专利名称：一种毕赤酵母培养基重复发酵利用的方法
技术领域：
本发明涉及一种毕赤酵母培养基重复发酵利用的方法，适用于以巴斯德毕赤酵母为原材料生产酵母抽提物以及利用巴斯德毕赤酵母工程菌生产目的产物。
背景技术：
传统的毕赤酵母发酵方法，一般主要由甘油分批发酵阶段、甘油补料发酵阶段和甲醇补料发酵阶段三部分组成。其中，甲醇补料发酵阶段是一个连续的过程，从补加甲醇开始，在经过一段较长时间后，菌体才逐渐适应甲醇环境，湿重逐渐增加，到发酵后期达到峰值，菌体湿重可以达到350 400g/L。这种发酵工艺生产周期通常为一周左右，其中，菌体增殖速度较快的是甘油分批发酵阶段的对数增长期、甘油补料发酵阶段和甲醇补料发酵阶段的对数增长期。由于甘油价格远远高于甲醇，且甘油不具备诱导表达外源蛋白的功能，所以在发酵过程中，甘油主要起到迅速增殖菌体的功能。在甲醇诱导表达阶段，菌体需要一段长时间的对甲醇的适应过程，因而影响整个发酵过程的生产速率。目前，毕赤酵母高密度发酵通常采用高浓度的基础盐培养基，培养基中的金属离子，特别是K+和Mg2+含量非常高。这些金属离子在发酵过程中主要起到维持菌体渗透压平衡的作用，真正被菌体吸收利用的量很少。在发酵结束后，含有大量金属离子的溶液作为废水被排放到环境中，给环境造成很大危害。同时，残留在毕赤酵母菌体中的金属离子也在一定程度上限制了毕赤酵母菌体蛋白的应用。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种毕赤酵母培养基重复发酵利用的方法，对毕赤酵母发酵所用的基础盐溶液培养基进行回收利用，从而提高生产效率、降低生产成本、减少污染排放。本发明的技术方案是一种毕赤酵母培养基重复发酵利用的方法，它包括下述步骤
A、首次发酵在单罐中以甘油为碳源进行分批发酵，再经过甘油补料发酵，碳源饥饿， 然后进行甲醇补料发酵；
B、重复发酵
Bi、取出部分菌液用于分离出酵母泥和上清液在单罐发酵过程结束后，从发酵罐中的菌液总量中取出部分用于离心分离出酵母泥和上清液的菌液； B2、剩余菌液留作重复发酵种子液；
B11、将酵母泥送下道工序将取出用于分离上清液和酵母泥的菌液进行离心分离，获得上清液和酵母泥，将酵母泥送下道工序；
B12、将上清液灭菌后返回发酵罐中，继续进行以甲醇为碳源的重复发酵； 按上述重复发酵步骤进行若干次重复发酵；
C、最后一次发酵
Cl、取出上一次发酵全部菌液，用于分离出酵母泥和废液；C11、将酵母泥送下道工序； C12、将废液排出，完成全部发酵。
在上述技术方案的基础上更进一步的技术方案是
所述的毕赤酵母培养基重复发酵利用的方法，其上清液灭菌后返回发酵罐中的过程中或过程结束后，同时补加灭菌水，使发酵体积达到初始装料体积；在重复发酵过程中流加甲所述的毕赤酵母培养基重复发酵利用的方法，其重复发酵过程中按发酵罐中的发酵液总量计，每升发酵液流加甲醇的速率为5 20 mL/ h。所述的毕赤酵母培养基重复发酵利用的方法，所述发酵后取出用于分离酵母泥和上清液的菌液，和留下用作下一次重复发酵种子液的菌液，分别占发酵罐中菌液总量的重量百分比为取出60% 90%菌液，留下10% 40%菌液。所述的毕赤酵母培养基重复发酵利用的方法，首次发酵后重复发酵3 5次，再经过最后一次发酵。所述的毕赤酵母培养基重复发酵利用的方法，首次发酵后重复发酵4次，再经过最后一次发酵；发酵后取出用于分离酵母泥和上清液的菌液，和留下用作下一次重复发酵种子液的菌液，分别占发酵罐中菌液总量的重量百分比为
首次发酵后取出85%菌液，留下15%菌液； 笫一次重复发酵后，取出80%菌液，留下20%菌液； 笫二次重复发酵后，取出75%菌液，留下25%菌液； 笫三次重复发酵后，取出70%菌液，留下30%菌液； 笫四次重复发酵后，取出60%菌液，留下40%菌液；
