专利名称：基因ein3和eil1在促进植物根毛发育中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及基因EIN3和EILl在促进植物根毛发育中的应用。
背景技术：
随着人口数目的增长，如何提高作物产量以维持人类生存是一个亟待解决的问题。上世纪中叶提出的第一次绿色革命，在农业生产中大量使用农药与化肥，虽然提高了作物的产量，但随之带来了非常严重的问题。化肥与农药的过度使用不仅造成大量的浪费，而且被证明对人类健康十分有害，更重要的是过量的化肥与农药污染地表、地下水，并且会分解出大量的温室气体，这已经引起了全世界广泛的关注。针对这一问题提出的第二次绿色革命，旨在利用分子生物学的研究和基因工程技术，从作物本身出发提高营养吸收的效率增强抗性，从而实现环境友好的增产。根毛是高等植物吸收营养的重要器官，在逆境中植物根部会形成许多根毛，大大增加了根与土壤直接接触的表面积，提高植物对营养吸收的效率。对下一代绿色革命来说， 调节植物根系发育模式是一个全新的突破口，通过增加根毛的长度与密度，可以改善植物的营养吸收效率。植物根毛的可塑性高。以拟南芥为例，通常情况下根表皮细胞发育分化为两种细胞，即成毛细胞和非毛细胞。在根的成熟区，大部分成毛细胞往往会在外表面形成凸起，并进而垂直于茎向伸长，发育为根毛；非毛细胞与成毛细胞相间排列，感受不同的位置信号，通常不形成根毛。已知有多种内、外源刺激可以促进根毛的发生与伸长，增大根毛的平均长度，进一步提高成毛细胞发育出根毛的比率，或者诱使非毛细胞长出根毛，即异位根毛。各种刺激包括营养缺乏(比如缺磷、缺铁等)，激素的刺激(比如生长素、乙烯等)。
发明内容
本发明的目的是提供基因EIN3和EILl在促进植物根毛发育中的应用。为了实现本发明目的，本发明的基因EIN3和EILl在促进植物根毛发育中的应用， 其是通过基因工程的方法在植物中过表达基因EIN3和EILl。优选地，所述植物为拟南芥。基因EIN3和EINl的核苷酸序列分别如Seq ID No 1和Seq ID No 2所示。外源乙烯可以大大促进根毛的发生、伸长，这种效应是通过乙烯信号转导中重要的转录因子EIN3和EILl来实现的。EIN3和EILl可以整合多种内、外源刺激，是植物根毛发育调控中重要的节点。通过EIN3和EILl在模式植物拟南芥中分子生物学机理方面的研究，发现缺乏这两个转录因子的拟南芥突变体呈现显著的根毛减少的表型，而诱导它们在植株中积累，可以大大增加根毛的长度与密度。通过基因工程手段在作物中过表达EIN3和 EIL1，提高实际作物的营养吸收效率，增强作物抵御逆境胁迫的能力，从而达到农业上的增产目的。
图1为Col-O野生型、ein2-5突变体、ein3 eill突变体、ctrl-1突变体、EIN3ox 转基因植物分别在添加/不添加ACC的培养基上竖直生长6天的结果。图2为EIN3和EILl整合了刺激根毛生长的内外源信号。Col-O野生型、ein3 eill 突变体在缺铁培养基，3 μ M ABA培养基上的生长情况。图3为ΕΙΝ3蛋白的积累直接导致根毛生长旺盛。转基因植物诱导型EIN3(ein3 eill ebfl ebf2四重突变体背景)添加不同浓度的β -雌激素处理后的生长情况。图4为添加β -雌激素后，ΕΙΝ3蛋白在植物体内积累的验证实验结果。图5为EILlox转基因植物在MS培养基上竖直生长6天的结果。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。以下实施例中使用的各种突变体均购自ABRC，各种药品试剂，如无特殊说明均购自Sigma公司。实施例1 ΕΙΝ3和EILl是调控根毛生长的重要转录因子CTRl是乙烯信号通路中的负调控因子，没有乙烯时CTRl关闭了下游的乙烯反应， 拟南芥感受乙烯信号后会关闭CTRl对下游的抑制功能。