VD2-C- (X2) n，其中VDl是从第一个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第一个重链可变结构域；VD2是从第二个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第二个重链可变结构域；C是重链恒定结构域；(XDn是接头，条件是它不是CH1，其中所述(Xl)n存在或不存在；i(X2)n是Fe区，其中所述(X2) η存在或不存在。在一个实施方案中，Fe区不存在于结合蛋白中。在另ー个实施方案中，本发明提供包含多肽链的结合蛋白，其中所述多肽链包含VDl- (Xl)n-VD2-C- (X2) n，其中VDl是从第一个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第一个轻链可变结构域；VD2是从第二个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第二个轻链可变结构域；(是轻链恒定结构域；(Xl)n是接头，条件是它不是CH1，其中所述(Xl)n存在或不存在；i(X2)n不包含Fe区，其中所述(X2) η存在或不存在。在一个实施方案中，(Χ2)η不存在于结合蛋白中。在另ー个实施方案中，本发明的结合蛋白包含第一个和第二个多肽链，其中所述第一个多肽链包含第一个VDl- (Xl)n-VD2-C- (X2) n，其中VDl是从第一个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第一个重链可变结构域；VD2是从第二个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第二个重链可变结构域；(是重链恒定结构域；(Xl)n是接头，条件是它不是CH1，其中所述(Xl) η存在或不存在；i(X2)n是Fe区，其中所述(X2) η存在或不存在；且其中所述第二个多肽链包含第二个VDl- (Xl)n-VD2-C- (X2) n，其中VDl是从第一个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第一个轻链可变结构域；VD2是从第二个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第二个轻链可变结构域；(是轻链恒定结构域；(Xl)n是接头，条件是它不是CH1，其中所述(Xl)n存在或不存在；i(X2)n不包含Fe区，其中所述(X2)η存在或不存在。在另ー个实施方案中，结合蛋白包含两个第一个多肽链和两个第二个多肽链。在另ー个实施方案中，(Χ2)η不存在于第二个多肽中。在另ー个实施方案中，Fe区如果存在于第一个多肽中，则其选自天然序列Fe区和变体序列Fe区。在另ー个实施方案中，Fe区选自来自IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE 和 IgD 的 Fe 区。在另ー个实施方案中，本发明的结合蛋白是能够结合两个抗原、包含四个多肽链的DVD-Ig，其中，第一个和第三个多肽链包含VDl- (Xl)n-VD2-C- (X2)n，其中VDl是从第一个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第一个重链可变结构域；VD2是从第二个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第二个重链可变结构域；(是重链恒定结构域；(Xl) η是接头，条件是它不是CH1，其中所述(Χ1)η存在或不存在；i(X2)n是Fe区，其中所述(X2)n存在或不存在；且其中所述第二个和第四个多肽链包含VDl- (Xl)n-VD2-C- (X2)n，其中VDl是从第一个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第一个轻链可变结构域；VD2是从第二个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第二个轻链可变结构域；C是轻链恒定结构域；(Xl) η是接头，条件是它不是CH1，其中所述(Χ1)η存在或不存在；i(X2)n不包含Fe区，其中所述(X2)n存在或不存在。
本发明提供通过预选择亲本抗体制备DVD-Ig结合蛋白的方法。在一个实施方案中，制备能够结合两个抗原的双重可变结构域免疫球蛋白的方法包含步骤a)获得能够结合第一个抗原的第一个亲本抗体或其抗原结合部分；b)获得能够结合第二个抗原的第二个亲本抗体或其抗原结合部分；c)构建包含VDl- (Xl)n-VD2-C- (X2) η的第一个和第三个多肽链，其中VDl是从所述第一个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第一个重链可变结构域；VD2是从所述第二个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第二个重链可变结构域；C是重链恒定结构域；(Xl)n是接头，条件是它不是CH1，其中所述(Xl)n存在或不存在；i(X2)n是Fe区，其中所述(X2) η存在或不存在；d)构建包含VDl- (Xl)n-VD2_C- (X2)n的第二个和第四个多肽链，其中VDl是从所述第一个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第一个轻链可变结构域；VD2是从所述第二个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第二个轻链可变结构域；C是轻链恒定结构域；(Xl)n是接头，条件是它不是CH1，其中所述(Xl)n存在或不存在；i(X2) η不包含Fe区，其中所述(Χ2) η存在或不存在；e)表达所述第一个、第二个、第三个和第四个多肽链；从而生成能够结合所述第一个和所述第二个抗原的双重可变结构域免疫球蛋白。在另ー个实施方案中，本发明提供生成具有所需特性的能够结合两个抗原的双重可变结构域免疫球蛋白的方法，包含步骤a)获得第一个亲本抗体或其抗原结合部分，其能够结合第一个抗原且具有至少ー个由双重可变结构域免疫球蛋白表现的所需特性；b)获得第二个亲本抗体或其抗原结合部分，其能够结合第二个抗原且具有至少ー个由双重可变结构域免疫球蛋白表现的所需特性；c)构建包含VDl- (Xl)n-VD2-C- (X2)n的第一个和第三个多肽链，其中VDl是从所述第一个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第一个重链可变结构域；VD2是从所述第二个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第二个重链可变结构域；C是重链恒定结构域；(XI )n是接头，条件是它不是CH1，其中所述(XI )n存在或不存在；且(X2)η是Fe区，其中所述(X2)n存在或不存在；d)构建包含VDl- (Xl)n-VD2_C- (X2)n的第二个和第四个多肽链，其中VDl是从所述第一个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第一个轻链可变结构域；VD2是从所述第二个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第二个轻链可变结构域；(是轻链恒定结构域；(Xl)n是接头，条件是它不是CH1，其中所述(Xl)n存在或不存在；i(X2) η不包含Fe区，其中所述(Χ2) η存在或不存在；e)表达所述第一个、第二个、第三个和第四个多肽链；从而生成具有所需特性的能够结合所述第一个和所述第二个抗原的双重可变结构域免疫球蛋白。在一个实施方案中，在此公开的第一个和第二个多肽链的VDl是从相同亲本抗体或其抗原结合部分获得的。在另ー个实施方案中，在此公开的第一个和第二个多肽链的VDl是从不同亲本抗体或其抗原结合部分获得的。在另ー个实施方案中，在此公开的第一个和第二个多肽链的VD2是从相同亲本抗体或其抗原结合部分获得的。在另ー个实施方案中，在此公开的第一个和第二个多肽链的VD2是从不同亲本抗体或其抗原结合部分获得的。在一个实施方案中，第一个亲本抗体或其抗原结合部分与第二个亲本抗体或其抗原结合部分是相同抗体。在另ー个实施方案中，第一个亲本抗体或其抗原结合部分与第二个亲本抗体或其抗原结合部分是不同抗体。