最后一次发酵后，取出全部菌液，再对菌液离心分离，将酵母泥送下道工序，然后废液排出，完成全部发酵。所述的毕赤酵母培养基重复发酵利用的方法，首次发酵后重复发酵5次，再经过最后一次发酵；发酵后取出用于分离酵母泥和上清液的菌液，和留下用作下一次重复发酵种子液的菌液，每次分别均为发酵罐中的菌液总量的重量百分比为取出70%菌液，留下 30%菌液。所述的毕赤酵母培养基重复发酵利用的方法，所述首次发酵，其碳源饥饿时间为 1 池；在碳源饥饿后向发酵罐中流加含有10 15mL/L的PTM1溶液的甲醇。所述的毕赤酵母培养基重复发酵利用的方法，所述单罐发酵过程结束，是以菌体湿重达到250 350g/L为结束时间。所述的毕赤酵母培养基重复发酵利用的方法，首次发酵过程中，控制温度 28. 5士0. 5°C, pH5. 0士0. 1，罐压 0. 04 MPa，搅拌转速 500 900rpm;发酵 20 22h，DO 迅速上升至100%，立即开始流加一定量的含有12mL/L的PTM1溶液的50%甘油；碳源饥饿Ih 后开始流加含有12mL/L的PTM1溶液的甲醇，设定初始流加速率80mL/h，每隔池，将补料速率提高50%，当补料速率为270mL/h时，维持这个补料速率；发酵过程中，如果DO低于20%， 则降低补料速率，直到DO重新回到20%以上。对本发明的技术方案、原理和突出的特点和效果是
简单地说，本发明过程是经过以甘油为碳源的分批发酵、补料发酵阶段后，再经碳源
5饥饿，然后加入含有PTM1溶液的甲醇进行发酵。菌体湿重达到300g/L左右后进入培养基重复发酵利用流程。即单罐发酵过程结束后，留下部分菌液在发酵罐中，作为下一次发酵的种子液；将其余的菌液离心分离，获得酵母泥和上清液，上清液灭菌后回罐，而不是排放，如此重复发酵利用多次，一般为五次。本发明的主要优点在传统的甲醇补料发酵阶段，酵母菌在对数生长期可以快速增殖，但其适应期和稳定期增殖速度都很慢。通过本发明设计的培养基循环发酵利用流程， 可以使酵母菌反复多次进行对数增殖，生产效率高；同时可以反复利用金属盐培养基，降低污染排放。通过菌液离心分离、上清灭菌回罐等流程，将培养基重复发酵利用，从而降低生产成本，提高生产效率，减少污染排放。本发明设计的工艺，在单罐发酵过程结束后，将培养基(主要是金属离子溶液)重复发酵利用多次。由于留在罐内的毕赤酵母菌已经适应了甲醇环境，所以菌体可以在短时间内迅速增殖；同时，由于对金属离子溶液的回收利用，发酵产生的废液也减少了很多。
图1是本发明方法步骤示意图； 图2是常规传统方法步骤示意图。
具体实施例方式结合附图和实施例，对本发明作进一步说明如下 实施例1
如图1所示，一种毕赤酵母培养基重复发酵利用的方法，它按下述步骤进行
A、首次发酵是在50L单罐中以甘油为碳源进行分批发酵，再经过甘油补料发酵，碳源饥饿，然后进行甲醇补料发酵；其碳源饥饿时间为1 池；在碳源饥饿后向发酵罐中加入含有10 15mL/L的PTM1溶液的甲醇。本实施例首次发酵过程中，控制温度观.5士0. 5°C, pH5. 0 士 0. 1，罐压0. 04 MPa，搅拌转速500 900rpm;发酵20 22h，DO迅速上升至100%， 立即开始流加一定量的含有12mL/L的PTM1溶液的50%甘油；碳源饥饿Ih后开始流加含有12mL/L的PTM1溶液的甲醇，设定初始流加速率80mL/h，每隔池，将补料速率提高50%，当补料速率为270mL/h时，维持这个补料速率；发酵过程中，如果DO低于20%，则降低补料速率，直到DO重新回到20%以上。所述单罐发酵过程结束，是以菌体湿重达到250 350g/L 为结束时间点。本实施例是以菌体湿重达到300g/L为结束时间点，即菌体湿重达到300g/ L时，停止发酵；
