专利名称：罗伦隐球酵母专用培养基及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及果实采后生防酵母的发酵培养的技术领域，特别是一种罗伦隐球酵母专用培养基及其用途。
背景技术：
利用拈抗酵母控制采后果实病害的生物防治技术是当前国内外非常关注的新型采后病害控制方法之一。罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)是国内外较广泛研究的采后生物防治酵母菌株，其拈抗机理涉及营养和空间竞争、与病原菌粘合、分泌β_1，3-葡聚糖酶、抗氧化胁迫、诱导果实抗性或抗性相关反应、降解病原菌分泌的真菌毒素和降解果实与激发病原菌孢子萌发相关的挥发物等。中国发明专利(专利号ZL200510090063. 1， 一种酵母拈抗菌的培养方法及其专用培养基)公开了一种罗伦隐球酵母的培养基配方， 该培养基的碳源选自柠檬酸、苹果酸或/和葡萄糖；氮源选自大豆蛋白胨、牛肉浸膏、肉蛋白胨或/和胰酶解蛋白胨；无机养分选自MgS04、CaCl2或/和MgCl2中的一种或几种冲国发明专利申请号200310115336. 4( —种生物拈抗菌及其应用)公开了一种利用罗伦隐球酵母和杀菌剂及氯化钙等防治甜樱桃、冬枣及苹果果实病害的方法；中国发明专利申请号200810128441. 4( —种生物活性果蔬保鲜膜)公开了一种利用罗伦隐球酵母和海藻酸钠等保鲜苹果和圣女果等果实的方法；中国发明申请号200910078858. 9 (葡萄果实采后病害或果粒脱落的防治方法及其专用防治剂)公开一种利用罗伦隐球酵母和硼酸盐等防治葡萄果实病害或脱粒的方法。中国发明专利(专利号ZL200510090065.0，酵母拈抗菌 C. laurentii的真空冷冻干燥制品及其制备方法)公开了一种罗伦隐球酵母冷冻干燥制品的制备方法；中国发明申请专利(申请号200910079774. 7，一种隐球酵母属菌胶囊剂及其制备方法)公开了一种制备罗伦隐球酵母常温保存的胶囊剂制备方法。但罗伦隐球酵母的液体培养基多为NYDB (nutrientyeast dextrose broth，营养酵母葡萄糖液体培养基)等天然培养基，其化学组成不明确，不但批次之间的平行性较差， 而且不利于进一步对培养基进行改进和优化。目前NYDB是目前最主要、也是最常用的NYDB培养基；其主要由牛肉浸膏，酵母粉， 葡萄糖和水组成。其中牛肉浸膏，酵母粉作为氮源为天然物质，实际为大量不同成分的混合体，其组分及含量在不同批次间会有一定差异，表现在不同氮源批次间PH会有一定差异 (PH值会在5 6之间波动)。中国发明专利(专利号ZL200510090063. 1，一种酵母拈抗菌的培养方法及其专用培养基)公开了一种罗伦隐球酵母的培养基配方中氮源仍为大豆蛋白胨、牛肉浸膏、肉蛋白胨或/和胰酶解蛋白胨等天然物质。利用天然物质的好处是由于成分多样，对酵母培养比较有利(指收获菌体数量而言)。但也由于是天然混合物质，成分及浓度(含量)在不同厂家、不同批次间会有一定差异，给基于该培养基的理论研究会带来一定负面的影响。例如，当需要研究一种具体物质对酵母培养及活性的影响时，会由于原有培养基中成分及含量的不确定给最后的实验结果及判断造成不利的影响。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种适合罗伦隐球酵母发酵培养的组分明确、可重复验证的合成培养基配方，该培养基对酵母自身生长和生防活力没有显著负面影响。其包括碳源、氮源、无机盐和微量元素、生长因子种类和数量的优化。为了解决上述技术问题，本发明提供一种罗伦隐球酵母的专用培养基，培养基由葡萄糖、硫酸铵、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、氯化钙、氯化钠、生物素、 L-天门冬氨酸、维生素B1和水组成，每IL培养基中含有葡萄糖10 20g，硫酸铵3 6g， 磷酸氢二钾1. 