专利名称：用于抗肿瘤药物筛选的荧光细胞模型及其标记方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物工程技术领域的细胞模型及其标记方法，具体涉及的是一种用于抗肿瘤药物筛选的荧光细胞模型及其标记方法与应用。
背景技术：
癌症，各种恶性肿瘤的统称，其细胞的生长和分裂速度高于正常细胞，且往往可转移到其他组织。肿瘤是严重威胁人类健康的疾病之一，但用于临床的抗肿瘤药物普遍存在选择性差、毒副作用大、易产生耐药性等问题，因此继续寻找选择性高、毒副作用小的抗癌药是抗肿瘤新药研究的重点。目前筛选抗肿瘤药物的方法包括体外和体内筛选方法。体内筛选方法，即动物实验，是药物应用于有移植性肿瘤的动物进行实验的方法，但因体内筛选需要的技术条件高，难以进行高通量筛选，且靶标不明，动物实验的成本又高，影响因素多，故大批筛选或粗筛时多采用体外筛选。体外筛选方法中最常见的是四氮唑盐酶还原法(Microculture Tetrozolium, MTT)，又称MTT比色法。其检测原理为活细胞线粒体中的璁珀酸脱氢酶能使外源件MTT还原为水不溶件的蓝紫饩结晶甲谱(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在550nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量；在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的优点是灵敏度高、经济。但由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测，这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响。而且MTT有致癌性，溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。最重要的是，MTT 只能用来检测细胞的相对数和相对活力，但不能检测细胞的绝对数。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的不足，提供一种用于抗肿瘤药物筛选的荧光细胞模型及其标记方法与应用。本发明方法简便、误差小、灵敏度高、经济，适合抗肿瘤药物的高通量准确筛选。本发明是通过以下技术方案实现的本发明涉及用于抗肿瘤药物筛选的荧光细胞，为U20S-EGFP细胞(4F12G)，已于 2011年4月20日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为CGMCC NO :4787ο本发明涉及的用于抗肿瘤药物筛选的荧光细胞模型是含荧光物质的细胞模型，所述的荧光物质为绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)。优选的，所述的绿色荧光蛋白为增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)。本发明涉及上述的用于抗肿瘤药物筛选的荧光细胞模型的标记方法，利用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转染U20S人骨肉瘤细胞，建立表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的稳定细胞株。所述的增强型绿色荧光蛋白的表达情况可在荧光显微镜下被监视，表达时不需要加入抗体、辅因子、酶底物等其他成分，不影响宿主细胞。本发明涉及上述的用于抗肿瘤药物筛选的荧光细胞模型的应用，所述的用于抗肿瘤药物筛选的荧光细胞模型可测定细胞裂解液中荧光值的变化。本发明的优点在于，通过测定荧光值直接反映细胞存活和生长的变化，利用该发明的细胞模型建立的抗肿瘤药物筛选方法药物作用机制明确，较MTT比色法操作简便、快速、直接，而且误差小、灵敏度高、经济，适合抗肿瘤药物的高通量准确筛选。
