专利名称：一株产抗氧化剂的菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株青霉菌菌株。
背景技术：
自由基是生命活动中多种生化反应的中间代谢物质。自由基产生过多或清除过慢，会造成机体在分子水平、细胞水平及组织器官水平的各种损伤，加速机体的衰老过程并诱发各种疾病。自由基攻击生命大分子和各种细胞器造成组织损伤，是引起机体衰老的根本原因，也是诱发肿瘤等恶性疾病的重大原因。抗氧化物质(抗氧化剂)是指能够清除氧自由基，抑制或消除以及减缓氧化反应的一类物质。抗氧化剂的开发与研究一直以来受到人们的广泛关注，天然抗氧化剂已从单纯作为油脂和含脂食品的抗氧化剂，发展到作为体内氧自由基的清除剂，起到保护人体细胞组织，保护心脑血管循环系统、抗癌及延缓衰老等生理作用。目前天然抗氧化物质主要是从动植物中提取的，如维生素类、酶类和天然药物类等。但是动植物中天然抗氧化物质含量较低，提取工艺复杂，而且从这些资源提取势必使这些动植物资源遭到严重破坏，造成生物多样性和生态环境的损失。
发明内容
本发明提供了一株青霉菌菌株，可产生抗氧化剂，为抗氧化剂的获得提供微生物资源基础。本发明产抗氧化剂的菌株为青霉(Penicillium sp. ) JTLR-I，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，保藏日期为2011年3月21日，保藏号为CGMCC No. 4701。本发明青霉JTLR-I属于半知菌亚门(Deuteromycotina)，丝孢菌纲 (Hyphomycetes)，丝孢目(Moniliales)，丛梗孢科(Moniliaceae)，青霉属(Penicillium)。本发明青霉JTLR-I在PDA固体培养基或查氏固体培养基中培养，1 2天培养基表面有白色絮状菌丝体，生长快，质地柔软，2天后平板底部中心处有少量红色物质产生，边缘为淡黄色，5 7天后可产生分生孢子，菌落正面菌丝夹杂大量分生孢子(见图1)，表面无渗出液，分生孢子颜色为深绿色，菌落反面呈红色夹杂黄色(见图幻。青霉JTLR-I在PDA 液体培养基或查氏液体培养基上培养3 15天后，摇瓶中长满白色菌丝球，呈小球型，溶液表面液面层及摇瓶壁上有大量产红色夹杂黄色菌丝体产生。在光学显微镜下，菌丝呈长丝状，菌丝中间无隔(见图幻。分生孢子梗直径2. 5 3. 5微米；帚状枝为2层，下层小梗3 5个，上层小梗5 7个。分生孢子呈圆形或椭圆形，大小O. 5 μ m 3. 5 μ m) X O. O μ m 2. 5 μ m)。本发明青霉JTLR-I可在PDA培养基或查氏培养基中培养，最适生长温度25 ^°C，最适pH值为5 7。本发明青霉JTLR-I能够产生抗氧化剂，使用β -胡萝卜素-亚油酸法和清除DPPH法对青霉JTLR-I的发酵产物和化学合成抗氧化剂BHT的抗氧化活性进行检测，实验结果显示青霉JTLR-I产生的抗氧化剂优于BHT的抗氧化活性。本发明青霉JTLR-I属于青霉属(Penicillium sp.)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2011年3月21日，保藏号为CGMCC No. 4701。
图1为本发明青霉JTLR-I的菌落正面形态图；图2为本发明青霉JTLR-I的菌落背面形态图；图3为本发明青霉JTLR-I的菌丝形态图。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式产抗氧化剂的菌株为青霉JTLR-1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2011年3月21日，保藏号为 CGMCC No. 4701。青霉JTLR-I在PDA固体培养基或查氏固体培养基中培养，1 2天培养基表面有白色絮状菌丝体，生长快，质地柔软，2天后平板底部中心处有少量红色物质产生，边缘为淡黄色，5 7天后可产生分生孢子，菌落正面菌丝夹杂大量分生孢子，表面无渗出液，分生孢子颜色为深绿色，菌落反面呈红色夹杂黄色。青霉JTLR-I在PDA液体培养基或查氏液体培养基上培养3 15天后，摇瓶中长满白色菌丝球，呈小球型，溶液表面液面层及摇瓶壁上有大量产红色夹杂黄色菌丝体产生。在光学显微镜下，菌丝呈长丝状，菌丝中间无隔。分生孢子梗直径2. 5 3. 5微米；帚状枝为2层，下层小梗3 5个，上层小梗5 7个。分生孢子呈圆形或椭圆形，大小(2. 5 μ m 3. 5 μ m) X (2. 0 μ m 2. 5 μ m)。本实施方式的青霉JTLR-I可在PDA培养基或查氏培养基中培养，最适生长温度 25 ^°C，最适pH值为5 7。
具体实施方式