在一个实施方案中，第一个亲本抗体或其抗原结合部分结合第一个抗原，而第二个亲本抗体或其抗原结合部分结合第二个抗原。在具体实施方案中，第一个和第二个抗原是相同抗原。在另ー个实施方案中，亲本抗体结合相同抗原上的不同表位。在另ー个实施方案中，第一个和第二个抗原是不同抗原。在另ー个实施方案中，第一个亲本抗体或其抗原结合部分结合第一个抗原，其结合能力不同于第二个亲本抗体或其抗原结合部分结合第二个抗原的能力。在另ー个实施方案中，第一个亲本抗体或其抗原结合部分结合第一个抗原，其结合亲和力不同于第二个亲本抗体或其抗原结合部分结合第二个抗原的亲和力。在另ー个实施方案中，第一个亲本抗体或其抗原结合部分和第二个亲本抗体或其抗原结合部分选自人抗体、⑶R嫁接的抗体(⑶R grafted antibody)和人源化抗体。在一个实施方案中，抗原结合部分选自Fab片段、F(ab’)2片段、包含由铰链区的ニ硫键连接的2个Fab片段的ニ价片段；由VH和CHl结构域组成的Fd片段；由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段、dAb片段、分离的互补性决定区(CDR)、单链抗体和双抗体。在另ー个实施方案中，本发明的结合蛋白具有至少ー个由第一个亲本抗体或其抗原结合部分、或第二个亲本抗体或其抗原结合部分表现的所需特性。可替代的，第一个亲本抗体或其抗原结合部分和第二个亲本抗体或其抗原结合部分具有至少ー个由双重可变结构域免疫球蛋白表现的所需特性。在一个实施方案中，所需特性选自ー个或多个抗体參数。在另ー个实施方案中，抗体參数选自抗原特异性、对抗原的亲和力、能力、生物学功能、表位识别、稳定性、可溶性、生产效率、免疫原性、药物代谢动力学、生物利用率、组织交叉反应性、以及直向同源抗原結合。在一个实施方案中，结合蛋白是多价的。在另ー个实施方案中，结合蛋白是多特异性的。此处所述的多价和或多特异性结合蛋白具有特别从治疗观点来看需要的特性。例如，多价和或多特异性结合蛋白可以(I)经由细胞比ニ价抗体更快速内在化(和/或发生分解代谢)，所述细胞表达抗体与之结合的抗原；(2)是激动剂抗体；和/或(3)诱导表达多价抗体能够与之结合的抗原的细胞的细胞死亡和/或细胞凋亡。提供多价和或多特异性结合蛋白的至少ー种抗原结合特异性的“亲本抗体”可以是，经由表达抗体与之结合的抗原的细胞内在化(和/或发生分解代谢)的抗体；和/或可以是激动剂、细胞死亡诱导、和/或细胞凋亡诱导性抗体，且如本文所述的多价和或多特异性结合蛋白可以展示这些特性中的ー种或多种中的改善。此外,亲本抗体可以缺乏这些特性中的ー种或多种，但如此处所述构建为多价结合蛋白时可以赋予这些特性。在另ー个实施方案中，如通过表面等离振子共振测量的，本发明的结合蛋白具有的对于一种或多种祀的结合速率(on rate)常数(Kon)选自至少约ΙΟ 1 ;至少约愈、1 ;至少约倉、1 ;至少约IO5M-1S-1 ;和至少约lOVs'在一个实施方案中，如通过表面等离振子共振测量的，本发明的结合蛋白对于ー种或多种靶具有的结合速率常数(Kon)为 IO2MY1 至 IO3MY1 ; IO3MY1 至 IO4IT1S-1 JO4IT1S-1 至 IO5IT1S-1 ；或 IO5MY1 至10 '-1 之间。在另ー个实施方案中，如通过表面等离振子共振测量的，结合蛋白具有的对于ー种或多种靶的解离速率(off rate)常数(Koff)选自至多约ΙΟ、—1 ;至多约ΙΟ、—1 ;至多约KT5iT1 ;和至多约ΙΟΛΛ在一个实施方案中，如通过表面等离振子共振测量的，本发明的结合蛋白具有的对于ー种或多种靶的解离速率常数(Koff)为KT3iT1 — IO-4S-1 ^O-4S-1 一KTiV1 ;或 KTiV1 — KT6S'
在另ー个实施方案中，结合蛋白具有的对于ー种或多种靶的解离常数(Kd)选自至多约1(T7 M ;至多约1(T8 M ;至多约1(T9 M ;至多约10, M ;至多约l(Tn M ;至多约1(Γ12Μ;和至多10_13 Μ。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白具有的对于其靶的解离常数(Kd)为 1(Γ7 M — 1(Γ8 M ;1(Γ8 M — 1(Γ9 M ;1(Γ9 M — 1(Γ10 M ;1(Γ10 — 1(Γη M ;1(Γη M — 1(Γ12 M ;或10_12 — M 10_13 Mo在另ー个实施方案中，此处所述的结合蛋白是进一歩包含选自下述的试剂的缀合物免疫粘附分子、显像剂、治疗剂和细胞毒性剂。在一个实施方案中，显像剂选自放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记、和生物素。在另ー个实施方案中，显像剂是选自下述的放射性标记3H、14C、35S、9°Y、99Tc、mIn、125I、131I、177LU、166H0 和 153Sm0 在另一个实施方案中，治疗或细胞毒性剂选自抗代谢物、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂、蒽环类、毒素和细胞凋亡剂。在另ー个实施方案中，此处所述的结合蛋白是结晶结合蛋白且作为晶体存在。在一个实施方案中，晶体是无载体的药学控释晶体。在另ー个实施方案中，结晶结合蛋白具有比所述结合蛋白的可溶性配对物更长的体内半衰期。在另ー个实施方案中，结晶结合蛋白保留生物学活性。在另ー个实施方案中，此处所述的结合蛋白是糖基化的。例如，糖基化是人糖基化模式。本发明的ー个方面涉及编码此处公开的任何一种结合蛋白的分离的核酸。进一步的实施方案提供包含此处公开的分离的核酸的载体，其中所述载体选自pcDNA ；pTT(Durocher 等)K，Nucleic Acids Research 2002,第 30 卷，No. 2) ；pTT3 (具有另外的多克隆位点的 pTT ；pEFB0S (Mizushima, S.和 Nagata,S·，(WucIeic acids Research 第18 卷，No. 17) ；pBV ；pJV ；pcDNA3. I TOPO, pEF6 TOPO 和 pBJ。在一个实施方案中，该载体是在美国专利申请系列号61/021，282中公开的载体。在另ー个方面，宿主细胞用此处公开的载体转化。在一个实施方案中，宿主细胞是原核细胞。在另ー个实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌(E. coli)。在相关实施方案中，宿主细胞是真核细胞。在另ー个实施方案中，真核细胞选自原生生物细胞、动物细胞、植物细胞和真菌细胞。在另ー个实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞，包括但不限干，CHO, COS ； NS0、SP2、PER. C6或真菌细胞例如啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae);或昆虫细胞例如 Sf9 ο