B、重复发酵
Bi、取出部分菌液用于分离出酵母泥和上清液在单罐发酵过程结束后，从发酵罐中的菌液总量中取出部分用于离心分离出酵母泥和上清液的菌液； B2、剩余菌液留作重复发酵种子液；
B11、将酵母泥送下道工序将取出用于分离上清液和酵母泥的菌液进行离心分离，获得上清液和酵母泥，将酵母泥送下道工序；
B12、将上清液灭菌后返回发酵罐中，继续进行以甲醇为碳源的重复发酵；上清液是作为重复发酵的营养液使用，而不是排放；按上述重复发酵步骤进行若干次重复发酵； C、最后一次发酵
Cl、取出上一次发酵全部菌液，用于分离出酵母泥和废液； C11、将酵母泥送下道工序； C12、将废液排出，完成全部发酵。在上清液灭菌后返回发酵罐中的过程中或过程结束后，同时补加灭菌水，使发酵体积达到初始装料体积；在重复发酵过程中流加甲醇。重复发酵过程中按发酵罐中的发酵液总量计，每升发酵液流加甲醇的速率为5 20 mL/ h，本实施例采用15 mL/ h。所述发酵后取出用于分离酵母泥和上清液的菌液，和留下用作下一次重复发酵种子液的菌液，分别占发酵罐中菌液总量的重量百分比为取出60% 90%菌液，留下10% 40%菌液。首次发酵后重复发酵3 5次，再经过最后一次发酵。本实施例首次发酵后重复发酵4次，再经过最后一次发酵；发酵后取出用于分离酵母泥和上清液的菌液，和留下用作下一次重复发酵种子液的菌液，分别占发酵罐中菌液总量的重量百分比为
首次发酵后取出85%菌液，留下15%菌液； 笫一次重复发酵后，取出80%菌液，留下20%菌液； 笫二次重复发酵后，取出75%菌液，留下25%菌液； 笫三次重复发酵后，取出70%菌液，留下30%菌液； 笫四次重复发酵后，取出60%菌液，留下40%菌液；
最后一次发酵后，取出全部菌液，再对菌液离心分离，将酵母泥送下道工序，然后废液排出，完成全部发酵。所述单罐发酵过程结束，是以菌体湿重达到250 350g/L为过程结束时间。本实施例发酵总时间160h，总共可获得约9kg干酵母。排放的金属离子废液量比图2所示常用方法减少了 70%。实施例2 与上述实施例1不同的是首次发酵后重复发酵5次，再经过最后一次发酵；发酵后取出用于分离酵母泥和上清液的菌液，和留下用作下一次重复发酵种子液的菌液，每次分别均为发酵罐中的菌液总量的重量百分比为取出70%菌液，留下30%菌液。重复发酵过程中按发酵罐中的发酵液总量计，每升发酵液流加甲醇的速率为20 mL/ h。本实施例发酵总时间160h，获得约8kg干酵母。排放的金属离子废液量比图2所示常用方法减少了 65%。本发明权利要求保护范围不限于上述实施例。
权利要求
1.一种毕赤酵母培养基重复发酵利用的方法，其特征在于，它包括下述步骤A、首次发酵在单罐中以甘油为碳源进行分批发酵，再经过甘油补料发酵，碳源饥饿， 然后进行甲醇补料发酵；B、重复发酵Bi、取出部分菌液用于分离出酵母泥和上清液在单罐发酵过程结束后，从发酵罐中的菌液总量中取出部分用于离心分离出酵母泥和上清液的菌液； B2、剩余菌液留作重复发酵种子液；B11、将酵母泥送下道工序将取出用于分离上清液和酵母泥的菌液进行离心分离，获得上清液和酵母泥，将酵母泥送下道工序；B12、将上清液灭菌后返回发酵罐中，继续进行以甲醇为碳源的重复发酵； 按上述重复发酵步骤进行若干次重复发酵；C、最后一次发酵Cl、取出上一次发酵全部菌液，用于分离出酵母泥和废液； C11、将酵母泥送下道工序； C12、将废液排出，完成全部发酵。
