专利名称：一种用农杆菌介导对裂壶藻进行基因转化的方法
技术领域：
本发明 属于基因工程领域，涉及一种用农杆菌介导对裂壶藻进行基因转化的方法。
背景技术：
二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，简称DHA)是重要的ω-3高度不饱和脂肪酸，具有促进脑细胞生长发育，降血脂，降血糖，保护视力，抗癌及提高免疫能力等多种重要的生理功能，受到医疗界及食品界的广泛关注。商业化DHA的主要来源是深海鱼油，但深海鱼类资源有限，且鱼油中DHA含量受鱼的品种、季节及地理位置的影响而不稳定，不能满足日益增长的市场需求。利用微生物发酵法生产DHA具有周期短，脂肪酸构成简单，不受原料的限制，易于提纯等优点，有望成为高纯度DHA的有效来源。裂壶藻是一种海洋微藻，与硅藻、褐藻等微藻同属Stramenopiles纲。裂壶藻可利用葡萄糖为碳源进行异养培养，其营养细胞进行连续二均分裂，脂肪酸组成简单，DHA含量高，分离纯化简单，是获取天然高浓度DHA的很好资源。基因工程技术是近年来兴起的一种现代生物技术，该技术在育种领域里已取得了一些重大成果并获得了显著的经济效益，获得了许多性状优良的品种。利用转基因技术来改善裂壶藻的品质，获得生长速度快、油脂含量高、组分简单的裂壶藻新品种将具有巨大的商业优势和广阔的市场前景，所以利用现代基因工程技术提高裂壶藻的品质显得异常重要。但是，目前裂壶藻的基因工程领域尚处于空白。虽然裂壶藻的基因枪转化和电击转化方法已经建立，但是这些方法介导的重组方式为同源重组，因此需要从裂壶藻体内克隆获得同源片段，由于缺乏裂壶藻的基因组序列信息，极大的限制了上述两种转化方法的应用。因此，发展新的裂壶藻非同源重组基因转化方法将极大的推进裂壶藻基因工程领域的发展。
发明内容
本发明的目的是提供一种用农杆菌介导对裂壶藻进行基因转化的方法。本发明提供了一种制备转基因裂壶藻的方法，包括如下步骤用重组农杆菌转化裂壶藻原生质体，得到转基因裂壶藻；所述重组农杆菌是将含有外源基因的质粒转化出发农杆菌得到的。所述出发农杆菌可为农杆菌菌株LBA4404。所述裂壶藻具体可为裂壶藻Schizochytrium sp. TI01101 CGMCC No. 4603。所述裂壶藻原生质体的制备方法可包括如下步骤(1)将所述裂壶藻培养至对数生长期；(2)收集所述裂壶藻的细胞，用纤维素酶和蜗牛酶消化，获得裂壶藻原生质体。在进行所述步骤(1)前，可将所述裂壶藻进行预培养。所述预培养具体可为将所述裂壶藻接种于YPD培养基中，28°C摇床中培养过夜。所述步骤(1)中，所述培养温度可为28°C。所述步骤(1)中，具体可 采用YPD培养基培养所述裂壶藻。所述步骤(2)中，可通过离心收集所述裂壶藻的细胞。所述离心的参数具体可为 4000rpm、4°C离心5min。所述步骤(2)中，收集所述裂壶藻后进行所述消化前，可先用预冷的无菌水洗涤所述细胞。所述步骤(2)中，所述消化的条件具体可为28°C消化5-6小时。 所述步骤(2)中，所述纤维素酶和所述蜗牛酶具体可通过酶处理液的方式加入；所述酶处理液由溶质和溶剂组成；所述溶剂为20mM磷酸盐缓冲液(pH5.8)；所述溶质及其浓度如下 2% (质量百分比)纤维素酶，2% (质量百分比)蜗牛酶和0.7MKC1。所述用重组农杆菌转化裂壶藻原生质体可包括如下步骤①用乙酰丁香酮对重组农杆菌进行预诱导；②将所述裂壶藻原生质体与完成步骤①的重组农杆菌共培养，得到转基因裂壶藻。进行所述步骤①前，可将所述重组农杆菌在YEB培养基中，28°C震荡培养至对数生长期，然后离心收集重组农杆菌菌体。所述步骤①中，所述预诱导的培养条件可为28°C培养4-5小时。所述步骤①可在诱导培养基IM中进行。所述重组农杆菌在所述诱导培养基IM 中的浓度为0D600 = 0. 6-0. 8，所述乙酰丁香酮在所述诱导培养基IM中的浓度为250umol/ L0所述步骤②中，所述共培养的条件可为28°C震荡培养10-18小时，具体可为28°C 震荡培养14小时。所述步骤②可在诱导培养基IM中进行。所述用重组农杆菌转化裂壶藻原生质体的方法还可包括将共培养后的菌液进行抗生素筛选的步骤。