专利名称：眼袋脂肪间质细胞的分离保存及其培养扩增方法
技术领域：
本发明涉及人体眼袋脂肪间质细胞的分离保存方法和眼袋脂肪间质细胞的培养扩增方法。
背景技术：
眼袋脂肪间质细胞的提取与应用是一项新课题，目前尚未见到相关报道。
发明内容
本发明的目的就是针对现有技术之不足，而提供一种眼袋脂肪间质细胞的分离保存及其培养扩增方法，它可以提取眼袋间质细胞并长期保存和大量培养，培养出来到间质细胞可用于促进皮肤创面愈合、促进糖尿病溃疡愈合、促进心肌损伤的修复、促进肝功能损伤的修复。本发明的技术解决措施如下1、眼袋脂肪间质细胞的分离保存方法，1)、在净化工作台下，将眼袋脂肪组织从无菌容器中移出，放入无菌器皿中；2)、加入无菌的且含有抑菌剂的渗透压为270-330m0sm/kg的磷酸盐缓冲溶液，轻轻冲洗后，移出磷酸盐缓冲溶液；3)、用手术剪快速将组织剪碎，尽量剔除黄色部分，直至组织块长宽高皆为l-2mm ；4)、再次加入磷酸盐缓冲溶液重悬组织块，200g-300g离心5分钟，弃去上层磷酸盐缓冲溶液，选取下层沉淀组织块备用；5)、取6孔孔培养板，每孔用眼科镊植入一枚至多枚组织块，用盖玻片加压盖住，加入少量贴壁培养基至润湿底面；6)、按M孔板计算，每孔加入已配制完全的间充质干细胞培养液0. 3-0. 5ml，在36-380C 1% -5% CO2条件下培养48h后，每孔再加入0. 3-0. 5ml已配制完全的间充质干细
胞培养液，每3天半量换液一次；7)、组织块植入约3天，当组织块周围可见有散在的长梭形细胞时，每3天半量换液一次；8)、至每孔培养的原代细胞增至70% 80%融合；9)、移出培养板中的培养基，每孔加入1-1. 5ml无菌磷酸盐缓冲溶液，用吸管吸取磷酸盐缓冲溶液轻柔的冲洗培养层，移去磷酸盐缓冲溶液，重复一次；10)、每孔加入0. 2ml消化液，使充分浸润后轻摇培养瓶，约1_3分钟，肉眼观察瓶壁半透明的细胞层，当见到出现细针孔空隙时，弃去消化液，并加入Iml完全培养基终止消化；11)、用吸管吸取细胞悬液，轻柔的冲洗培养层后，收集细胞悬液于无菌容器中，混勻，取样细胞计数；
12)、取300g，在4°C温度条件下，离心5min后，弃去上清液；13)、采用差速贴壁法，弃去30分钟内的贴壁细胞，未贴壁细胞继续贴壁培养，弃去1小时内未贴壁的细胞；14)、筛选出的贴壁细胞采用密度为1. 073g/ml-l. 077g/ml的淋巴细胞分离液，采用密度梯度离心法离心；15)、将分层筛选出的细胞用IOml间充质干细胞培养基吹打混勻，传入2个T75培养瓶，每个培养瓶中补足5ml间充质干细胞培养基，在37°C、5% C02条件下培养；16)、传代细胞生长至亚汇合状态；17)、使用含有7% -10%的二甲基亚砜组分的冻存液冻存脂肪间质细胞。所述抑菌剂为0. 002 % -0.01%的苯扎氯铵配置在PBS中，每毫升PBS含有卡那霉素 20-100 毫克；PBS 的配方为称取 NaC18g、KC10. 2g、Na2HP04 · 12H203. 489g、KH2P040. 2g,溶于900ml左右的三蒸水中，用HCl或NaOH调整PH值至7. 3-7. 4之间。眼袋脂肪间质细胞培养扩增方法，1)、将已接种的脂肪间充质干细胞，在37°C、5%C02条件下培养达到70% 80%融合，2)、移出培养瓶中的培养基，每瓶加入5ml无菌磷酸盐缓冲溶液用吸管吸取磷酸盐缓冲溶液反复冲洗培养层后，移去磷酸盐缓冲溶液，重复一次；3)、加入3ml消化液，使充分浸润后轻摇培养瓶，约1_3分钟，肉眼观察瓶壁半透明的细胞层，当见到出现细针孔空隙时，弃去消化液，并加入5ml完全培养基终止消化；4)、用吸管吸取细胞悬液，反复冲洗培养层后，收集细胞悬液于无菌容器中，混勻，取样细胞计数；5)、300g，4°C，离心5分钟，弃去上清液；6)、将沉淀的细胞用间充质干细胞载体培养基吹打混勻，加入纸载体培养瓶中，在37°C条件下滚屏培养3-4天，准备冻存；7)、把细胞冻存液平衡到4°C ；8)、将消化液和新鲜培养基放置到室温中，间或摇动；9)、用75%乙醇消毒培养基瓶外壁，放置到超净台上；10)、将纸载体培养瓶取出，用75%乙醇棉球消毒瓶底；11)、用吸管吸弃旧培养基，更换吸管，加入等量细胞洗涤液，轻轻摇晃使其覆盖整个培养瓶，吸弃细胞洗涤液，更换吸管，重复洗涤一次；12)、加入25ml细胞消化液，旋转纸载体培养瓶，消化2分钟，吹打吸取消化液，终止消化；13)、再次加入25ml细胞消化液，旋转纸载体培养瓶，消化2分钟，吹打吸取消化液，终止消化。14)、合并消化液，300g, 4°C，离心5分钟，收集部分上清液，做细菌、支原体检测；15)、弃去其余上清液，细胞沉淀用适量4°C细胞冻存液悬浮；16)、细胞计数，调整细胞冻存密度至106/ml，将细胞悬液收集加入1. 8ml冷冻管中，标记细胞批次和密度于管壁外固定位置。所述消化液配方为称取胰蛋白酶0. Ig-O. 25，加入PH为7. 0-7. 4的100ml PBS，搅
拌均勻，使其完全溶解，过滤除菌后分装后置于4°C冰箱中即可。
本发明的有益效果在于它可以提取眼袋间质细胞并长期保存和大量培养，培养出来到间质细胞可用于促进皮肤创面愈合、促进糖尿病溃疡愈合、促进心肌损伤的修复、促进肝功能损伤的修复。
具体实施例方式实施例1、眼袋脂肪间质细胞的分离保存方法，1)、在净化工作台下，将眼袋脂肪组织从无菌容器中移出，放入无菌器皿中；2)、加入无菌的且含有抑菌剂的渗透压为270-330m0sm/kg的磷酸盐缓冲溶液，轻轻冲洗后，移出磷酸盐缓冲溶液；3)、用手术剪快速将组织剪碎，尽量剔除黄色部分，直至组织块长宽高皆为l-2mm ；4)、组织块加入再次加入磷酸盐缓冲溶液，200g-300g离心5分钟，弃去上层磷酸盐缓冲溶液，选取下层沉淀组织块备用；5)、取6孔孔培养板，每孔用眼科镊植入一枚或多枚组织块，用盖玻片加压盖住，加入少量贴壁培养基至润湿底面；6)、按M孔板计算，每孔加入已配制完全的间充质干细胞培养液03-0. 5ml，在36-380C 1% -5% CO2条件下培养48h后，每孔再加入0. 3-0. 5ml已配制完全的间充质干细
胞培养液，每3天半量换液一次；7)、组织块植入约3天，当组织块周围可见有散在的长梭形细胞时，每3天半量换液一次；8)、至每孔培养的原代细胞增至70% 80%融合；9)、移出培养板中的培养基，每孔加入1-1. 5ml无菌磷酸盐缓冲溶液，用吸管吸取磷酸盐缓冲溶液轻柔的冲洗培养层，移去磷酸盐缓冲溶液，重复一次；10)、每孔加入0. 2ml消化液，使充分浸润后轻摇培养瓶，一般消化时间控制在3分钟之内，肉眼观察瓶壁半透明的细胞层，当见到出现细针孔空隙时，弃去消化液，并加入Iml
完全培养基终止消化；11)、用吸管吸取细胞悬液，轻柔的冲洗培养层后，收集细胞悬液于无菌容器中，混勻，取样细胞计数；12)、取300g，在4°C温度条件下，离心5min后，弃去上清液；13)、采用差速贴壁法，弃去30分钟内的贴壁细胞，未贴壁细胞继续贴壁培养，弃去1小时内未贴壁的细胞；14)、筛选出的贴壁细胞采用密度为1. 073g/ml-l. 077g/ml的淋巴细胞分离液，采用密度梯度离心法离心；15)、将分层筛选出的细胞用IOml间充质干细胞培养基吹打混勻，传入2个T75培养瓶，每个培养瓶中补足5ml间充质干细胞培养基，在37°C、5% C02条件下培养；16)、传代细胞生长至亚汇合状态；17)、使用含有7% -10%的二甲基亚砜组分的冻存液冻存脂肪间质细胞。所述抑菌剂为0. 002 % -0.01%的苯扎氯铵配置在PBS中，每毫升PBS含有卡那霉素 20-100 毫克；PBS 的配方为称取 NaC18g、KC10. 