图1为本发明的细胞模型建立的抗肿瘤药物选新方法基于U20S-EGFP细胞的荧光分析法与以往最常用体外筛选方法MTT比色法之间的比较的一个优选实施例的结果图；图2为基于U20S-EGFP细胞的荧光分析法与MTT比色法检测细胞生长曲线之间的比较的一个优选实施例的结果图；其中细胞生长曲线之间的比较:A、C.荧光分析法；B、D. MTT比色法(η = 5)。图3为基于U20S-EGFP细胞的荧光分析法与MTT比色法检测药物对细胞生长的抑制之间的比较的一个优选实施例的结果图；其中:Α.荧光分析法；B.MTT 比色法。1 μ g/ml ()，0· 2 μ g/ml ( ■ ) (η = 5)。图4为基于U20S-EGFP细胞的荧光分析法与MTT比色法检测不同浓度的同种药物对细胞生长的抑制趋势之间的比较的一个优选实施例的结果图；其中A荧光分析法；B MTT比色法。阿霉素1 μ g/ml (),0.2μ g/ml ( ■)， 0. 02 μ g/ml ( ▲ )，0· 01 μ g/ml (▼)，0. 002 μ g/ml ()，and 载体(〇)(η = 5)。图5为基于U20S-EGFP细胞的荧光分析法的试验条件优化的一个优选实施例的结果图；其中:Α. 24小时和48小时的测试结果，48小时是有效的，阿霉素0. 2 μ g/ml (□) 和1 μ g/ml _，载体(■).与载体相比的P值Γ )，与0. 2 μ g/ml药物相比的P值(#)，* /#p<0. 05,**p<0.01, ***/### <0. 001 (η = 5) ；B.细胞数量与荧光读数之间的线性关系。图6为验证基于U20S-EGFP细胞的荧光分析法实验条件最优的一个优选实施例的结果图；其中验证基于U20S-EGFP细胞的荧光分析法实验条件最优潜在抗肿瘤化合物 (100 μ Μ)在24小时㈧和48小时(B、C)的药物筛选实验.48小时药物有作用效果，并且实验可重复(B、C) (η = 3)。图7为基于U20S-EGFP细胞的荧光分析法与MTT比色法检测药物对细胞生长的抑制敏感性之间的比较的一个优选实施例的结果图；其中Α荧光分析法；B MTT比色法。抗肿瘤化合物50 μ M (Ο),10 μ M ( ) and 2 μ M (■);荧光分析法更敏感(η = 5)。图8为基于U20S-EGFP细胞的荧光分析法与MTT比色法检测药物对细胞生长的半数抑制浓度IC50之间的比较的一个优选实施例的结果图；其中戊烷脒的IC50分别是A.荧光分析法25. 35 士 3. 58μΜ;Β.ΜΤΤ比色法 22. 12 士 1. 33 μ Μ，数值相近(η = 5)。
具体实施例方式以下结合附图对本发明的担载蛋白的组织工程纤维支架及其制备和体外释放实验实施作详细说明以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例一高效稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的U20S细胞株(U20S-EGFP细胞株)
的建立1.含neo抗性的EGFP质粒转染U20S细胞1)U20S细胞连续传代处理2-3次，以使细胞维持良好生长状态，准备铺板；2)铺24孔板，一个90%满的IOcm皿细胞可铺24孔，按每孔500 μ L培养基的量铺于24孔细胞培养板中。每隔20min观察细胞贴壁情况，晃动平板，让细胞尽量均勻地铺于孔中；3)5% C02，37°C孵育l_2h，待细胞贴壁后，准备进行转染24孔板的1个孔；4)转染步骤按照 DNA 浓度 0. 4 μ g/mL、PEI 浓度 0. 8 μ g/mL,溶于 200 μ LDMEM 基础培养基中，配置成转染液；室温下孵育10分钟后，加300 μ LDMEM基础培养基至转染液中， 混勻，将转染液加入24孔板的一个孔中；将细胞培养板置于37°C，5% C02细胞培养箱中继续培养4-6h (可过夜)后换新鲜的完全培养基。