专利名称：多拷贝增味肽表达基因的构建及表达的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种分子生物学技术构建重组DNA以在毕赤酵母发酵液中获得增味肽(Enhance Flavor Peptide, EFP)的方法。
背景技术：
增味肽是一种从P -酪蛋白中水解得到的风味活性肽，它可以作为原料或是添加到各种食品中来提升食品的苦味、咸味、甜味以及鲜味，味道鲜美，可以增进食物天然口感。并且它还能抑制血管紧张素分泌、抑制组织蛋白酶B活性和抗真菌的生物活性。所以对EFP的研究是非常有意义的，寻求一种廉价的生产方式也必将迎来广阔的市场前景。毕赤酵母是一个理想的外源蛋白表达体系，它具有真核生物表达系统的特点，能够对目的蛋白进行类似高等真核生物的信号肽剪切、二硫键形成、糖基化等过程的翻译后 蛋白加工；能进行大体积高密度连续发酵培养；自身分泌蛋白少等优秀的特点。诱导毕赤酵母表达系统已经实现了 400多种蛋白的表达，并且广泛地应用在工业大规模生产和实验研究中。随着分子生物学技术的发展，利用重组DNA技术改造微生物使其合成分泌目标蛋白已经成为一种经济的生产方式。本发明所采用的巴斯德毕赤酵母外源基因表达系统是近年来发展的一种优秀的真核表达系统，与传统的大肠杆菌和酿酒酵母表达体系相比，其具有的诸多优势使之研究价值及应用价值不断体现。其最大特点是维持代谢低，能进行高密度发酵。自20世纪70年代以来，巴斯德毕赤酵母作为单细胞蛋白生产菌的高密度发酵方法已经相当成熟，经发酵后细胞干重可高达160g/L，而且有研究表明，发酵生产的菌体含量和外源蛋白的表达水平具有一定的正比关系。毕赤酵母对外源蛋白的翻译后加工(糖基化、二硫键的形成、折叠)和高等真核生物非常相似，使得外源蛋白能够形成正确的空间构象，不但使表达的蛋白具有很好的生物活性，而且对蛋白的分泌十分有利。外源基因的整合非常稳定是此表达系统的另一个特点。毕赤酵母的生长和对外源蛋白的表达可以在廉价的合成培养基中进行，另外毕赤酵母自身的分泌蛋白很少，有资料表明，分泌的外源蛋白可以占总分泌蛋白的30%以上。因此，十分有利于分泌蛋白的纯化。综上，本发明旨在毕赤酵母体系中表达目标增味肽。
发明内容
本发明的目的之一在于克服上述现有技术之不足，提供一种含有多拷贝增味肽表达基因的重组质粒载体及构建方法。本发明的目的之二是提供一种由上述表达载体导入毕赤酵母构成的工程菌株。本发明的目的之三是提供上述工程菌株在制备多串联拷贝的增味肽中的应用。为了实现本发明的目的，首先按照毕赤酵母翻译表达的密码子偏爱性设计出含有6拷贝EFP的表达基因片段，该片段合成的双链插入到常见的载体上，通过体外连接构建成含多拷贝EFP表达基因，通过相应限制性酶切位点整合入适当的表达载体(pPIC9)，再导入毕赤酵母构成重组DNA，使其表达多串联拷贝的EFP。本发明目的产物EFP表达基因的获得是根据毕赤酵母翻译表达的密码子偏爱性自行设计并由生工生物技术有限公司负责合成的。其中，6拷贝增味肽(Enhance FlavorPeptide, EFP)的表达基因片段，如序列表序列I所示；24拷贝增味肽的表达基因片段，如序列表序列2所示。其中，6拷贝EFP的表达基因设计方法如下第一、按照毕赤酵母翻译表达的密码子偏爱性设计出含有6拷贝EFP的表达基因片段，6拷贝的EFP表达基因头尾相连，每个表达片段之间不含其他序列；第二、在上步6拷贝EFP表达基因的上游位置加入Xho I限制性酶切位点，下游位置加入Sal I限制性酶切位点； 第三、在上步的基因片段的Xho I限制性酶切位点的上游位置加入EcoR I限制性酶切位点，Sal I限制性酶切位点的下游位置顺序加入6XHis编码基因、Not I限制性酶切位点和TAA终止密码子，最终得到如序列表序列I所示含有6拷贝EFP的表达基因片段。