2g、Na2HP04 · 12H203. 489g、KH2P040. 2g,溶于900ml左右的三蒸水中，用HCl或NaOH调整PH值至7. 3-7. 4之间。眼袋脂肪间质细胞培养扩增方法，1)、将已接种的脂肪间充质干细胞，在37°C、5%C02条件下培养达到70% 80%融合，2)、移出培养瓶中的培养基，每瓶加入5ml无菌磷酸盐缓冲溶液用吸管吸取磷酸盐缓冲溶液反复冲洗培养层后，移去磷酸盐缓冲溶液，重复一次；3)、加入3ml消化液，使充分浸润后轻摇培养瓶，一般消化时间控制在3分钟之内，肉眼观察瓶壁半透明的细胞层，当见到出现细针孔空隙时，弃去消化液，并加入5ml完全培养基终止消化；4)、用吸管吸取细胞悬液，反复冲洗培养层后，收集细胞悬液于无菌容器中，混勻，取样细胞计数；5)、300g，4°C，离心5分钟，弃去上清液；6)、将沉淀的细胞用间充质干细胞载体培养基吹打混勻，加入纸载体培养瓶中，在37°C条件下滚屏培养3-4天，准备冻存；7)、把细胞冻存液平衡到4°C ；8)、将消化液和新鲜培养基放置到室温中，间或摇动；9)、用75%乙醇消毒培养基瓶外壁，放置到超净台上；10)、将纸载体培养瓶取出，用75%乙醇棉球消毒瓶底；11)、用吸管吸弃旧培养基，更换吸管，加入等量细胞洗涤液，轻轻摇晃使其覆盖整个培养瓶，吸弃细胞洗涤液，更换吸管，重复洗涤一次；12)、加入25ml细胞消化液，旋转纸载体培养瓶，消化2分钟，吹打吸取消化液，终止消化；13)、再次加入25ml细胞消化液，旋转纸载体培养瓶，消化2分钟，吹打吸取消化液，终止消化。14)、合并消化液，300g, 4°C，离心5分钟，收集部分上清液，做细菌、支原体检测；15)、弃去其余上清液，细胞沉淀用适量4°C细胞冻存液悬浮；16)、细胞计数，调整细胞冻存密度至106/ml，将细胞悬液收集加入1. 8ml冷冻管中，标记细胞批次和密度于管壁外固定位置。所述消化液配方为称取胰蛋白酶0. Ig-O. 25，加入PH为7. 0-7. 4的100ml PBS，搅
拌均勻，使其完全溶解，过滤除菌后分装后置于4°C冰箱中即可。
权利要求
1.眼袋脂肪间质细胞的分离保存方法，其特征在于.1)、在净化工作台下，将眼袋脂肪组织从无菌容器中移出，放入无菌器皿中；.2)、加入无菌的且含有抑菌剂的渗透压为270-330m0sm/kg的磷酸盐缓冲溶液，轻轻冲洗后，移出磷酸盐缓冲溶液；.3)、用手术剪快速将组织剪碎，尽量剔除黄色部分，直至组织块大小约.2mm X 2mm X 2mm ；.4)、再次加入磷酸盐缓冲溶液重悬组织块，200g-300g离心5分钟，弃去上层磷酸盐缓冲溶液，选取下层沉淀组织块备用；.5)、取6孔孔培养板，每孔用眼科镊植入一枚至多枚组织块，用盖玻片加压盖住，加入少量贴壁培养基至润湿底面；.6)、按M孔板计算，每孔加入已配制完全的间充质干细胞培养液0.3-0. 5ml,在.36-380C 1% -5% CO2条件下培养48h后，每孔再加入0. 3-0. 5ml已配制完全的间充质干细胞培养液，每3天半量换液一次；.7)、组织块植入约3天，当组织块周围可见有散在的长梭形细胞时，每3天半量换液一次；.8)、至每孔培养的原代细胞增至70% 80%融合；.9)、移出培养板中的培养基，每孔加入1-1.5ml无菌磷酸盐缓冲溶液，用吸管吸取磷酸盐缓冲溶液轻柔的冲洗培养层，移去磷酸盐缓冲溶液，重复一次；.10)、每孔加入0.2ml消化液，使充分浸润后轻摇培养瓶，约1-3分钟，肉眼观察瓶壁半透明的细胞层，当见到出现细针孔空隙时，弃去消化液，并加入Iml完全培养基终止消化；.11)、用吸管吸取细胞悬液，轻柔的冲洗培养层后，收集细胞悬液于无菌容器中，混勻，取样细胞计数；.12)、取300g，在4°C温度条件下，离心5min后，弃去上清液；.13)、采用差速贴壁法，弃去30分钟内的贴壁细胞，未贴壁细胞继续贴壁培养，弃去1小时内未贴壁的细胞；.14)、筛选出的贴壁细胞采用密度为1.073g/ml-l. 