所述抗性筛选可采用如下条件28°C培养2-3天。所述抗生素筛选中的抗生素具体可由G418、氨苄青霉素和氯霉素组成。所述抗生素筛选优选采用YPD筛选培养基进行。所述诱导培养基IM由水和溶质组成；所述溶质及其在所述诱导培养基IM中的浓度如下=NaCl 0. 15g/L、MgSO4 · 7H20 0. 25g/L、K2HPO4 2. 28g/L、KH2PO4 1. 36g/L、CaCl2 · H2O 0. 078g/L、FeSO4 0. 0025g/L、(NH4)2SO4 0. 53g/L、葡萄糖 1. 98g/L、甘油 0. 54g/L、MES 7. 808g/L ；pH5. 3。所述YPD筛选培养基由YPD培养基、G418、氨苄青霉素和氯霉素组成，G418的浓度为300mg/L，氨苄青霉素的浓度为300mg/L，氯霉素的浓度为300mg/L。所述YEB培养基由水和溶质组成；所述溶质及其在所述YEB培养基中的浓度如下 5g/L 牛肉浸膏、lg/L 酵母提取物、5g/L 蛋白胨、5g/L 蔗糖、0. 5g/L MgSO4 · 7H20 ；pH7. 4。所述YPD培养基由水和溶质组成；所述溶质及其在所述YPD培养基中的浓度如下 10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖，50% (体积百分比)海水；pH6. 2-6. 8。所述外源基因具体可为序列表的序列1所示的GUS基因、序列表的序列2所示的 NPTII基因和序列表的序列3所示的EGFP基因中的至少一种。所述外源基因为所述GUS基因和所述NPT II基因时，所述含有外源基因的质粒为双元载体PCAMBIA2301。所述外源基因为EGFP基因时，所述含有外源基因的质粒为重组质粒 PCAMBIA2301-EGFP ；所述重组质粒pCAMBIA2301_EGFP可为在双元载体pCAMBIA2301的多克隆位点插入TEFl-EGFP-CYC1片段得到的重组质粒。所述重组质粒pCAMBIA2301-EGFP具体可为在双元载体PCAMBIA2301的HindIII和BamHI酶切位点插入所述TEFl-EGFP-CYC1片段得到的重组质粒。所述TEF1-EGFP-CYC1片段自上游至下游依次包括序列表的序列4所示的组成型启动子TEF1、序列表的序列3所示的EGFP基因和序列表的序列5所示的转录终止子CYCl。所述TEFl-EGFP-CYC1片段具体可为用用限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切重组质粒pBS-TEFl-EGFP-CYC1得到的小片段；所述重组质粒pBS_TEFl-EGFP-CYC1具体可为以克隆载体pBluescript II SK+为骨架质粒，在EcoRI和PstI位点之间插入序列表的序列3所示的EGFP基因，在HindIII和EcoRI位点之间插入序列表的序列4所示的组成型启动子TEF1，在PstI和BamHI位点之间插入序列表的序列5所示的转录终止子CYC1。以上任一所述方法得到的转基因裂壶藻也属于本发明的保护范围。本发明提供了一种高效、稳定、简便的裂壶藻基因转化的方法。本发明以裂壶藻原生质体为受体材料，通过农杆菌LBA4404介导外源基因转化裂壶藻，巧妙的利用了裂壶藻与农杆菌LBA4404对抗生素的敏感性不同的特点完成了转基因裂壶藻的筛选。本发明不需要涉及昂贵的仪器，易于操作，重复性好，且转化效率高，每IO7个藻体细胞可获得100个以上的转化子。本发明的建立为利用转基因技术改善裂壶藻的品质，获得生长速度快、油脂含量高、组分简单的裂壶藻新品种奠定了良好的基础。本发明方法对裂壶藻的遗传改良具有十分重要的意义。