2.根据权利要求1所述的毕赤酵母培养基重复发酵利用的方法，其特征在于，在上清液灭菌后返回发酵罐中的过程中或过程结束后，同时补加灭菌水，使发酵体积达到初始装料体积；在重复发酵过程中流加甲醇。
3.根据权利要求2所述的毕赤酵母培养基重复发酵利用的方法，其特征在于，重复发酵过程中按发酵罐中的发酵液总量计，每升发酵液流加甲醇的速率为5 20 mL/ h。
4.根据权利要求1或2或3所述的毕赤酵母培养基重复发酵利用的方法，其特征在于， 所述发酵后取出用于分离酵母泥和上清液的菌液，和留下用作下一次重复发酵种子液的菌液，分别占发酵罐中菌液总量的重量百分比为取出60% 90%菌液，留下10% 40%菌液。
5.根据权利要求4所述的毕赤酵母培养基重复发酵利用的方法，其特征在于，首次发酵后重复发酵3 5次，再经过最后一次发酵。
6.根据权利要求5所述的毕赤酵母培养基重复发酵利用的方法，其特征在于，首次发酵后重复发酵4次，再经过最后一次发酵；发酵后取出用于分离酵母泥和上清液的菌液，和留下用作下一次重复发酵种子液的菌液，分别占发酵罐中菌液总量的重量百分比为首次发酵后取出85%菌液，留下15%菌液； 笫一次重复发酵后，取出80%菌液，留下20%菌液； 笫二次重复发酵后，取出75%菌液，留下25%菌液； 笫三次重复发酵后，取出70%菌液，留下30%菌液； 笫四次重复发酵后，取出60%菌液，留下40%菌液；最后一次发酵后，取出全部菌液，再对菌液离心分离，将酵母泥送下道工序，然后废液排出，完成全部发酵。
7.根据权利要求5所述的毕赤酵母培养基重复发酵利用的方法，其特征在于，首次发酵后重复发酵5次，再经过最后一次发酵；发酵后取出用于分离酵母泥和上清液的菌液， 和留下用作下一次重复发酵种子液的菌液，每次分别均为发酵罐中的菌液总量的重量百分比为取出70%菌液，留下30%菌液。
8.根据权利要求1或2或3所述的毕赤酵母培养基重复发酵利用的方法，其特征在于， 所述首次发酵，其碳源饥饿时间为1 池；在碳源饥饿后向发酵罐中流加含有10 15mL/ L的PTM1溶液的甲醇。
9.根据权利要求1或2或3所述的毕赤酵母培养基重复发酵利用的方法，其特征在于， 所述单罐发酵过程结束，是以菌体湿重达到250 350g/L为结束时间。
10.根据权利要求6所述的毕赤酵母培养基重复发酵利用的方法，其特征在于，首次发酵过程中，控制温度沘.5士0. 5°C，pH5. 0士0. 1，罐压0. 04 MPa，搅拌转速500 900rpm;发酵20 22h，DO迅速上升至100%，立即开始流加一定量的含有12mL/L的PTM1溶液的50% 甘油；碳源饥饿Ih后开始流加含有12mL/L的PTM1溶液的甲醇，设定初始流加速率SOmL/ h，每隔池，将补料速率提高50%，当补料速率为270mL/h时，维持这个补料速率；发酵过程中，如果DO低于20%，则降低补料速率，直到DO重新回到20%以上。
全文摘要
本发明涉及一种毕赤酵母培养基重复发酵利用的方法。其步骤为在单罐中以甘油为碳源进行分批发酵、甘油补料发酵、碳源饥饿、甲醇补料发酵首次发酵过程结束后，从发酵罐中取出部分菌液，同时留下部分菌液作为重复发酵的种子液；对取出部分菌液进行离心分离，获得酵母泥和上清液，再将上清液灭菌后回罐，作为重复发酵的营养液使用，而不是排放，如此重复发酵利用若干次。本发明优点是毕赤酵母发酵所用的基础盐溶液培养基得到回收利用，从而提高生产效率，降低成本，大大减少污染物排放，也促进了毕赤酵母的生产和应用。
文档编号C12R1/84GK102242153SQ20111011199
公开日2011年11月16日 申请日期2011年5月3日 优先权日2011年5月3日
发明者张东晓, 彭楠, 梁运祥, 王绩, 葛向阳, 赵述淼, 陈路 申请人:华中农业大学