在一个实施方案中，在单个重组宿主细胞中生产例如具有不同特异性的两个或更多个DVD-Ig。例如，已将抗体混合物的表达称为Oligoclonics ，(Merus B. V.，荷兰)美国专利号 7，262，028 ;7，429，486。本发明的另ー个方面提供了生产此处公开的结合蛋白的方法，所述方法包括在足以生产结合蛋白的条件下，在培养基中培养同样在此处公开的任何ー种宿主细胞。在ー个实施方案中，通过这种方法生产的50 % — 75 %的结合蛋白是双重特异性四价结合蛋白。在具体实施方案中，通过这种方法生产的75% — 90%的结合蛋白是双重特异性四价结合蛋白。在具体实施方案中，生产的90% — 95%的结合蛋白是双重特异性四价结合蛋白。一个实施方案提供了用于释放结合蛋白的组合物 ，其中所述组合物包含制剂，所述制剂又包含如此处公开的结晶结合蛋白和成分，以及至少ー种聚合载体。例如，聚合载体是选自下述的ー种或多种的聚合物聚丙烯酸、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基酸、聚酐、聚酯肽、聚酯、聚乳酸、乳酸-こ醇酸共聚物或PLGA、聚b-羟基丁酸酷、聚己内酷、聚ニ氧杂环己酮(poly(dioxanone))、聚こニ醇、聚(轻丙基)甲基丙烯酰胺、聚有机磷腈、聚原酸酯、聚こ烯醇、聚こ烯卩比咯烧酮、马来酐-烧基こ烯基醚共聚物、pluronic多元醇、清蛋白、藻酸盐、纤维素和纤维素衍生物、胶原、血纤蛋白、明胶、透明质酸、寡糖、糖胺聚糖(glycaminoglycans)、硫酸化多糖、掺合物及其共聚物。例如,成分选自清蛋白、鹿糖、海藻糖、乳糖醇(lactitol)、明胶、羟丙基-β-环糊精、甲氧基聚こニ醇和聚こニ醇。另ー个实施方案提供了用于治疗哺乳动物的方法，所述方法包括给哺乳动物施用有效量的此处公开的组合物的步骤。本发明还提供了药物组合物，所述药物组合物包含如此处公开的结合蛋白和药学可接受的载体。在进ー步的实施方案中，药物组合物包含用于治疗病症的至少ー种另外的治疗剂。例如，另外的试剂选自治疗剂，显像剂，细胞毒性剂，血管发生抑制剂(包括但不限于抗VEGF抗体或VEGF-trap);激酶抑制剂(包括但不限于KDR和TIE-2抑制剂);共刺激分子阻断剂(包括但不限于抗B7. I、抗B7. 2、CTLA4-Ig、抗⑶20);粘附分子阻断剂(包括但不限于抗LFA-I抗体、抗E/L选择蛋白抗体、小分子抑制剂);抗细胞因子抗体或其功能片段(包括但不限于抗IL-18、抗TNF、和抗IL-6/细胞因子受体抗体);氨甲蝶呤；环孢菌素；雷帕霉素；FK506 ;可检测标记或报道分子；TNF拮抗剂；抗风湿剂；肌肉弛缓剂，麻醉药，非类固醇消炎药(NSAID)，止痛剂，麻醉剂，镇静剂，局部麻酔剂，神经肌肉阻断剂；抗微生物剂，抗牛皮癣剂，皮质类固醇，促蛋白合成类固醇，促红细胞生成素,免疫接种,免疫球蛋白，免疫抑制剂，生长激素，激素替代药物，放射性药物，抗抑郁药，抗精神病药，刺激剤，哮喘药物治疗，β激动剂，吸入类固醇，肾上腺素或类似物，细胞因子，和细胞因子拮抗剂。在另ー个方面，本发明提供了用于治疗患有病症的人受试者的方法，在所述病症中能够由此处公开的结合蛋白结合的一种或多种靶是有害的，所述方法包括给人受试者施用此处公开的结合蛋白，从而使得人受试者中的一种或多种靶的活性被抑制，并且多种症状之ー减轻或达到治疗。例如，病症选自关节炎、骨关节炎、青少年慢性关节炎、脓毒性关节炎、莱姆关节炎、牛皮癣性关节炎、反应性关节炎、脊椎关节病、全身性红斑狼疮、Crohn氏病、溃疡性结肠炎、炎性肠病、胰岛素依赖性糖尿病、甲状腺炎、哮喘、变应性疾病、牛皮癣、皮炎硬皮病、移植物抗宿主病、器官移植排斥、与器官移植相关的急性或慢性免疫性疾病、肉状瘤病、动脉粥样硬化、弥散性血管内凝血、Kawasaki氏病、Grave氏病、肾病综合征、慢性疲乏综合征、,格纳氏肉芽肿病、过敏性紫癜(Henoch-Schoenlein purpurea)、肾显微血管炎、慢性活动性肝炎、葡萄膜炎、脓毒性休克、中毒性休克综合征、脓毒病综合征、恶病质、传染病、寄生虫病、获得性免疫缺陷综合征、急性横贯性脊髄炎、亨廷顿氏舞蹈病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、中风、原发性胆汁性肝硬变、溶血性贫血、恶性肿瘤、心カ衰竭、心肌梗死、Addison氏病、散发性多腺性I型缺乏和多腺性II型缺乏、Schmidt氏综合征、成人(急性)呼吸窘迫综合征、秀头、斑秀(alopecia areata)、血清反应阴性关节病(arthopathy)、关节病、Reiter氏病、牛皮癣性关节病、溃疡性结肠炎性关节病、肠病性滑膜炎、衣原体、耶尔森氏菌和沙门氏菌相关性关节病、脊椎关节病(spondyIoarthopathy)、动脉粥样化疾病/动脉硬化、特应性变态反应、自身免疫性大疱性疾病、寻常天疱疮、落叶状天疱疮、类天疱 疮、线性IgA疾病、自身免疫性溶血性贫血、Coombs阳性溶血性贫血、获得性恶性贫血、青少年性恶性贫血、肌痛脑炎/Royal Free疾病、慢性粘膜皮肤念珠菌病、巨细胞性动脉炎、原发性硬化性肝炎、隐原性自身免疫性肝炎、获得性免疫缺陷病综合征、获得性免疫缺陷相关病、こ型肝炎、丙型肝炎、常见的各种免疫缺陷(常见的可变低丙种球蛋白血症)、扩张型心肌病、女性不育、卵巢衰竭、过早卵巢衰竭、纤维化肺疾病、隐原性纤维化肺泡炎、炎症后间质性肺病、间质性肺炎、结缔组织病相关性间质性肺病、混合型结缔组织病相关性肺病、全身性硬皮病相关性间质性肺病、类风湿性关节炎相关性间质性肺病、全身性红斑狼疮相关性肺病、皮肌炎/多肌炎相关性肺病、Sjogren氏病相关性肺病、强直性脊柱炎相关性肺病、脉管炎性弥散性肺病、含鉄血黄素沉着病相关性肺病、药物诱导的间质性肺病、纤维化、放射性纤维化、闭塞性细支气管炎、慢性嗜酸性肺炎、淋巴细胞性浸润性肺病、传染后间质性肺病、痛风性关节炎、自身免疫性肝炎、I型自身免疫性肝炎(传统自身免疫性或狼疮样肝炎)、2型自身免疫性肝炎(抗LKM抗体肝炎)、自身免疫介导的低血糖、具有黑棘皮症的B型胰岛素耐受性、甲状旁腺机能減退、与器官移植相关的急性免疫性疾病、与器官移植相关的慢性免疫性疾病、骨关节病、原发性硬化性胆管炎、I型牛皮癣、2型牛皮癣、特发性白细胞减少(Ieucopaenia),自身免疫性嗜中性白细胞减少症、肾脏病N0S、肾小球肾炎(glomerulonephritides)、肾显微血管炎(vasulitis)、莱姆病、盘状红斑狼疮、特发性男性不育症或N0S、精子自身免疫性、多发性硬化(所有亚型)、交感性眼炎、结缔组织病继发的肺动脉高压、Goodpasture氏综合征、结节性多动脉炎的肺表现、急性风湿热、类风湿性脊椎炎、Still氏病、全身性硬皮病、Sjorgren氏综合征、Takayasu氏病/动脉炎、自身免疫性血小板減少症、特发性血小板減少症、自身免疫性甲状腺病、甲状腺机能亢进、甲状腺肿性(goitrous)自身免疫性甲状腺功能减退(Hashimoto氏病)、萎缩性自身免疫性甲状腺功能减退、原发性粘液性水肿、晶状体性(phacogenic)葡萄膜炎、原发性血管炎、白癜风急性肝病、慢性肝病、酒精性肝硬变、酒精诱导的肝损伤、胆汁郁积(choleosatatis)、特应性肝病、药物诱导的肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、变态反应和哮喘、B群链球菌(GBS)感染、精神障碍(例如，抑郁和精神分裂症)、Th2型和Thl型介导的疾病、急性和慢性痛(不同形式的疼痛)、以及癌症例如肺、乳腺、胃、膀胱、结肠、胰、卵巣、前列腺和直肠癌以及造血恶性肿瘤(白血病和淋巴瘤)、无β脂蛋白血症(Abetalipoprotemia)、手足发甜、急性和慢性寄生或感染过程、急性白血病、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞样白血病(AML)、急性或慢性细菌感染、急性胰腺炎、急性肾功能衰竭、腺癌、心房(aerial)异位搏动、AIDS痴呆复征、酒精诱导的肝炎、变应性結膜炎、过敏性接触性皮炎、变应性鼻炎、同种异体移植物排斥、Ct-I-抗胰蛋白酶缺乏、肌萎缩性侧索硬化、贫血、心绞痛、前角细胞(horn