图1为双元载体pCAMBIA2301的结构示意图。图2为转基因裂壶藻的表型鉴定结果。图3为PCR验证转基因裂壶藻中NPT II基因的插入情况。图4为PCR验证转基因裂壶藻中⑶S基因的插入情况。图5为重组质粒pBS-EGFP的构建过程示意图。图6为重组质粒pBS-TEFl-EGFP-CYC1的构建过程示意图。图7为重组质粒pCAMBIA2301-EGFP的构建过程示意图。图8为PCR验证转基因裂壶藻中外源基因EGFP的插入情况。图9为转基因裂壶藻的southern杂交结果。图10为Western blot检测转基因裂壶藻中外源基因EGFP的表达情况。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。MES中文名称为2-(N-吗啉代)乙烷磺酸一水。质粒pEGFP-Nl =Clontech, Catalog Number #6085-1。克隆载体 pBluescript II SK+Stratagene，Catalog Number #212205·。质粒 pGAPZ α A Jnvitrogen, Catalog Number V205-20。双元载体 pCAMBIA2301 =CAMBIA, Canberra, Australia.。农杆菌菌株 LBA4404 Jnvitrogen, Catalog Number 18313-015.。
酶处理液由溶质和溶剂组成；所述溶剂为20mM磷酸盐缓冲液(pH5. 8)；所述溶质及其浓度如下2% (质量百分比)纤维素酶，2% (质量百分比)蜗牛酶和0.7M KC1。YPD培 养基10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖，50% (体积百分比) 海水，其余为水；PH6. 2-6.8。YEB培养基5g/L牛肉浸膏、lg/L酵母提取物、5g/L蛋白胨、5g/L蔗糖、0. 5g/L MgSO4 · 7H20，其余为水；pH7. 4。诱导培养基IM:由水和溶质组成；所述溶质及其浓度如下NaCl 0. 15g/L、 MgSO4 · 7H20 0. 25g/L、K2HPO4 2. 28g/L、KH2PO4 1. 36g/L、CaCl2 · H2O 0. 078g/L、FeSO4 0. 0025g/L、(NH4)2SO4 0. 53g/L、葡萄糖 1. 98g/L、甘油 0. 54g/L、MES 7. 808g/L ；pH5. 3。YPD筛选培养基由YPD培养基、G418、氨苄青霉素和氯霉素组成；G418的浓度为 300mg/L，氨苄青霉素的浓度为300mg/L，氯霉素的浓度为300mg/L。实施例1、农杆菌介导裂壶藻的基因转化(⑶S基因和NPT II基因)一、裂壶藻原生质体的制备裂壶藻Schizochytrium sp. TIOl 101已于2011年02月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia 北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No. 4603。裂壶藻Schizochytrium sp. TI01101 CGMCC No. 4603 简称裂壶藻 TI01101。制备原生质体的步骤如下(1)将裂壶藻TIOl 101接种于YPD培养基中，28°C摇床中培养过夜。(2)次日按照(体积比)的接种量转接入50ml新鲜的液体YPD培养基中28°C 培养至对数生长期。(3)以4000rpm的转速4°C离心5min收集藻细胞，利用预冷的无菌水洗涤藻细胞一次后加入IOml酶处理液，28°C摇床中消化5-6小时，显微镜观察裂壶藻形成原生质体的状态，当90%以上裂壶藻细胞转化为原生质体时即可停止消化。二、农杆菌LBA4404介导裂壶藻的基因转化双元载体pCAMBIA2301的结构图谱见图1。双元载体pCAMBIA2301含有葡萄糖苷酶基因(GUS基因，如序列表的序列1所示)和G418抗性基因(NPT II基因，如序列表的序列2所示)；其中GUS基因作为报告基因，在裂壶藻中可表达葡萄糖苷酸酶，在底物存在的情况下使转基因裂壶藻产生显色反应；NPT II基因作为选择标记基因，赋予转基因裂壶藻对G418的抗性。具体操作步骤如下1、将双元载体pCAMBIA2301转化农杆菌菌株LBA4404，得到重组农杆菌。2、挑取重组农杆菌至液体YEB培养基中，28°C震荡培养至对数生长期，离心收集菌体，利用诱导培养基IM重悬稀释调整农杆菌的浓度为0D600 = 0. 6-0. 8，并加入终浓度为 250umol/L的乙酰丁香酮，28°C预诱导4_5小时。3、离心收集步骤一制备的原生质体，用诱导培养基IM重悬后，加入步骤2得到的菌液中，28°C震荡侵染14小时(采用10-18小时均可)。4、将步骤3得到的藻细胞与菌体混合培养物离心收集，涂布于固体YPD筛选培养基中，28°C培养2-3天。