24拷贝EFP的表达基因构建方法为第一、用Xho I或Sal I将以上合成构建的6拷贝EFP表达基因的载体酶切后线性化，产生粘性末端；第二、用Xho I和Sal I将以上合成构建的6拷贝EFP表达基因的载体双酶切后回收包含6拷贝EFP、两端含有Xho I和Sal I粘性末端的小片段；第三、将第一步和第二步得到的基因片段通过T4DNA连接酶进行连接，连接获得含有12拷贝、18拷贝、24拷贝或拷贝数为6的任意整数倍的EFP表达基因载体；第四、由于连接反应没有正反向选择，需要人为地通过用Xho I和Sal I限制性酶切方法挑出含有正向插入的转化子，并通过其琼脂糖凝胶电泳位置确定连接小片段的数量，本发明最终选择含有24拷贝的EFP的转化子(也可以选择其他拷贝数)，即得到24拷贝的EFP基因表达载体。本发明采用的pPIC9为毕赤酵母分泌性蛋白表达的常用表达载体，带有AOXl启动子。构建的表达载体中，PPIC9的多克隆酶切位点位于a因子分泌信号基因之后；采用分子克隆方法将EFP表达基因插在EcoR I和Not I之间，具体构建方法如下第一、将上述构建好的24拷贝EFP表达基因片段通过EcoR I和Not I双酶切，回收含有EFP表达基因的小片段；第二、将用于毕赤酵母的表达载体pPIC9用EcoR I和Not I双酶切；第三、将上述第一步和第二步所得的回收小片段和载体大片段通过T4DNA连接酶连接，使含有拷贝数为24的EFP表达基因片段插入到pPIC9上得到表达载体。本发明目的二所述的工程菌株的构建方法如下第一、将上述构建好的拷贝数为24的EFP表达载体pPIC9用Sac I限制性内切酶酶切线性化；第二、通过电击转化的方法将上步线性化的表达载体pPIC9导入毕赤酵母，进行染色体重组第三、通过组氨酸营养缺陷平板筛选和PCR法鉴定，选出阳性转化子，即得到重组毕赤酵母工程菌株。本发明提供的工程菌株命名为巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)GS 115-24EFP菌株。本发明目的三所述的工程菌株的应用如下该重组毕赤酵母工程菌株通过甲醇诱导，产生含有拷贝数为24的EFP多肽，并带有一个6XHis标记,该标记用于Western Blot进行产物的定性、定量分析,或与Ni柱亲和，进行分离纯化。 本发明的优点和积极效果本发明用此多拷贝合成串联方法构建重组DNA，提高了 EFP在重组毕赤酵母中的表达量，该方法使用同尾酶为连接桥梁，可以通过廉价的体外连接达到高水平的不同的拷 贝串联数目，用该方法构建多拷贝基因可以构建出不同拷贝数的表达基因，从而为选择最佳表达量提供了梯度选择，大大优化了实验的选择性；并且该法采用了融合蛋白的方法，在24拷贝的EFP后加了 6XHis尾，可以通过Ni亲和柱将EFP纯化回收，大大降低了目标蛋白回收的难度，提高了纯化率。选取毕赤酵母为工程菌，该菌诱导简单，产量大，并且能够高密度生长，并且外源基因在毕赤酵母中是融合进宿主DNA中的，可以稳定的传代而不丢失外源基因，其稳定性大大高于酿酒酵母的附加型质粒。从而为大量的工业生产奠定了理论基础，具有重要的应用价值。