cell)变性、抗cd3治疗、抗磷脂综合征、抗受体超敏反应、主动脉和周围性动脉瘤(aneuryisms)、主动脉壁夹层形成、高动脉压、动脉硬化、动静脉瘘、共济失调、心房纤维颤动(持续性或阵发性)、心房扑动、房室传导阻滞、B细胞淋巴瘤、骨移植物排斥、骨髄移植(BMT)排斥、束支传导阻滞、Burkitt氏淋巴瘤、烧伤、心律失常、心脏震晕综合征、心脏肿瘤、心肌病、心肺分流术炎症应答、软骨移植排斥、小脑皮质变性、小脑病症、紊乱性或多源性房性心动过速、化学疗法相关病症、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性酒精中毒、慢性炎性病理学、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性阻塞性肺部疾病(C0PD)、慢性水杨酸盐中毒、结肠直肠癌、充血性心カ衰竭、結膜炎、接触性皮炎、肺源性心脏病、冠状动脉疾病、Creutzfeldt-Jakob病、培养物阴性脓毒病、囊性纤维化、细胞因子疗法相关病症、拳击员痴呆(Dementia pugilistica)、脱髓鞘病、登革出血热、皮炎、皮肤病学状况、多尿症(diabetes)、糖尿病、糖尿病性动脉硬化性(ateriosclerotic)疾病、弥漫性Lewy小体病、扩张性充血性心肌病、基底神经节病症、中年唐氏综合征、由阻断CNS多巴胺受体的药物诱导的药物诱导的运动障碍、药物敏感性、湿疹、脑脊髄炎、心内膜炎、内分泌病、会厌炎、EB病毒感染、红斑性肢痛病、锥体外束和小脑病症、家族性嗜血性(hematophagocytic)淋巴组织细胞增多症、胎儿胸腺移植排斥、Friedreich氏共济失调、功能性外周性动脉病症、真菌性脓毒病、气性坏疽病、胃溃疡、肾小球肾炎、任何器官或组织的移植物排斥、革兰氏阴性脓毒病、革兰氏阳性脓毒病、由于细胞内生物的肉芽肿、毛细胞性白血病、Hallerrorden-Spatz病、hashimoto氏甲状腺炎、枯草热、心脏移植排斥、血色素沉着症、血液透析、溶血性尿毒性综合征/血栓溶解性血小板减少性紫癜、出血、肝炎(A)、希氏束心律失常(arrythmias)、HIV感染/HIV神经病、何杰金氏病、运动过度性运动障碍、超敏反应、超敏感性肺炎、高血压、运动机能減退性运动障碍、下丘脑-垂体-肾上腺轴评价、特发性Addison氏病、特发性肺纤维化、抗体介导的细胞毒性、虚弱、婴儿型脊髄性肌萎縮、主动脉炎症、流行性感冒a、电离辐射照射、虹膜睫状体炎/葡萄膜炎/视神经炎、缺血性再灌注损伤、缺血性中风、青少年类风湿性关节炎、青少年脊髄性肌萎縮、卡波西氏肉瘤、肾移植排斥、军团杆菌、利什曼病、麻风病、皮层脊髓系统损伤、脂肪水肿、肝移植排斥、淋巴水肿(lymphederma)、疟疾、恶性淋巴瘤、恶性组织细胞增多症、恶性黑素瘤、脑膜炎、脑膜炎球菌血症、代谢性/特发性疾病、偏头痛、线粒体多系统病症、混合型结缔组织病、单克隆丙种球蛋白病、多发性骨髓瘤、多系统变性(MencelDejerine-Thomas Shi-Drager和Machado-Joseph)、重症肌无力、鸟胞内分支杆菌、结核分支杆菌、骨髄异常增生综合征、心肌梗死、心肌缺血性病症、鼻咽癌、新生儿慢性肺病、肾炎、肾变病、神经变性疾病、神经原性I肌萎缩、嗜中性粒细胞减少性发烧、非何杰金淋巴瘤、腹主动脉及其分支闭塞、闭塞性动脉病症、okt3治疗、睾丸炎/附睾炎(印idydimitis)、睾丸炎/输精管切除术逆转操作、器官巨大症、骨质疏松症、胰移植排斥、胰癌、恶性肿瘤的肿瘤相关综合征/高钙血症、甲状旁腺移植排斥、盆腔炎症性疾病、常年性鼻炎、心包疾病、外周性动脉粥样硬化(atherlosclerotic)疾病、外周血管病症、腹膜炎、恶性贫血、卡氏肺囊虫性肺炎、肺炎、POEMS综合征(多发性神经病、器官巨大症、内分泌病、单克隆丙种球蛋白病、和皮肤变化综合征)、灌注后综合征、泵后综合征、MI心切开术后综合征、先兆子痫、进行性 核上(supranucleo)麻痹、原发性肺动脉高压、放射治疗、Raynaud氏现象和疾病、Raynoud氏病、Refsum氏病、常规狭窄QRS心动过速、肾血管性高血压、再灌注损伤、限制性心肌病、肉瘤、硬皮病、老年性舞蹈病、Lewy小体型老年性痴呆、血清反应阴性关节病、中风、铼状细胞贫血、皮肤同种异体移植物排斥、皮肤变化综合征、小肠移植排斥、实体瘤、特殊心律失常(arrythmias)、脊髄性共济失调、脊髄小脑变性、链球菌肌炎、小脑结构损伤、亚急性硬化性全脑炎、晕厥、心血管系统梅毒、全身性过敏反应(anaphalaxis)、全身炎症反应综合征、全身发作性青少年类风湿性关节炎、T细胞或FAB ALL、毛细血管扩张、血栓闭塞性脉管炎、血小板減少症、毒性、移植物、创伤/出血、III型超敏反应、IV型超敏反应、不稳定心绞痛、尿毒症、尿脓毒病、荨麻疹、心脏瓣膜疾病、静脉曲张、血管炎、静脉疾病、静脉血栓形成、心室纤维性颤动、病毒和真菌感染、病毒性脑炎/无菌性脑膜炎、病毒相关性噬红细胞(hemaphagocytic)综合征、Wernicke-Korsakoff综合征、Wilson氏病、任何器官或组织的异种移植排斥。在一个实施方案中，可以用本发明的组合物和方法治疗或诊断的疾病包括但不限于原发性和转移性癌症，包括乳腺、结肠、直肠、肺、ロ咽、下咽、食道、胃、胰、肝、胆囊和胆管、小肠、尿道(包括肾、膀胱和尿道上皮)、女性生殖道(包括子宫颈、子宮和卵巣，以及绒毛膜癌和妊娠性滋养层细胞病)、男性生殖道(包括前列腺、精囊、睾丸和生殖细胞肿瘤)、内分 泌腺(包括甲状腺、肾上腺和脑下垂体)和皮肤的癌，以及血管瘤，黑素瘤，肉瘤(包括从骨和软组织产生的肉瘤以及卡波西氏肉瘤)，脑、神经、眼和脑膜(包括星形细胞瘤、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经瘤、成神经细胞瘤、神经鞘瘤(Schwannomas)和脑膜瘤)的肿瘤，从造血恶性肿瘤例如白血病和淋巴瘤(何杰金与非何杰金淋巴瘤)产生的实体瘤。