5、挑取固体YPD筛选培 养基中的转化子克隆。6、二次筛选和表型鉴定将获得的转化子克隆培养后在固体YPD筛选培养基中划线培养，同时以野生型裂壶藻藻株(裂壶藻TI01101)作为阴性对照，照片见图2 (Al至A7为转基因裂壶藻藻株；WT 为裂壶藻TI01101)。转基因裂壶藻藻株A1-A7均能够在YPD筛选固体培养中生长，而野生型裂壶藻藻株则不能够生长。结果表明，获得了转基因裂壶藻藻株。三、转化效果鉴定(PCR验证外源基因在转基因裂壶藻基因组中的整合情况)分别以转基因裂壶藻A1_A6(以裂壶藻TI01101作为阴性对照，WT)的基因组DNA 为模板，使用NPT II-F和NPT II-R组成的引物对PCR检测NPT II基因，使用⑶S-F和 ⑶S-R组成的引物对PCR检测⑶S基因。NPT II-F :5，-TCACTGAAGCGGGAAGGGACT-3，；NPT II-R 5，-GCGGCGATACCGTAAAGCAC-3，。GUS-F :5，-GACTCGTCCGTCCTGTAGAAACC-3，；GUS-R 5’ -AAAGTCCCGCTAGTGCCTTGTC-3 ’。PCR反应条件95 °C预变性5min，然后经30个循环(94 °C 30s,56 °C 30s、 72°C lmin)，72°C IOmin。取5 μ 1 PCR产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳，EB染色观察。结果见图3和图4。结果表明在转基因裂壶藻Α1-Α6的基因组中均可以PCR扩增获得NPTII基因的目的片段(约500bp)和⑶S基因的目的片段(约750bp)；在裂壶藻 TI01101的基因组中没有目的条带。说明外源基因已经成功插入转基因裂壶藻的基因组中。 每IO7个藻体细胞可获得100个以上转基因裂壶藻藻株。实施例2、农杆菌介导裂壶藻的基因转化(EGFP基因)一、重组质粒 pCAMBIA2301-EGFP 的构建1、绿色荧光蛋白基因(EGFP)的克隆(1)以质粒pEGFP-Nl为模板，用EGFP-F和EGFP-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(绿色荧光蛋白基因，又称EGFP基因，如序列表的序列3所示)。EGFP-F :5，-GGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGA-3，；EGFP-R 5’ -AACTGCAGTTACTTGTACAGCTCGTC-3 ’。PCR反应条件95 °C预变性5min，然后经30个循环(94 °C 30s,58 °C 30s、 72°C lmin) ,72°C IOmin。(2)用限制性内切酶EcoRI和PstI双酶切PCR扩增产物，回收酶切产物。(3)用限制性内切酶EcoRI和PstI双酶切克隆载体pBluescript II SK+，回收载体骨架(约3000bp)。(4)将步骤(2)的酶切产物和步骤(3)的载体骨架连接，得到重组质粒pBS-EGFP。重组质粒pBS-EGFP的结构示意图见图5。2、绿色荧光蛋白表达模块的构建(1)以质粒pGAPZ α A为模板，用TEF-F和TEF-R组成的引物对进行PCR扩增，得到 PCR扩增产物(组成型启动子TEF1，如序列表的序列4所示)。TEF-F :5，-CCCAAGCTTCCCACACACCATAGCTTC-3，；