5 3g，硫酸镁1 6g，硫酸亚铁0 0. 02g，硫酸锰0 0. Olg、硫酸锌0 0. 02g、氯化钙0 0. 5g/L、氯化钠0 lg，生物素0. 4 0. 5mg，L-天门冬氨酸0. 2 0. 5mg， 维生素B1 0.2 lmg，其余为水，PH值3 8。作为本发明的罗伦隐球酵母专用培养基的改进每IL所述专用培养基中含葡萄糖10g，硫酸铵5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁3g，硫酸锌0. 005g，生物素0. 5mg，L_天门冬氨酸 0. 5mg和维生素B1 lmg,其余为水，PH值3 8 (较优的PH值为6 8)。其制备方法为 将葡萄糖、硫酸铵、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锌和水事先采用常规的高压灭菌(121°C，灭菌 20min)后备用，然后将生物素0. 5mg, L-天门冬氨酸0. 5mg和维生素B1 Img以及上述灭菌后的葡萄糖10g，硫酸铵5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁3g，硫酸锌0. 005g相混合，并用上述灭菌后的水定容至1L。作为本发明的罗伦隐球酵母专用培养基的进一步改进罗伦隐球酵母为保藏号为 CGMCC NO. 3590 的罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii) ZJU 10。本发明还同时提供了上述罗伦隐球酵母专用培养基的用途将罗伦隐球酵母按照体积比为0. 2 4%接种量接入所述专用培养基后，在200rpm、25 条件下培养M 120小时。罗伦隐球酵母的保藏名称为罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)ZJU 10， 保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2010年1月20日， 保藏号CGMCC NO. 3590。保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。该罗伦隐球酵母在申请号为201010152108. 4的专利中有明确告知。本发明提供的罗伦隐球酵母专用培养基由合成原料组成，具有组分明确、可重复验证等突出优点，有利于研究罗伦隐球酵母代谢调节规律，从而对进一步利用、开发罗伦隐球酵母的拈抗活性、研制安全高效、环境友好的绿色生物保鲜剂等具有重要意义。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。图1是不同培养基起始PH值对酵母生物量的影响。图2是酵母在本发明提供的合成培养基中的生长动态图。
具体实施例方式以下所用的NYDA培养基为牛肉浸膏8g，酵母粉5g，葡萄糖10g，琼脂20克，水定容至1000ml，常规高压(121 ，30分钟)灭菌。所用的NYDB种子培养基为牛肉浸膏Sg、 酵母粉5g、葡萄糖10g，水定容至1000ml，常规高压(121 ，30分钟)灭菌。
实施例11、罗伦隐球酵母菌种活化及种子液培养取出在4°C冰箱内保存的罗伦隐球酵母CGMCC NO. 3590，用划线接种的方法接种于 NYDA培养基中，在生化培养箱中活化4 后再在同样条件下活化培养1次。从活化好的罗伦隐球酵母斜面上挑取少许菌体接种于含有50mL NYDB培养基的 250mL锥形瓶中，在的摇床培养箱中培养Mh，转速200rpm。2、发酵培养基制备在250mL锥形瓶中按正交试验法L16 O15)加入各个培养基成分(见表1和表2，为每L中的重量g)，常规高压灭菌(121°C，灭菌20min)后备用(生物素、L-天门冬氨酸和维生素Bl采取过滤灭菌后加入)，用水定容至50mL。3、罗伦隐球酵母的发酵培养和生物量测定在无菌条件下，吸取ImL种子液接种于250ml灭菌后的发酵培养基中，在的摇床培养箱中培养Mh，转速为200rpm。