本发明的DVD-Igs也可以治疗一种或多种下列疾病急性冠状动脉综合征、急性特发性多神经炎、急性炎性脱髓鞘性多发性神经根性神经病、急性缺血、成人still氏病、斑秃、过敏反应、抗磷脂抗体综合征、再生障碍性贫血、动脉硬化、特应性湿疹、特应性皮炎、自身免疫性皮炎、与链球菌感染相关的自身免疫性病症、自身免疫性肠病、自身免疫性听カ丧失、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性血小板减少症(AITP)、自身免疫性卵巢功能早衰、睑炎、支气管扩张、大疱性类天疱疮、心血管病、灾变性抗磷脂综合征、乳糜泻、颈椎关节强硬、慢性缺血、疤痕性类天疱疮、具有多发性硬化风险的临床孤立综合征(CIS)、結膜炎、儿童期发病性精神病、慢性阻塞性肺部疾病(C0PD)、泪囊炎、皮肌炎、糖尿病性视网膜病、糖尿病、椎间盘突出、盘脱垂、药物诱导的免疫性溶血性贫血、心内膜炎、子宮内膜异位、眼内炎、巩膜外层炎、多形性红斑、重型多形性红斑、妊娠期类天疱疮、Guillain-Barre综合征(GBS)、枯草热、Hughes综合征、特发性帕金森氏病、特发性间质性肺炎、IgE介导的变态反应、免疫性溶血性贫血、内含体肌炎、传染性眼炎性疾病、炎性脱髓鞘疾病、炎性心脏病、炎性肾病、IPF/UIP、虹膜炎、角膜炎、干燥性角膜結膜炎、Kussmaul病或Kussmaul-Meier病、Landry氏麻痹、朗格汉斯细胞组织细胞增多症、网状青斑、黄斑变性、恶性肿瘤、显微镜下多脉管炎、Morbus Bechterev、运动神经元病症、粘膜类天疱疮、多器官衰竭、重症肌无力、脊髄异常增生综合征、心肌炎、神经根障碍、神经病、非甲非こ型肝炎、视神经炎、骨质溶解、卵巢癌、少关节的JRA、周围动脉闭塞性疾病(PA0D)、周围血管疾病(PVD)、外周动脉疾病(PAD)、静脉炎、结节性多动脉炎(或结节性动脉外膜炎)、多软骨炎、风湿性多肌病、白发症、多关节的JRA、多发性内分泌缺陷综合征、多肌炎、风湿性多肌病(PMR)、泵后综合征、原发性帕金森综合征、前列腺和直肠癌以及造血恶性肿瘤(白血病和淋巴瘤)、前列腺炎、单纯红细胞再生障碍、原发性肾上腺机能不足、复发型视神经脊髓炎、再狭窄、风湿性心脏病、SAPHO (滑膜炎、痤疮、脓疱病、骨肥厚和骨炎)、硬皮病、继发性淀粉样变性、休克肺、巩膜炎、坐骨神经痛、继发性肾上腺机能不足、聚硅氧烷相关的结缔组织病、Sneddon-ffiIkinson皮肤病、关节强硬性脊椎炎、Stevens-Johnson综合征(SJS)、全身性炎症应答综合征、颞动脉炎、弓形体视网膜炎、中毒性表皮坏死松解、横贯性脊髄炎、TRAPS (肿瘤坏死因子受体，I型变态反应，II型糖尿病、荨麻疹、普通型间质性肺炎(UIP)、脉管炎、春季结膜炎、病毒性视网膜炎、Vogt-Koyanagi-Harada综合征(VKH综合征)、湿黄斑变性、伤ロ愈合、耶尔森氏菌和沙门氏菌相关关节病。在一个实施方案中，将本发明的抗体或其抗原结合部分在单独地或与放射治疗和/或其他化疗剂组合地使用时，用于治疗癌症或预防此处所述肿瘤的转移。在另ー个方面，本发明提供了治疗患有病症的患者的方法，所述方法包括在如此处讨论的第二种试剂施用之前、同时或之后，施用此处公开的任何一种结合蛋白的步骤。在具体实施方案中，第二种试剂选自布地萘德，表皮生长因子，皮质类固醇，环孢菌素，柳氮磺 吡啶，氨基水杨酸盐，6-巯基嘌呤，硫唑嘌呤，甲硝唑，脂肪加氧酶抑制剂，美沙拉秦，奥沙拉嗪，巴柳氮，抗氧化剂，血栓烷抑制剂，IL-I受体拮抗剂，抗IL-I β mAbs,抗IL-6或IL-6受体mAbs，生长因子，弹性蛋白酶抑制剂，吡啶基-咪唑化合物，TNF.LT, IL-I、IL_2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-18、IL-23、EMAP-II、GM-CSF、FGF 和 PDGF 抗体或激动剂，CD2、CD3、CD4、CD8、CD-19、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90 或其配体的抗体，氨甲蝶呤，环孢菌素，FK506，雷帕霉素，霉酚酸酷，来氟洛米，NSAIDs，布洛芬，皮质类固醇，强的松龙，磷酸ニ酯酶抑制剂，腺苷激动剂，抗凝剂，补体抑制剂，肾上腺素能药，IRAK,NIK, IKK, p38，MAP激酶抑制剂，IL-I β转换酶抑制剂，TNFa转换酶抑制剂，T细胞发信号抑制剂，金属蛋白酶抑制剂，柳氮磺吡啶，硫唑嘌呤，6-巯基嘌呤，血管紧张素转换酶抑制齐[J，可溶性细胞因子受体，可溶性Ρ55 TNF受体，可溶性p75 TNF受体，sIL_lRI、sIL_lRII、sIL-6R，抗炎细胞因子，IL-4、IL-10、IL-IU IL-13 和 TGFβ。在具体实施方案中，此处公开的药物组合物经由选自下述的至少ー种模式给患者施用肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内(intrarticular)、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宮内、膀胱内、快速灌注(bolus)、阴道、直肠、口腔含化、舌下、鼻内、和经皮。本发明的ー个方面提供针对本发明的至少ー种结合蛋白的至少ー种抗独特型抗体。抗独特型抗体包括包含分子的任何蛋白或肽，所述分子包含至少部分免疫球蛋白分子，例如但不限于，重或轻链的至少ー个互补性决定区(CDR)或其配体结合部分，重链或轻链可变区，重链或轻链恒定区，构架区，或其可以掺入本发明的结合蛋白内的任何部分。
图IA是双重可变结构域(DVD)-Ig构建体的示意图示，且显示了从2种亲本抗体产生DVD-Ig的策略；
图IB是构建体DVDl-Ig、DVD2-Ig，以及来自杂交瘤克隆2D13.E3(抗-IL-Ia )和13F5.G5 (抗-IL-I β )的2种嵌合单特异性抗体的示意图示。
发明详沭
本发明涉及能够结合2种或更多抗原的多价和/或多特异性结合蛋白。具体而言，本发明涉及双重可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)、及其药物组合物、以及用于制备此种DVD-Igs的核酸、重组表达载体和宿主细胞。本发明还包含了使用本发明的DVD-Igs在体外或体内检测特异性抗原的方法。除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。此外，除非上下文另有要求，単数术语应包括复数，且复数术语应包括単数。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此夕卜，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。同样，除非另有具体说明，术语例如“元件”或“组分”涵盖包含一个单位的元件和组分以及包含超过ー个亚单位的元件和组分。
一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的參考文献中所述的常规方法来进行，所述參考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。使用标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制、和递送、以及患者治疗。为了本发明可以更容易地理解，选择的术语在下文定义。如本文使用的，术语“多肽”指氨基酸的任何聚合链。术语“肽”和“蛋白”可与术语多肽互換使用，且同样指氨基酸的聚合链。术语“多肽”包含天然或人工蛋白、蛋白片段和蛋白序列的多肽类似物。多肽可以是单体或聚合的。除非另外与上下文矛盾，此处使用“多肽”意在包含多肽和其片段及变体(包括变体的片段)。对于抗原多肽，多肽片段任选含有至少ー个连续或非线性多肽表位。可以使用本领域普通方法确定至少ー个表位片段的精确边界。该片段包含至少约5个邻接氨基酸，例如至少约10个邻接氨基酸、至少约15个邻接氨基酸、或至少约20个邻接氨基酸。多肽变体如此处所述。术语“分离的蛋白”或“分离的多肽”是这样的蛋白或多肽，其由于其衍生起源或来源不与天然结合的组分结合，所述天然结合的组分在其天然状态下与其伴随；基本上不含来自相同物种的其他蛋白；由来自不同物种的细胞表达；或在自然界中不存在。因此，化学合成或在不同于其天然起源的细胞的细胞系统中合成的多肽将是与其天然结合的组分“分离的”。还可以通过分离，使用本领域众所周知的蛋白纯化技术，使得蛋白基本上不含天然结合的组分。如本文使用的，术语“回收”指通过分离，例如使用本领域众所周知的蛋白纯化技术，使得化学种类例如多肽基本上不含天然结合的组分的过程。如本文使用的，“生物学活性”指分子的任ー项或多项固有生物学特性(无论是如体内发现的那样天然存在的，还是通过重组方法提供或使成为可能的)。生物学特性包括但不限于结合受体；诱导细胞增殖，抑制细胞生长，诱导其他细胞因子，诱导细胞凋亡，和酶促活性。生物学活性也包括Ig分子的活性。