TEF-R 5’ -GGAATTCGGTTTAGTTCCTCACCTT-3’。PCR反 应条件95 °C预变性5min，然后经30个循环(94 °C 30s,56 °C 30s、 72°C lmin)，72°C IOmin。(2)用限制性内切酶HindIII和EcoRI双酶切PCR扩增产物，回收酶切产物。(3)用限制性内切酶HindIII和EcoRI双酶切重组质粒pBS_EGFP，回收载体骨架 (约 3800bp)。(4)将步骤⑵的酶切产物和步骤(3)的载体骨架连接，得到重组质粒 pBS-TEF1-EGFP。(5)以质粒pGAPZ α A为模板，用CYCl-F和CYCl-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(转录终止子CYCl，如序列表的序列5所示)。CYCl-F :5，-AACTGCAGCACGTCCGACGGCGGCC-3，；CYCl-R 5，-CGGGATCCAGCTTGCAAATTAAAGCCT-3，。PCR反应条件95 °C预变性5min，然后经30个循环(94 °C 30s,56 °C 30s、 72°C lmin) ,72°C IOmin。(6)用限制性内切酶PstI和BamHI双酶切PCR扩增产物，回收酶切产物。(7)用限制性内切酶PstI和BamHI双酶切重组质粒pBS_TEFl-EGFP，回收载体骨架(约 4300bp)。(8)将步骤(6)的酶切产物和步骤(7)的载体骨架连接，得到重组质粒 pBS-TEF1-EGFP-CYC1。重组质粒pBS-TEF 1-EGFP-CYC1的结构示意图见图6。3、重组质粒 pCAMBIA2301-EGFP 的构建(1)用限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切重组质粒pBS_TEFl-EGFP_CYCl，回收酶切产物(EGFP基因的表达模块TEFl-EGFP-CYC1)。(2)用限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切双元载体pCAMBIA2301，回收载体骨
^K O(3)将步骤⑴的酶切产物和步骤(2)的载体骨架连接，得到重组质粒 PCAMBIA230I-EGFP。重组质粒pCAMBIA2301-EGFP的结构示意图见图7。二、农杆菌LBA4404介导裂壶藻的基因转化1、裂壶藻原生质体的制备同实施例1的步骤一。2、农杆菌LBA4404介导裂壶藻的基因转化用重组质粒pCAMBIA2301-EGFP代替双元载体pCAMBIA2301，其它同实施例1的步骤二，获得转基因裂壶藻藻株。3、转化效果鉴定(I)PCR验证外源基因在转基因裂壶藻基因组中的整合情况分别以转基因裂壶藻(藻株E1-E6 ；以裂壶藻TI01101作为阴性对照，WT)的基因组DNA为模板，使用EGFP-F和EGFP-R组成的引物对PCR检测EGFP基因(egfp基因)。EGFP-F 5’ -GGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3 ’ ；
EGFP-R 5’ -AACTGCAGTTACTTGTACAGCTCGTC-3 ’。PCR反应条件95 0C预变性5min，然后经30个循环(94 °C 30s,56 °C 30s、 72°C lmin)，72°C IOmin。取5 μ 1 PCR产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳，EB染色观察。结果见图8。结果表明在转基因裂壶藻Ε1-Ε6的基因组中均可以PCR扩增获得 EGFP基因的目的片段(约700bp)；在裂壶藻TI01101的基因组中没有目的条带。说明外源基因已经成功插入转基因裂壶藻的基因组中。(2) Southern杂交验证转基因裂壶藻中外源基因的拷贝数目分别将转基因裂壶藻(藻株E1-E6 ；以裂壶藻TI01101作为阴性对照，WT)的基因组DNA进行southern杂交(采用地高辛标记的egfp基因片段作为探针，探针如序列表的序列3自5’末端第5至668位核苷酸所示)。结果见图9。结果显示，所得到的转基因裂壶藻均为阳性，且外源基因均为单拷贝随机插入。(3) Western blot检测外源基因在转基因裂壶藻中的表达情况分别将转基因裂壶藻(藻株E1-E6 ；以裂壶藻TI01101作为阴性对照，WT)用蛋白裂解液裂解后得到蛋白液。将各种蛋白液进行Western blot (—抗为EGFP的抗体)。结果见图10。结果表明，转基因裂壶藻E1-E6中均能够成功检测到EGFP蛋白的表达，而野生型裂壶藻中则不能检测到。说明外源基因EGFP已经成功的在转基因裂壶藻中得到了表达。每IO7个藻体细胞可获得100个以上转基因裂壶藻藻株。