2.U20S-EGFP稳定细胞株的挑选1)转染48h后消化细胞，将所有细胞转移到IOcm培养皿中，用含500 μ g/mL G418 的DMEM+10% +1% (10%胎牛血清，青链霉素)培养基继续培养；2)用上述选择培养基在5% C02，37°C孵育15天，每2_3天换液一次，此时在显微镜下可观察到细胞成团分布在培养皿中；3)将培养皿放到荧光显微镜下观察，如果该细胞团发绿荧光，则用记号笔在皿底 (外部)标记，标记的黑点应尽量将整个团恰好覆盖；标记完成后，在超净工作台里将标记过的细胞团转移到96孔细胞板上。具体步骤为将移液器调为150 μ L量程，枪头在标记的黑点及周围来回刮细胞，同时吸入液体，刮起来的细胞碎片即被吸入枪头，将其转移至96 孔板中的一孔即可；4)每隔2-3天换液一次，此时用含250 μ g/mL G418的DMEM+20% +1 %培养基培养细胞，随时观察细胞生长状态，待细胞团足够大，换10%血清的培养基，并将96孔板放到荧光显微镜下观察；如果该细胞团发绿荧光，则用记号笔在孔底(外部)标记，标记的黑点应尽量将整个团恰好覆盖；标记完成后，在超净工作台里将标记过的细胞团一部分转移到24孔板的2个孔中，待细胞贴壁长满50%后，一个孔进行检测，另一个孔扩大培养(若检测结果理想，则冻存此细胞)；另一部分消化后转移到IOcm培养皿中以备下一轮挑选；
增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的检测当细胞铺满24孔板1孔的40%左右时，力口 100 μ L的1 % ΝΡ-40裂解液裂解细胞，置于冰上20min，确保细胞完全裂解；取50 μ L裂解液加入酶标条中，用多功能酶标仪检测激发光波长488nm，发射光波长506nm下的绿荧光值；5)5% C02，37°C孵育细胞，此时用含 250 μ g/mL G418 的 DMEM+10% +1%培养基培养细胞，待细胞成团后，结合EGFP检测结果，进行新一轮的挑选，转移至96孔板中，之后再从96孔板中挑选，并转移至24孔板和IOcm培养皿中； 6) 1个月后，改用不含G418的DMEM+10% +1%培养基培养细胞；7)待在荧光显微镜下肉眼所观察到的荧光细胞团纯度和亮度都较高时，用梯度稀释法进一步筛选，直至挑选到稳定高效表达的单克隆细胞株。实施例二利用U20S-EGFP细胞模型筛选抗肿瘤药物的方法的建立1.用基于U20S-EGFP细胞的荧光分析法筛选抗肿瘤药物试验方案第一阶段使用高浓度样品，进行样品细胞生长抑制率分析，初步判断样品有无抑制细胞生长的活性；第二阶段此阶段将样品分高、中、低三个浓度组，进行样品细胞生长抑制率及差异显著性统计，准确判断样品有无细胞生长抑制活性，筛选细胞生长抑制率大于50%的样品即为hits ；第三阶段此阶段采用梯度稀释法，将样品分9个浓度组，分析样品浓度和相应细胞生长抑制率之间的关系，计算hits的IC50 ；第四阶段将hits应用于多种肿瘤细胞以及有移植性肿瘤的动物进行试验；第五阶段机制研究2.基于U20S-EGFP细胞的荧光分析法与MTT比色法用于抗肿瘤药物筛选的具体实施方案基于U20S-EGFP细胞的荧光分析法筛选抗肿瘤药物按以下步骤进行1)接种细胞收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度至1. 5X 103-2X 103/ml，铺96孔板，每孔加入200yL ；2)培养细胞5% C02，37°C孵育l_2h待细胞贴壁，小心吸弃孔内培养基，每孔加入200 μ L指定浓度梯度的药物或DMSO (空白对照)，并检测此时(即第0天)未加药孔的 U20S-EGFP细胞的荧光强度(阴性对照)；3)裂解细胞5% C02，37°C孵育24_48h，小心吸弃孔内培养基，每孔加入150yL 的1 %的NP-40 %，脱色摇床振荡20min，使细胞充分裂解；4)转移IOOyL裂解后的溶液至96孔白板中，并向3个孔中加入100 μ L的的 ΝΡ-40%作为空白对照；5)检测荧光值用多功能酶标仪检测激发光波长488nm，发射光波长506nm下的绿荧光值，记录并处理数据。MTT比色法筛选抗肿瘤药物按以下步骤进行1)接种细胞收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度至1. 