如本文使用的，关于抗体、蛋白、或肽与第二种化学种类相互作用的术语“特异性结合”或“特异地结合”，意指相互作用取决于化学种类上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别且与特定蛋白结构结合而不是一般地与蛋白結合。如果抗体对表位“A”特异，那么在包含标记的“A”和抗体的反应中，包含表位A的分子(或游离的，未标记的A)的存在将减少与抗体结合的标记的A的量。如本文使用的，术语“抗体”广泛地指包含4条多肽链ー 2条重(H)链和2条轻(L)链的任何免疫球蛋白(Ig)分子，或其保留Ig分子的基本表位结合特征的任何功能片段、突变体、变体或衍生。此种突变体、变体或衍生抗体形式是本领域已知的。其非限制性实施方案在下文讨论。在全长抗体中，每条重链包含重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含3个结构域CHI、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含I个结构域CL。VH和VL区可以进ー步细分成称为互补性决定区(CDR)的高变区，用称为构架区(FR)的较保守区域点綴。每个VH和VL由3个⑶Rs和4个FRs组成，以下列顺序从氨基末端到羧基末端排列FR1、⑶R1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和 IgY)、种类(例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2)或亚类。术语“Fe区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区域，它可以通过完整抗体的木瓜蛋白酶消化来产生。Fe区可以是天然序列Fe区或变体Fe区。免疫球蛋白的Fe区一般包含2个恒定结构域一 CH2结构域和CH3结构域，且任选包含CH4结构域。Fe部分中改变抗体效应子功能的氨基酸残基替换是本领域已知的(Winter等人，美国专利号5，648，260和5，624，821)。抗体的Fe部分介导几种重要的效应子功能，例如细胞因子诱导、ADCC、吞噬作用、依赖补体的细胞毒性(CDC)以及抗体和抗原-抗体复合物的半衰期/清除率。取决于治疗目的，在一些情况下这些效应子功能对于治疗抗体是所需的，但在其他情况下可能是不必要的或甚至有害的。某些人IgG同种型，特别是IgGl和化63，经由分别与？(￥1^和补体Clq结合介导ADCC和⑶C。新生Fe受体(FcRn)是决定抗体循环半衰期的关键组分。在另外ー个实施方案中，至少ー个氨基酸残基在抗体恒定区例如抗体Fe区中进行替换，从而使得抗体的效应子功能被改变。免疫球蛋白的2条相同重链的ニ聚化由CH3结构域的ニ聚化来介导，且通过铰链区内的ニ硫键来稳定(Huber等人，Nature ；264 :415-20 ；Thies等人，1999 J Mol Biol ；293 :67-79.)。铰链区内的半胱氨酸残基突变以阻止重链-重链ニ硫键将使CH3结构域的ニ聚化不稳定。负责CH3 ニ聚化的残基已得到鉴定(Dall’Acqua 1998Biochemistry 37:9266-73·)。因此,可能产生单价半-Ig。有趣的是，已在自然界中发现关于 IgG 和 IgA 亚类的这些单价半 Ig 分子(Seligman 1978 Ann Tmmunol 129:855-70;Biewenga 等人，1983 Clin Exp Tmmunol 51:395-400)。FcRn :Ig Fe 区的化学计量已测定为 2:1 (West 等人，2000 Biochemistry 39 :9698_708)，且半 Fe 足以介导 FcRn 结合(Kim等人，1994 Eur J Immunol ;24 :542-548.)。破坏CH3结构域ニ聚化的突变可能对其FcRn结合没有更大的不利作用，因为对于CH3 ニ聚化重要的残基位于CH3 b折叠结构的内界面上，而负责FcRn结合的区域位于CH2-CH3结构域的外界面上。然而，由于其比常规抗体的那种更小的尺寸，半Ig分子可以在组织穿透中具有某些优点。在一个实施方案中，至少ー个氨基酸残基在本发明的结合蛋白的恒定区例如Fe区中进行替换，从而使得重链的ニ聚、化被破坏，从而产生半DVD Ig分子。IgG的抗炎症活性取决于IgG Fe片段N-联聚糖的唾液酸化作用。已经确定了对抗炎症活性准确的聚糖要求，这样就可以生成合适的IgGl Fe片段，从而生成具有大大增强的能力的完全重组的唾液酸化IgGl Fe (Anthony, R. Μ.，等人(2008) Science 320:373-376)。如本文使用的，术语抗体的“抗原结合部分”(或简单地“抗体部分”)，指保留与抗原特异性结合的能力的ー种或多种抗体片段。已显示抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来执行。此种抗体实施方案也可以是双特异性、双重特异性、或多特异性形式；与2种或更多不同抗原特异性结合。包含在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的例子包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CHl结构域组成的单价片段；(ii ) F (ab’)2片段，包含由铰链区的ニ硫键连接的2个Fab片段的ニ价片段；(iii)由V H和CHl结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(V) dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341 :544-546, Winter 等人，PCT 公开 WO 90/05144 Al，其通过參考引入本文)，它包含单个可变结构域；和(vi)分离的互补性决定区(⑶R)。此外，尽管Fv片段的2个结构域VL和VH由分开的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成接头来连接，所述合成接头使得它们能够作为单条蛋白链制备，在所述单条蛋白链中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链 Fv (scFv);參见，例如，Bird 等人，(1988) Science 242 :423-426 ;和 Huston等人，(1988)/￥oc. Natl. Acad. Sci. USA 85 5879-5883)0 此种单链抗体也预期包含在术语抗体的“抗原结合部分”内。也包含其他形式的单链抗体例如双抗体。双抗体是ニ价、双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单条多肽链上表达，但使用的接头太短而不允许相同链上的2个结构域之间的配对，从而促使结构域与另一条链的互补结构域配对且产生2个抗原结合部位(參见例如，Holliger, P.