077g/ml的淋巴细胞分离液，采用密度梯度离心法离心；.15)、将分层筛选出的细胞用IOml间充质干细胞培养基吹打混勻，传入2个T75培养瓶，每个培养瓶中补足5ml间充质干细胞培养基，在37°C、5% C02条件下培养；.16)、传代细胞生长至亚汇合状态；.17)、使用含有7%-10%的二甲基亚砜组分的冻存液冻存脂肪间质细胞。
2.根据权利要求1所述的眼袋脂肪间质细胞的分离保存方法，其特征在于抑菌剂为0. 002% -0. 01%的苯扎氯铵配置在PBS中，每毫升PBS含有卡那霉素20-100毫克；PBS的配方为称取 NaC18g、KC10. 2g、Na2HPO4 · 12H203. 489g、KH2PO4O. 2g，溶于 900ml 左右的三蒸水中，用HCl或NaOH调整PH值至7. 3-7. 4之间。
3.眼袋脂肪间质细胞培养扩增方法，其特征在于.1)、将已接种的脂肪间充质干细胞，在37°C、5%(X)2条件下培养达到70% 80%融合，.2)、移出培养瓶中的培养基，每瓶加入5ml无菌磷酸盐缓冲溶液用吸管吸取磷酸盐缓冲溶液反复冲洗培养层后，移去磷酸盐缓冲溶液，重复一次；3)、加入3ml消化液，使充分浸润后轻摇培养瓶，约1-3分钟，肉眼观察瓶壁半透明的细胞层，当见到出现细针孔空隙时，弃去消化液，并加入5ml完全培养基终止消化；4)、用吸管吸取细胞悬液，反复冲洗培养层后，收集细胞悬液于无菌容器中，混勻，取样细胞计数；5)、300g，4°C，离心5分钟，弃去上清液；6)、将沉淀的细胞用间充质干细胞载体培养基吹打混勻，加入纸载体培养瓶中，在37°C条件下滚屏培养3-4天，准备冻存；7)、把细胞冻存液平衡到4°C；8)、将消化液和新鲜培养基放置到室温中，间或摇动；9)、用75%乙醇消毒培养基瓶外壁，放置到超净台上；10)、将纸载体培养瓶取出，用75%乙醇棉球消毒瓶底；11)、用吸管吸弃旧培养基，更换吸管，加入等量细胞洗涤液，轻轻摇晃使其覆盖整个培养瓶，吸弃细胞洗涤液，更换吸管，重复洗涤一次；12)、加入25ml细胞消化液，旋转纸载体培养瓶，消化2分钟，吹打吸取消化液，终止消化；13)、再次加入25ml细胞消化液，旋转纸载体培养瓶，消化2分钟，吹打吸取消化液，终止消化。14)、合并消化液，300g,4°C，离心5分钟，收集部分上清液，做细菌、支原体检测；15)、弃去其余上清液，细胞沉淀用适量4°C细胞冻存液悬浮；16)、细胞计数，调整细胞冻存密度至106/ml，将细胞悬液收集加入1.8ml冷冻管中，标记细胞批次和密度于管壁外固定位置。
4.根据权利要求3所述的眼袋脂肪间质细胞培养扩增方法，其特征在于所述消化液配方为称取胰蛋白酶0. lg-0. 25g，加入PH为7. 0-7. 4的100ml PBS，搅拌均勻，使其完全溶解，过滤除菌后分装后置于4°C冰箱中即可。
全文摘要
眼袋脂肪间质细胞的分离保存方法，采用手术刀切除获取眼袋脂肪组织，摘取其中间质组织，并用贴壁法分离细胞。眼袋脂肪间质细胞培养扩增方法，采用纸载体技术大规模培养组织，使用成分明确无异基因组分冻存并长期保存细胞。此分离保存方法可以提取眼袋间质细胞，大量培养并长期保存，培养出来的间质细胞可用于促进皮肤创面愈合、促进糖尿病溃疡愈合、促进心肌损伤的修复、促进肝功能损伤的修复。
文档编号C12N5/077GK102586180SQ20111000751
公开日2012年7月18日 申请日期2011年1月14日 优先权日2011年1月14日
发明者刘拥军, 刘洋, 吴明远, 张丽丽, 施洁琦, 黄家学 申请人:协和华东干细胞基因工程有限公司