ΕΙΝ2是乙烯信号途径中的正调控因子，它可以促进转录因子ΕΙΝ3和EILl的积累，ΕΙΝ3和EILl转录各种乙烯响应基因。将乙烯不敏感突变体ein2-5和ein3 eill，组成型突变体ctrl_l，超敏感突变体EIN3ox分别播种在MS (购自PTL公司)和ACC (乙烯合成前体，10 μ Μ)培养基上，4°C吸胀3天后置于22°C 长日照温室中竖直培养6天，观察表型。发现组成型打开乙烯信号通路的突变体ctrl-Ι具有非常多的根毛，而完全阻断乙烯信号通路的不敏感型突变体ein2-5和ein3 eill双重突变体的根毛很少，而且仅有的根毛也很短，难以观察到。对ein3 eill突变体施加外源乙烯也不能促进根毛的发育。然而转基因过表达EIN3的幼苗根部有明显的大量根毛形成。这说明乙烯信号通路中一对转录因子EIN3和EILl对拟南芥根毛的发育是必须的。(图1)实施例2 EIN3和EILl整合了刺激根毛生长的内外源信号已知缺铁会诱使根毛增多，模拟干旱胁迫的激素ABA处理也可以促进根毛的发育。A.将ein3 eill播种在MS培养基上，吸胀后光下竖直培养3天，然后将幼苗转移到添加了 3μΜ ABA的MS培养基上，继续光下培养3天后观察表型。B.将同样的种子播种在MS’ 培养基上(5mM KNO3, 2mM MgSO4, 2mM Ca (NO3)2, 2. 5mM K2PO4, 70 μ MH3BO3,14 μ M MnCl2,1 μ M ZnSO4,0. 5μ M CuSO4, IOuM NaCl, 0. 2 μ MNa2MoO4,40 μ M FeEDTA，0. 8% 琼脂，ρΗ= 5· 7)，同样的方法培养3天后转移到缺铁培养基上(MS’培养基中不添加40 μ M FeEDTA,加入100 μ M 5，6-二苯基-3-(2-吡啶基)-1，2，4-三嗪-4，4' - 二磺酸二钠盐)在光下培养3天后观察表型。对比野生型拟南芥和ein3 eill突变体的幼苗根部可以发现，缺铁导致的根毛增多增长以及ABA刺激的根毛发生都是依赖于EIN3和EILl的。缺乏EIN3和EILl的突变体不能响应这些外源刺激，仍然是根毛很少的表型。说明EIN3和EILl是整合这些根毛发育的刺激因素的重要节点。(图2)实施例3 EIN3蛋白的积累直接导致根毛生长旺盛构建β-雌激素诱导表达EIN3的克隆，转化到ein3 eill ebfl ebf2四重突变体中，由于没有降解EIN3和EILl蛋白的EBFl或EBF2存在，β -雌激素诱导的外源EIN3蛋白可以在植株中稳定存在。将转基因纯合体种子播种在MS培养基上，光下生长3天后转移幼苗到添加了雌激素(10 μ Μ)的MS培养基上，光下再竖直培养3天后观察表型。在不添加雌激素诱导，即没有ΕΙΝ3和EILl蛋白的对照组实验中，难以观测到根毛；而添加了 β -雌激素诱导ΕΙΝ3基因表达并且翻译的蛋白产物稳定存在时，可以看到植物幼苗根部长出了大量的根毛。这说明只要诱导ΕΙΝ3在植物体内的积累，就可以使植物长出更多的根毛，ΕΙΝ3是根毛发育的充分条件(图3和图4)。图5为EILlox转基因植物在MS培养基上竖直生长6天的结果，同样作为乙烯信号通路中的重要转录因子，过表达EILl (EIN3-LIKE1) 的转基因植物EILlox也比野生型的根毛多，说明EILl和EIN3 —样可以促进植物根毛的发育。由于内源EIN3蛋白合成后会被F-box蛋白EBF1/2不断降解，为了在植物体内表达可人工控制的稳定的EIN3蛋白，本发明构建了转基因植物pER8 :EIN3-FLAG/ein3 eill ebfl ebf2，在施加外源的β-雌激素时可诱导植物体内EIN3蛋白的积累，并通过施加不同浓度或者不同处理时间，实现蛋白量的变化。