5X 103-2X 103/ml，铺96孔板，每孔加入200 μ L，最后3个孔中不铺细胞；2)培养细胞5%C02，37°C孵育l_2h待细胞贴壁，小心吸弃孔内培养基，每孔加入200 μ L指定浓度梯度的化合物或DMSO(空白对照)，在没有铺细胞的孔中只加培养基(阴性对照)；3)呈色5% C02, 37°C孵育24_72h，每孔加入20 μ L的5mg/ml的MTT溶液，继续培养4h ；4)终止培养小心吸弃孔内培养上清液，每孔加ISOyLDMSO,脱色摇床振荡 lOmin，使结晶物充分融解；5)比色选择550nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值(0D550)，记录并处理数据。如图1所示，与MTT比色法相比，基于U20S-EGFP细胞的荧光分析法用于抗肿瘤药物筛选的试验方案缩短了检测时间，克服了 MTT比色法中因产物不溶需加DMSO的缺点，具有操作方法简便、快速、直接、实验结果准确性高的优点。3.基于U20S-EGFP细胞的荧光分析法与MTT比色法绘制细胞生长曲线基于U20S-EGFP细胞的荧光分析法绘制细胞生长曲线按以下步骤进行1)接种细胞收集对数期U20S-EGFP细胞，调整细胞悬液浓度至1. 5X 103_2X IO3/ ml，铺96孔板，每孔加入200 μ L ；2)培养细胞5% C02，37°C孵育l_2h待细胞贴壁，此时计为Oh ；3)裂解细胞5% 0)2，371分别孵育011，2411，4811，7211(3个孔为一组)，小心吸弃孔内培养基，每孔加入150 μ L的1 %的ΝΡ-40%，脱色摇床振荡20min，使细胞充分裂解；4)转移IOOyL裂解后的溶液至96孔白板中，并向3个孔中加入100 μ L的的 ΝΡ-40%作为空白对照；5)检测荧光值用多功能酶标仪检测激发光波长488nm，发射光波长506nm下的绿荧光值，记录结果，以时间为横坐标，绿荧光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。MTT比色法绘制细胞生长曲线按以下步骤进行1)接种细胞收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度至(1. 5 X 103-2 X IO3) /ml，铺96 孔板，每孔加入200 μ L，另设置阴性对照组，即孔中不铺细胞，只加入200 μ L的培养基；2)培养细胞5% C02，37°C孵育l_2h待细胞贴壁，此时计为Oh ；3)呈色5% C02，37°C分别孵育Oh，24h，48h，72h (3个孔为一组)，每孔加入20 μ L 的5mg/ml的MTT溶液，继续培养4h ；4)终止培养小心吸弃孔内培养上清液，每孔加ISOyLDMSO,脱色摇床振荡 lOmin，使结晶物充分融解；5)比色选择550nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值(0D550)，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。结果见图2，图2表明与MTT比色法相比，基于U20S-EGFP细胞的荧光分析法绘制的细胞生长曲线呈线性相关，可以用于细胞生长曲线的绘制。4.基于U20S-EGFP细胞的荧光分析法与MTT比色法检测药物对细胞生长的抑制情况阿霉素(Doxorubicin)，一种广谱抗肿瘤抗生素，具有强烈的细胞毒性。以阿霉素为例，用MTT比色法和基于U20S-EGFP细胞的荧光分析法检测其对细胞生长的抑制情况并绘制曲线。