权利要求
1.一种制备转基因裂壶藻的方法，包括如下步骤用重组农杆菌转化裂壶藻原生质体，得到转基因裂壶藻；所述重组农杆菌是将含有外源基因的质粒转化农杆菌得到的。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述农杆菌为农杆菌菌株LBA4404。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述裂壶藻为裂壶藻Schizochytrium sp.TI01101 CGMCC No. 4603。
4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于所述裂壶藻原生质体的制备方法包括如下步骤(1)将所述裂壶藻培养至对数生长期；(2)收集所述裂壶藻的细胞，用纤维素酶和蜗牛酶消化，获得裂壶藻原生质体。
5.如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述用重组农杆菌转化裂壶藻原生质体包括如下步骤①用乙酰丁香酮对重组农杆菌进行预诱导；②将所述裂壶藻原生质体与完成步骤①的重组农杆菌共培养，得到转基因裂壶藻。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述方法还包括将共培养后的菌液进行抗生素筛选的步骤；所述抗生素筛选中的抗生素优选由G418、氨苄青霉素和氯霉素组成。
7.如权利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于所述外源基因为序列表的序列1 所示的GUS基因、序列表的序列2所示的NPT II基因和序列表的序列3所示的EGFP基因中的至少一种。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述外源基因为所述GUS基因和所述NPTII 基因；所述含有外源基因的质粒为双元载体PCAMBIA2301。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述外源基因为EGFP基因；所述含有外源基因的质粒为重组质粒pCAMBIA2301-EGFP ；所述重组质粒pCAMBIA2301-EGFP是在双元载体pCAMBIA2301的多克隆位点插入TEFl-EGFP-CYC1片段得到的；所述TEFl-EGFP-CYC1片段自上游至下游依次包括序列表的序列4所示的组成型启动子TEF1、序列表的序列3所示的EGFP基因和序列表的序列5所示的转录终止子CYCl。
10.权利要求1至9中任一所述方法得到的转基因裂壶藻。
全文摘要
本发明公开了一种用农杆菌介导对裂壶藻进行基因转化的方法。本发明提供的方法包括如下步骤用重组农杆菌转化裂壶藻原生质体，得到转基因裂壶藻；所述重组农杆菌是将含有外源基因的质粒转化农杆菌得到的。本发明不需要涉及昂贵的仪器，易于操作，重复性好，且转化效率高，每107个藻体细胞可获得100个以上的转化子。本发明的建立为利用转基因技术改善裂壶藻的品质，获得生长速度快、油脂含量高、组分简单的裂壶藻新品种奠定了良好的基础。本发明方法对裂壶藻的遗传改良具有十分重要的意义。
文档编号C12N1/13GK102220359SQ20111011201
公开日2011年10月19日 申请日期2011年4月29日 优先权日2011年4月29日
发明者吴欣, 张 林, 李科, 杨善军, 林汝榕, 林祥志, 王昭凯, 程汝滨, 荣辉, 马涌, 马瑞娟 申请人:国家海洋局第三海洋研究所