等人，(1993)Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448 ；Poljak,R. J.等人，(1994)泣rwciare 2:1121-1123)。此种抗体结合部分是本令页域己知的(Kontermann 和 Dubel eds. , Antibody EnRineerinR(2001 )SprinRer-VerlaR.New York.第790页(ISBN 3-540-41354-5)。此外，单链抗体还包括包含一对串联Fv区段(VH-CH1-VH-CH1)的“线性抗体”，所述串联Fv区段连同互补轻链多肽一起形成ー对抗原结合区域(Zapata 等人，Protein Eng. 8 (10): 1057-1062 (1995);和美国专利号 5，641，870)。术语“多价结合蛋白”在本说明书自始至终用于指包含2种或更多抗原结合部位的结合蛋白。在一个实施方案中，多价结合蛋白经工程改造为具有3个或更多抗原结合部位，且一般不是天然存在的抗体。术语“多特异性结合蛋白”指能够结合2种或更多相关或无关靶的结合蛋白。本发明的双重可变结构域(DVD)结合蛋白包含2个或更多抗原结合部位，且是四价或多价结合蛋白。DVDs可以是单特异性的，即能够结合一种抗原，或多特异性的，即能够结合2种或更多抗原。包含2条重链DVD多肽和2条轻链DVD多肽的DVD结合蛋白称为DVD-Ig。每一半DVD-Ig包含重链DVD多肽，和轻链DVD多肽，和2个抗原结合部位。每个结合部位包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其中每个抗原结合部位总共6个涉及抗原结合的CDRs。如本文使用的，术语“双特异性抗体”指通过下述产生的全长抗体，四源杂交瘤技术(參见 Milstein，C.和 A. C. Cuello,Nature, 1983. 305 (5934):第 537-40 页)，2 种不同单克隆抗体的化学缀合(參见Staerz，U. D.等人，Nature，1985. 314(6012):第628-31页)，或结进孔或在Fe区中引入突变的类似方法(參见Holliger,P. ,T. Prosperc^PG. Winter,Proc Natl Acad Sci U S A, 1993. 90 (14):第 6444-8. 18 页)，从而导致其中只有ー种是功能性双特异性抗体的多种不同免疫球蛋白种类。通过分子功能，双特异性抗体结合其2个结合臂之ー(I对HC/LC)上的ー种抗原(或表位)，且结合其第二个臂(不同对的HC/LC)上的不同抗原(或表位)。通过这个定义，双特异性抗体具有2个不同的抗原结合臂(在特异性和CDR序列中)，且对于其结合的每种抗原是单价的。如本文使用的，术语“双重特异性抗体”指可以在其2个结合臂的每ー个中(ー对HC/LC)结合2种不同抗原(或表位)的全长抗体(參见PCT公开WO 02/02773)。因此，双重特异性结合蛋白具有2个相同的抗原结合臂，具有相同的特异性和相同的CDR序列，且对于其结合的每种抗原是ニ价的。结合蛋白的“功能性抗原结合部位”是能够结合靶抗原的结合部位。抗原结合部位的抗原结合亲和力不必与抗原结合部位由其衍生的亲本抗体ー样强，但结合抗原的能力必须是可使用已知用于评估与抗原结合的抗体的多种方法中的任何ー种测量的。此外，本文的多价抗体的每个抗原结合部位的抗原结合亲和力无需在量上相同。 术语“细胞因子”是由ー种细胞群体释放的蛋白的一般术语，所述蛋白作为细胞间介质作用于另ー种细胞群体。此种细胞因子的例子是淋巴因子、单核因子、和传统的多肽激素。在细胞因子中包括的是生长激素例如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素、和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素例如促卵胞激素(FSH)，促甲状腺激素(TSH)，和黄体生成素(LH);肝生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子α和β ;米勒抑制物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO);神经生长因子例如NGF-α ;血小板生长因子；胎盘生长因子；转化生长因子(TGFs)例如TGF-a和TGF-β ;胰岛素样生长因子-1和-11 ;促红细胞生成素(EPO);骨诱导因子；干扰素例如干扰素-α、-β和-Y集落刺激因子(CSFs)例如巨噬细胞-CSF (M-CSF);粒细胞巨噬细胞-CSF (GM-CSF);和粒细胞-CSF (G-CSF);白细胞介素(ILs)例如 IL_1、IL-2、IL-3、IL_4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10, IL-IU IL-12、IL-13, IL-15、IL-18, IL-21、IL-22、IL-23、IL-33 ;肿瘤坏死因子例如TNF- a或TNF- β ;及其他多肽因子包括LIF和kit配体(KL)0如本文使用的，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养的蛋白，以及天然序列细胞因子的生物学活性等价物。术语“接头”用于指包含通过肽键连接的2个或更多氨基酸残基的多肽，且用于连接ー个或多个抗原结合部分。此种接头多肽是本领域众所周知的(參见例如，Holliger,P.等人，(1993)/￥oc. Natl. Acad. Sci. "5 並6444-6448 ;Poljak，R. J.等人，(1994)Structure 2:1121-1123)。示例性接头包括但不限于，AKTTPKLEEGEFSEAR (SEQ ID NO: I);AKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO:2) ；AKTTPKLGG (SEQ ID NO:3) ；SAKTTPKLGG (SEQ IDN0:4) ； SAKTTP (SEQ ID N0:5) ； RADAAP (SEQ ID NO:6) ；RADAAPTVS (SEQ ID N0:7)；RADAAAAGGPGS (SEQ ID NO:8) ；RADAAAA (G4S)4 (SEQ ID NO:9) ；SAKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO:10) ；ADAAP (SEQ ID NO:11) ；ADAAPTVSIFPP (SEQ ID NO:12) ；TVAAP (SEQ IDNO:13) ；TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO:14) ；QPKAAP (SEQ ID NO: 15) ；QPKAAPSVTLFPP (SEQID NO: 16) ；AKTTPP (SEQ ID NO: 17) ；AKTTPPSVTPLAP (SEQ ID NO: 18) ；AKTTAP (SEQ IDNO:19) ；AKTTAPSVYPLAP (SEQ ID NO:20) ；ASTKGP (SEQ ID NO:21) ；ASTKGPSVFPLAP (SEQID NO: 22)， GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 23); GENKVEYAPALMALS (SEQ ID NO: 24);GPAKELTPLKEAKVS (SEQ ID NO: 25);以及 GHEAAAVMQVQYPAS (SEQ ID NO: 26)。