具体实施方案为了理解本发明，下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不限制本发明。实施案例I :24拷贝EFP的构建将自行设计好的含有6拷贝EFP表达基因(由生工生物技术有限公司负责合成)的质粒载体用Xho I和Sal I双酶切后，将酶切体系进行琼脂糖凝胶电泳，回收大小为96bp的小片段。再将设计好的含有6拷贝EFP表达基因的质粒载体用Xho I单酶切后将回收的96bp小片段与该线性化载体进行连接。连接产物通过电击转化转入感受态大肠杆菌，将菌液涂布于含有氨苄青霉素的LB固体平板上。37°C培养16小时后挑取在平板上生长的阳性转化子，提取质粒，使用Xho I和Sal I双酶切验证，挑选能切出192bp、282bp、378bp的大小片段的转化子。实施案例2 :表达载体pPIC9的构建将挑出的正向插入24拷贝EFP表达基因的转化子质粒再用EcoR I和Not I双酶切，将切下的小片段回收备用。将表达载体PPIC9用EcoR I和Not I双酶切后与上述的小片段连接，连接产物通过连接产物通过电击转化转入感受态大肠杆菌，将菌液涂布于含有氨苄青霉素的LB固体平板上。37°C培养16小时后挑取在平板上生长的阳性转化子，提取质粒，通过PCR验证。实施案例3 :毕赤酵母工程菌株的构建将验证好的阳性转化子质粒(含24拷贝EFP基因的pPIC9)使用Sac I酶切线性化后电转入毕赤酵母GS115，将菌液涂布于MD平板。28°C培养50小时后挑取阳性转化子，提取其宿主DNA，进行PCR验证。实施案例4 :毕赤酵母工程菌株在制备多串联拷贝的增味肽中的应用
在YPG培养基中30°C，200rpm摇床培养22小时活化两次后，以10%的接种量接入BSM培养基中，培养24小时后加入1%甲醇/天，诱导96小时后，可产生大量的目标肽-24拷贝EFP。使用本发明方法所述的运用分子操作技术构建表达EFP的毕赤酵母新型菌株，使 EFP能够大量的合成分泌，成本较低，并且在EFP表达产物后连有6 X His尾，可以通过Ni柱进行分离纯化，因此具有一定的经济开发价值。
权利要求
1.一种含有6拷贝增味肽EFP的表达基因片段，其基因序列如序列表序列I所示。
2.根据权利要求I所述的表达基因片段，其特征是所述的表达基因片段是以6拷贝增味肽为基本单元，进行体外连接后得到的具有增味肽的多拷贝数N的表达基因片段，拷贝数N为6的整数倍。
3.根据权利要求2所述的表达基因片段，其特征是所述的表达基因片段的增味肽的拷贝数为N = 24，其基因序列如序列表序列2所示。
4.一种表达载体，其特征是含有权利要求3所述的拷贝数为N = 24的表达基因片段的表达载体PPIC9。
5.一种工程菌株，其特征在于是用权利要求4所述的表达载体PPIC9导入毕赤酵母构成的工程菌株，菌种命名为巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-24EFP。
全文摘要
本发明公开了一种多拷贝增味肽表达基因及载体和重组毕赤酵母的构建方法，属于分子生物技术领域，克服了现有技术提取或化学合成EFP的技术难度大、成本高、产量低等不足。根据毕赤酵母表达翻译的密码子偏爱性，设计出含有6拷贝的EFP表达基因的序列，并设计出必要的限制性酶切位点、6×His和终止密码子。通过体外操作，不断的扩大EFP的拷贝数至24拷贝，并将其插入到表达载体pPIC9上，将pPIC9线性化后通过电转化的方法将目的片段-含24拷贝的EFP表达基因，重组于毕赤酵母的基因组上。通过发酵，甲醇诱导毕赤酵母得到高产量的EFP，并通过6×His亲和柱Ni柱进行分离纯化。
文档编号C12N15/12GK102747085SQ20111010157
公开日2012年10月24日 申请日期2011年4月22日 优先权日2011年4月22日
发明者王艳萍, 王金菊, 田雪, 白小佳 申请人:天津科技大学