结果见图3，图3表明与MTT比色法相比，应用基于U20S-EGFP细胞的荧光分析法绘制的给药情况下的细胞生长曲线更接近于细胞的正常生长曲线(S型曲线)，说明基于 U20S-EGFP细胞的荧光分析法可以用于并且更适用于检测药物对细胞生长的抑制情况。5.基于U20S-EGFP细胞的荧光分析法与MTT比色法检测不同浓度的同种药物对细胞生长的抑制情况同样以阿霉素为例，用MTT比色法和基于U20S-EGFP细胞的荧光分析法检测不同浓度的阿霉素对细胞生长的抑制情况并绘制曲线。结果见图4，图4表明与MTT比色法相比，应用基于U20S-EGFP细胞的荧光分析法绘制的给予不同浓度阿霉素的情况下的细胞生长曲线可靠性更高。6.基于U20S-EGFP细胞的荧光分析法的试验条件的优化(结果见图5)基于U20S-EGFP细胞的荧光分析法中细胞的最佳接种浓度的确定按以下步骤进行1)利用基于U20S-EGFP细胞的荧光分析法检测细胞接种浓度不同，但给药浓度和检测时间都相同时细胞的生长情况，并以96孔板每孔的细胞数为横坐标，以荧光值为纵坐标绘制曲线。2)结果分析基于U20S-EGFP细胞的荧光分析法，细胞的最佳接种浓度为 (3. 5X 103-30X 103) /ml (即接种96孔板时，每孔接种700-6000个细胞)。基于U20S-EGFP细胞的荧光分析法中最佳检测时间的确定按以下步骤进行1)利用基于U20S-EGFP细胞的荧光分析法检测不同时间，但给药浓度和细胞接种浓度都相同时细胞的生长情况，并以时间为横坐标，以药物对细胞的抑制率为纵坐标作图。2)结果分析基于U20S-EGFP细胞的荧光分析法，48h为最佳检测时间。7.基于U20S-EGFP细胞的荧光分析法最佳检测时间的鉴定检测不同化合物24h和48h时对细胞生长的抑制情况，结果见图6，图6表明48h 时药物对细胞生长的抑制更明显。已知MTT比色法的最佳检测时间为72h，故基于U20S-EGFP细胞的荧光分析法节省了实验时间。8.基于U20S-EGFP细胞的荧光分析法与MTT比色法检测药物对细胞生长的抑制敏感性分别用基于U20S-EGFP细胞的荧光分析法与MTT比色法检测不同药物不同浓度时对细胞生长的抑制情况，结果见图7，图7表明基于U20S-EGFP细胞的荧光分析法较MTT比色法灵敏度更高。9.基于U20S-EGFP细胞的荧光分析法与MTT比色法检测药物对细胞生长的半数抑制浓度IC50结果见图8，图8表明基于U20S-EGFP细胞的荧光分析法与MTT比色法测出的IC50 基本一致，基于U20S-EGFP细胞的荧光分析法具有使用价值
权利要求
1.一种用于抗肿瘤药物筛选的荧光细胞，其特征在于，所述的细胞为U20S-EGFP细胞， 保藏号为CGMCC NO :47870
2.一种用于抗肿瘤药物筛选的荧光细胞模型，其特征在于，该荧光细胞模型是含荧光物质的细胞模型，所述的荧光物质为绿色荧光蛋白，所述的细胞为U20S人骨肉瘤细胞。
3.根据权利要求2所述的用于抗肿瘤药物筛选的荧光细胞模型，其特征是，所述的绿色荧光蛋白为增强型绿色荧光蛋白。
4.一种用于抗肿瘤药物筛选的荧光细胞模型的标记方法，其特征是，利用增强型绿色荧光蛋白转染细胞，建立表达增强型绿色荧光蛋白的稳定细胞。
5.根据权利要求4所述的用于抗肿瘤药物筛选的荧光细胞模型的标记方法，其特征是，所述的增强型绿色荧光蛋白的表达情况可在荧光显微镜下被监视。
6.一种根据权利要求2所述的用于抗肿瘤药物筛选的荧光细胞模型的应用，其特征是，所述的用于抗肿瘤药物筛选的荧光细胞模型可测定细胞裂解液中荧光值的变化。
全文摘要
一种生物工程技术领域的用于抗肿瘤药物筛选的荧光细胞模型及其标记方法与应用。该荧光细胞模型是含荧光物质的细胞模型，所述的荧光物质为绿色荧光蛋白，所述的细胞为U2OS人骨肉瘤细胞。其标记方法利用增强型绿色荧光蛋白转染细胞，建立表达增强型绿色荧光蛋白的稳定细胞。其应用所述的用于抗肿瘤药物筛选的荧光细胞模型在测定细胞裂解液中荧光值的变化。本发明通过测定荧光值直接反映细胞存活和生长的变化，所建立的抗肿瘤药物筛选方法药物作用机制明确，方法简便、快速、直接，而且误差小、灵敏度高、经济，适合抗肿瘤药物的高通量准确筛选。
文档编号C12N15/63GK102220284SQ20111011200
公开日2011年10月19日 申请日期2011年4月30日 优先权日2011年4月30日
发明者D·柯伊拉腊, 吴凤娟, 徐维果, 李大伟, 武正华 申请人:上海交通大学