测定生物量时先以5000转/分离心5min，弃去发酵上清液，然后用水清洗2次，最后在600nm波长下测定酵母悬浮液的吸光值。各个处理的实验结果为菌体培养液离心、稀释相同倍数后在600nm波长下所测的吸光值。4、实验结果从表2可知，处理7的配方所获得的酵母数量最大，此配方所含各个物质成分为葡萄糖10g/L、硫酸铵6g/L、磷酸氢二钾3g/L、硫酸镁3g/L、硫酸亚铁0. 01g/L、生物素0. 4mg/ L、L-天门冬氨酸0. ang/L、维生素B1 0. 2mg/ ；而硫酸锰、硫酸锌、氯化钠、氯化钙均为0。从表2的极差可以看出葡萄糖、硫酸铵、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰、 硫酸锌、氯化钠、维生素B1的极差大于0. 1，表明该试验条件下这些成份对罗伦隐球酵母生物量有较强的影响。而从表2的均值1、均值2可以看出，葡萄糖、磷酸氢二钾、硫酸锰、硫酸锌、维生素B1的均值1大于均值2，表明该试验条件下低剂量的上述物质对罗伦隐球酵母培养更有利；而硫酸铵、硫酸镁、硫酸亚铁、氯化钠、氯化钙、生物素、L-天门冬氨酸的均值2大于均值1，表明该试验条件下高剂量的上述物质对罗伦隐球酵母培养更有利。综合极差和均值结果，理论上以下成分的各个较佳使用浓度为葡萄糖10g/L，硫酸铵6g/L，硫酸镁3g/L， 硫酸亚铁0. 01g/L,氯化钠0. 5g/L，氯化钙0. 5g/L，生物素0. 4mg/L, L-天门冬氨酸0. 4mg/ L ；而磷酸氢二钾、硫酸锰、硫酸锌、维生素B1均为0。表1 L16 (215)正交试验表头
权利要求
1.罗伦隐球酵母专用培养基，其特征是每IL所述专用培养基中含有葡萄糖10 20g、硫酸铵3 6g、磷酸氢二钾1. 5 3g、硫酸镁1 6g、硫酸亚铁0 0. 02g、硫酸锰0 0. Olg、硫酸锌0 0. 02g、氯化钙0 0. 5g/L、氯化钠0 lg、生物素0. 4 0. 5mg、L-天门冬氨酸0. 2 0. 5mg和维生素& 0.2 lmg，其余为水，pH值3 8。
2.根据权利要求1所述的罗伦隐球酵母专用培养基，其特征是每IL所述专用培养基中含葡萄糖10g，硫酸铵5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁3g，硫酸锌0. 005g,生物素0. 5mg, L-天门冬氨酸0.5mg和维生素& lmg，其余为水。
3.根据权利要求1或2所述的罗伦隐球酵母的专用培养基，其特征是所述罗伦隐球酵母为保藏号为CGMCC NO. 3590的罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii) ZJU 10。
4.如权利要求1 3中任意一种罗伦隐球酵母的专用培养基的用途，其特征是将罗伦隐球酵母按照体积比为0. 2 4%接种量接入所述专用培养基后，在200rpm、25 28 V 条件下培养24 120小时。
全文摘要
本发明公开了一种罗伦隐球酵母专用培养基，每1L专用培养基中含有葡萄糖10~20g、硫酸铵3~6g、磷酸氢二钾1.5~3g、硫酸镁1~6g、硫酸亚铁0~0.02g、硫酸锰0~0.01g、硫酸锌0~0.02g、氯化钙0~0.5g/L、氯化钠0~1g、生物素0.4~0.5mg、L-天门冬氨酸0.2~0.5mg和维生素B10.2~1mg，其余为水，pH值3~8。本发明还同时公开了上述罗伦隐球酵母的专用培养基的用途将罗伦隐球酵母按照体积比为0.2~4%接种量接入专用培养基后，在200rpm、25~28℃条件下培养24~120小时。
文档编号C12R1/645GK102199552SQ20111011249
公开日2011年9月28日 申请日期2011年5月2日 优先权日2011年5月2日
发明者余挺, 卢黄娉, 杨林, 蓝天演, 郑晓冬 申请人:浙江大学