二 本实施方式从榛属植物茎皮内分离纯化得到，具体步骤为一、 将带部分木质部的榛树皮先用无菌水冲洗去掉杂质，再用质量浓度为75%的酒精浸泡 lmin，然后用无菌水冲洗掉酒精，在用无菌剪刀剪成面积为0. 5cmX0. 5cm的榛树皮小块； 二、将榛树皮小块放置于PDA琼脂固体培养基平板上，在条件下恒温培养至树皮小块周围明显长出菌丝；三、采用尖端菌丝挑取法将菌接种于PDA琼脂固体培养基，在恒温条件下培养3 5天，挑取单菌落，用PDA琼脂固体培养基平板划线培养法，经多次分离、筛选、纯化，得到可以产生抗氧化剂的青霉JTLR-1。对分离纯化得到的青霉JTLR-I进行分子生物学鉴定，按以下步骤进行提取菌株的总DNA，采用真菌通用引物ITS1、ITS4扩增青霉JTLR-1 rDNA ITS序列，PCR产物纯化后，经NCBI数据库序列比对，与青霉属(Penicillium sp.)内各个种之间有极高的同源性，同源性为98%以上，通过结合菌体形态特征、生长条件确定青霉JTLR-I属于青霉属 (Penicillium sp.)。将本实施方式的青霉JTLR-I接种于种子培养基(PDA琼脂固体培养基)，于培养2天，然后转接于装有200mL发酵培养基(PDA液体培养基)的500mL三角瓶中，于 28°CU80r/min条件下摇瓶培养7天，收集发酵固体培养物。对本实施方式的青霉JTLR-I的发酵产物进行抗氧化活性检测，具体如下取青霉 JTLR-I的发酵固体培养物用液氮冷冻并研碎后，以Ig固体培养物加入IOmL质量浓度50% 的甲醇水的比例进行提取，用正己烷萃取，直至正己烷萃取液无色后，除去上层正己烷层， 取下层冷冻干燥，即得到菌产抗氧化剂。(1) β -胡萝卜素-亚油酸法测定菌产抗氧化剂的抗氧化活性将0. ang β-胡萝卜素溶于0. 2mL氯仿中，加入20mg亚油酸及200mg吐温-40， 混合均勻后于40°C水浴中除去氯仿，然后加入50mL蒸馏水(经鼓氧气2 :3min)，剧烈振荡，即配成反应介质溶液。同时设置空白，除不加胡萝卜素氯仿溶液外，其他步骤同前。 于具塞试管中逐一加入4. OmL反应介质溶液，将菌产抗氧化剂和化学合成抗氧化剂BHT溶于无水乙醇配制成系列浓度溶液作为样液，分别加入0. 2mL样液，同时设置空白调零管、对照管和样品管，其中空白调零管中不含胡萝卜素与试样，对照管不含试样，以0. 2mL无水乙醇代替试样溶液。上述溶液混勻后，置于50°C水浴中恒温，在470nm波长下测定t = 0时的吸光度，之后每间隔15min测定吸光度，直至对照管中β -胡萝卜素颜色消失(约 120min)。抗氧化活性的计算公式抗氧化活性(％)= 100X[1-04。-4)/(Λ° -4°)] (Αο、《分别表示t = 0时样品和对照的吸光度；At、<分别表示t = 120min时样品和对照的吸光度)β -胡萝卜素-亚油酸法测定菌产抗氧化剂，表现出优良的抗氧化活性，其IC50值为1. 05mg/mL,而BHT的IC50值为1. 28mg/mL,说明菌产抗氧化剂优于BHT的抗氧化活性。(2)菌产抗氧化剂清除DPPH自由基能力的测定用无水乙醇配置6. 5X 10_5mOl/L DPPH溶液，另将菌产抗氧化剂和化学合成抗氧化剂BHT溶于无水乙醇配制成系列浓度溶液作为样液。精确吸取2. 5mL DPPH溶液和0. 5mL 样液摇勻，室温避光放置反应IOmin后倒入光径Icm比色皿517nm下测定吸光值。重复测定3次，结果取平均值。然后按下式计算DPPH自由基清除率，抗氧化剂清除自由基能力采用清除DPPH的IC50值表示，即DPPH自由基清除率为50%时所对应的抗氧化剂溶液浓度。清除率(％) = [I-(Ai-Aj)/AJ X 100%，其中 Atl 为 2. 5mL DPPH 溶液+0. 5mL 无水乙醇，Ai为2. 5mLDPPH溶液+0. 5mL样液，Aj为2. 5mL无水乙醇+0. 5mL样液。经计算本实施方式的青霉JTLR-I菌产抗氧化剂的IC50值(50% DPPH自由基清除率所需样品的浓度)为41. 17 μ g/mL,而BHT的IC50值为94. 26 μ g/mL,说明菌产抗氧化剂优于BHT的抗氧化活性。由以上结果可知，本实施方式的青霉JTLR-I能够产生抗氧化剂。
权利要求
1. 一株产抗氧化剂的菌株，其特征在于产抗氧化剂的菌株为青霉(Penicillium sp.) JTLR-1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2011年3月21日，保藏号为CGMCCNo. 4701。
全文摘要
一株产抗氧化剂的菌株，它涉及一株青霉菌菌株。本发明提供了一株青霉菌菌株，可产生抗氧化剂，为抗氧化剂的获得提供微生物资源基础。本发明产抗氧化剂的菌株为青霉JTLR-1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2011年3月21日，保藏号为CGMCC No.4701。本发明的青霉JTLR-1能够产生抗氧化剂，为抗氧化剂的获得提供微生物资源基础。
文档编号C12R1/80GK102206588SQ201110111548
公开日2011年10月5日 申请日期2011年4月29日 优先权日2011年4月29日
发明者邹积宏, 金涛 申请人:黑龙江大学