“免疫球蛋白恒定结构域”指重或轻链恒定结构域。人IgG重链和轻链恒定结构域氨基酸序列是本领域已知的。如本文使用的，术语“单克隆抗体”或“mAb”指从基本上均质抗体群体中获得的抗体，即构成群体的个别抗体是相同的，除了可以少量存在的可能天然存在的突变。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原。此外，与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂形成对照，每种mAb针 对抗原上的单ー决定簇。修饰语“单克隆”不应解释为需要通过任何具体方法生产抗体。如本文使用的，术语“人抗体”预期包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括例如在CDRs且特别是CDR3中，不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，在体外通过随机或位点专ー诱变或在体内通过体细胞突变引入的突变)。然而，如本文使用的，术语“人抗体”不预期包括其中来源于另ー种哺乳动物物种例如小鼠种系的CDR序列已嫁接到人构架序列上的抗体。如本文使用的，术语“重组人抗体”预期包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如使用转染到宿主细胞内的重组表达载体表达的抗体(在下文部分IIC中进ー步描述),从重组、组合人抗体文库中分离的抗体(Hoogenboom H. R. , (1997) TIBTech. 15 :62-70 ;Azzazy H.和 Highsmith W. Ε·，(2002) C7i/ . Biochem. 35:425-445;Gavilondo J. V.和 Larrick J. ff. (2002)BioTechniques 29 :128-145 ;Hoogenboom H.和Chames P. (2000)Immunology Today 21 :371-378),从对于人免疫球蛋白基因是转基因的动物(例如小鼠)中分离的抗体(參见Taylor, L. D.等人，(1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295 ;Kellermann S-A.矛ロ Green L. L.Current Opinion in Biotechnology13 :593-597 ；Little M.等尺，CZmWlimunology Today 21 :364_370)，或通过包括使人免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列剪接的任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。此种重组人抗体具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区。然而，在某些实施方案中，对此种重组人抗体实施体外诱变(或，当使用对于人Ig序列转基因的动物时，体内体细胞诱变)，且因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是，尽管来源于人种系VH和VL序列且与人种系VH和VL序列相关，但可能在体内的人抗体种系谱内非天然存在的序列。“亲和力成熟的”抗体是在其ー个或多个CDRs中具有一种或多种改变的抗体，与没有这些改变的亲本抗体相比较，所述改变导致抗体对抗原的亲和カ改善。示例性的亲和力成熟的抗体将对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。亲和カ成熟的抗体通过本领域已知的程序来产生。Marks等)K，BidlTechnology 10:779-783 (1992)描述了通过VH和VL结构域改组的亲和カ成熟。CDR和/或构架残基的随机诱变由下述描述=Barbas等)k，Proc Nat. Acad. Sci, USA 91 :3809-3813 (1994) ;Schier 等人，Gene 169 :147- 155(1995) ;Yelton 等人，J. Tmmunol. 155:1994-2004 (1995) ； Jackson 等人，J. Immunol.154 (7) :3310-9 (1995) ;Hawkins 等人，プ Mol. BioL 226:889-896 (1992)以及如美国专利US6914128B1中所述的由活性增强氨基酸残基在选择性诱变位置、接触或高变位置的选择性突变。术语“嵌合抗体”指包含来自一个物种的重和轻链可变区序列以及来自另ー个物种的恒定区序列的抗体，例如具有与人恒定区连接的鼠重和轻链可变区的抗体术语“⑶R嫁接的抗体”指包含来自一个物种的重和轻链可变区序列的抗体，但其中VH和/或VL的ー个或多个CDR区域的序列用另ー个物种的CDR序列替换，例如具有鼠重和轻链可变区的抗体，其中一个或多个鼠⑶Rs (例如，⑶R3)已用人⑶R序列替换。术语“人源化抗体”指包含来自非人物种(例如，小鼠)的重和轻链可变区序列的抗体，但其中至少部分VH和/或VL序列已改变成更“人样”，即更类似于人种系可变序列。一种类型的人源化抗体是CDR嫁接的抗体，其中将非人CDR序列引入人VH和VL序列以替换相应的人CDR序列。术语“人源化抗体”也是抗体或其变体、衍生物、类似物或片段，其与目的抗原免疫特异性结合，且包含基本上具有人抗体的氨基酸序列的构架(FR)区、和基本上具有非人抗体的氨基酸序列的互补决定区(CDR)。如此处使用的，在CDR上下文中的术语“基本上”指具有的氨基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%等同于非人抗体⑶R的氨基酸序列的⑶R。人源化抗体包含基本上所有至少ー个、且ー般为2个可变结构域(Fab、Fab’、F (ab’ ) 2、FabC、Fv)，其中所有或基本上所有CDR区对应非人免疫球蛋白(即，供体抗体)的那些，且所有或基本上所有构架区是人免疫球蛋白共有序列的那些。在一个实施方案中，人源化抗体也包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fe)，一般为人免疫球蛋白的那种。在一些实施方案中，人源化抗体包含轻链以及至少重链的可变结构域。抗体还可以包括重链的CHl、铰链、CH2、CH3、和CH4区。在一些实施方案中，人源化抗体只包含人源化轻链。在一些实施方案中，人源化抗体只包含人源化重链。在具体实施方案中，人源化抗体只包含轻链的人源化可变结构域和/或人源化重链。术语“ Kabat编号”、“ Kabat定义”和“Kabat标记”在本文中可互换使用。本领域公认的这些术语指氨基酸残基编号系统，所述氨基酸残基比抗体或其抗原结合部分的重和轻链可变区中的其他氨基酸残基更可变(即高变)(Kabat等人，(1971 从/w. NY Acad, Sci.190 382~391 和 Kabat, E. A.等人，(1991) Sequences of Proteins of IimunologicalInterest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH
发明者J.刘, M.P.霍诺尔, R.V.卡马思, T.哈于尔 申请人:雅培制药有限公司