构建转基因植物PER8 :EIN3-FLAG/ein3 eillebfl ebf2 的方法为1.PCR扩增目标片段EIN3基因编码区，通过核酸内切酶酶切目标片段和质粒 pER8(Jianru Zuo 等，An estrogen receptor-based transactivator XVE mediates highly inducible gene expression in transgenic plants, The Plant Journal,2000, 由中国科学院遗传所左建儒实验室惠赠)产生黏性末端，将片段和质粒用连接酶连接， 通过测序鉴定得到质粒pER8 :EIN3-FLAG(构建过程见Chen等，ETHYLENEINSENSITIVE3 and ETHYLENE INSENSITIVE3-LIKE1 re-press SALICYLIC ACID INDUCTION DEFICIENT2 expression to neg-atively regulate plant innate immunity in Arabidopsis, Plant Cell,2009)。2.取2 μ 1质粒加入100 μ 1农杆菌GV3101中，2200V电击后迅速加入500-800 μ 1 LB培养基，28°C 220rpm培养1. 5小时，均勻涂在40 μ g/ml壮观霉素LB培养基上，28°C倒置培养1-2天；3.接种单个菌落于5ml LB培养基(利福平50 μ g/ml+壮观霉素40 μ g/ml ；也可以只加转基因抗性)，28°C 220rpm培养过夜；4.以1 100扩大培养于400mL(根据植物数量调整)含适当抗生素的LB中，继续摇培5-8hr左右至生长密度为0D600值1. 0-1. 2 ；5.室温，4000g，离心lOmin，收集菌体；6.用转化介质(5%蔗糖，2. 033g/L MgCl2)悬浮菌体；Silwet L-77 (200 μ L/L)对菌液有伤害，应在转化植物前加入；7.将含有农杆菌的转化介质倒入烧杯中，将刚刚开花的拟南芥倒置其上，使得整个花序都浸入转化介质中(莲座基部的花序可用枪浇淋)，30s 120s ；8.取出拟南芥，将其侧卧放在干净的塑料托盘上，并用薄膜覆盖避光保湿24hr ；9.将拟南芥扶起，正常光下培养，约3-4周后长角果完全枯黄、欲开裂时，即可收获种子；10.用50 μ g/ml潮霉素的MS培养基筛选转基因植物。
综上所述，经本发明研究发现拟南芥两个转录因子EIN3和EILl是植物根毛发育的充分必要因子，而且它们整合了一些外源刺激根毛生长的因素，是调控根毛发育的重要节点。在模式植物拟南芥中的研究表明，EIN3蛋白的积累可以促使更多根毛的发育，这为在作物中通过基因工程手段提高根对营养的吸收效率提供了新的思路。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.基因EIN3和EILl在促进植物根毛发育中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物为拟南芥。
全文摘要
本发明提供了基因EIN3和EIL1在促进植物根毛发育中的应用，其是通过基因工程的方法在植物中过表达基因EIN3和EIL1。通过对基因EIN3和EIL1在模式植物拟南芥中分子生物学机理的研究，发现在植物中过表达基因EIN3和EIL1能够提高实际作物的营养吸收效率，增强作物抵御逆境胁迫的能力，从而达到农业上的增产目的。
文档编号C12N15/82GK102220370SQ20111011152
公开日2011年10月19日 申请日期2011年4月29日 优先权日2011年4月29日
发明者冯莹, 朱自强, 郭红卫 申请人:北京大学