一种从胎盘绒毛膜组织中提取造血干细胞的方法及造血干细胞库的构建方法

专利名称：一种从胎盘绒毛膜组织中提取造血干细胞的方法及造血干细胞库的构建方法
技术领域：
本发明涉及一种从胎盘绒毛膜组织中提取造血干细胞的方法，特别是指一种从胎盘绒毛膜组织中提取⑶133阳性干细胞的方法，及利用提取的⑶133阳性干细胞构建造血干细胞库的方法。
背景技术：
造血干细胞(Hemopoietic Stem cell, HSC)的干，译自英文“stem”,意为“树”、“干”和“起源”。类似于一棵树干可以长出树杈、树叶，并开花和结果等。通俗地讲，造血干细胞是指尚未发育成熟的细胞，是所有造血细胞和免疫细胞的起源，它不仅可以分化为红细胞、白细胞和血小板，还可跨系统分化为各种组织器官的细胞，具有自我更新、多向分化 和归巢(即定向迁移至造血组织器官)潜能。一般造血干细胞来源于三个渠道骨髓造血干细胞；外周造血干细胞；脐带血造血干细胞。胎盘是胎儿和母亲血液交换的场所，含有非常丰富的血液微循环。人在母亲子宫内发育的阶段，胎盘是首先形成的器官之一。这表明在胚胎干细胞的发育、分化过程中，在胎盘中滞留有大量的早期干细胞，而且很有可能这些干细胞在胎盘内还继续保持着造血干细胞的能力。胎盘内含有丰富的各个阶段早期造血干细胞，⑶34自发现以来一直作为干细胞表面标志物。它无种属特异性，选择性表达于造血干细胞，在血管内皮细胞也有表达。CD133即 AC133,也被称做Promininl ；hematopoitic stem cell antigen ；Prominin-Iike I,是一种跨膜蛋白，属于Prominin家族成员，相对分子质量为120ka, 1997年Miraglia等[Miraglia S,Godffey ff,Yin AH,et al. A novel five trans membrance h ematopoieticstem cell antigen !isolation, characterization, and molecular cl oning [J].Blood, 1997,90(12) :5013-5021]将其作为新的造血干细胞表面抗原提出。与CD34抗原不同的是，⑶133在晚期祖细胞，如前B细胞、红系集落形成单位(colony formingunit-erythrocyte, CFU-E)、粒系集落形成单位(colony forming unit-granulocyte,CFU-G)上不表达。⑶133主要表达于成人、胎儿骨髓，脐血，胎肝等造血组织的⑶34+细胞亚群上，代表比⑶34+更原始的造血干/祖细胞亚群。2005年，美国加州大学Mikkola教授首次报道胎盘是胎儿的一个主要造血器官(Dev Cell 8 :365_75，2005 ;Cell Stem Cell2:252-263,2008)。2009年，Kuypers教授等人发现人足月胎盘是一个造血器官(Exp BiolMed, 234 :813-823，2009)，这一结论随后被许多实验室证实。人足月胎盘可以提供大量的⑶133阳性细胞以及其他原始的造血祖先细胞，适合人类移植。而且目前公认⑶133阳性的造血干细胞比CD34阳性造血干细胞更早期，由胎盘取得的造血干细胞或培养出的群落形成单元的总数量可以是同一来源脐带血可得造血干细胞的10倍。⑶133阳性细胞具有长期培养起始细胞(Long-term culture-initiating cells,LTC-IC)和长期重建造血细胞(Long term repopulation cells, LTRC)的能力，为最原始的造血细胞,移植给宿主后可以长期植活。此外，最近研究发现LTC-IC主要见于⑶133阳性⑶34阳性亚群，一小群⑶133阳性/⑶34阴性细胞也具有长期增殖潜能，故认为⑶133为原始造血细胞群(包括⑶34阴性细胞)标志。Rappold等所做的脐带血⑶34和⑶133分选研究发现同一份标本的⑶34+细胞扩增潜能低于⑶133+细胞。因此⑶133分选可能优于⑶34分选。⑶133还可以作为其它非造血干、祖细胞的表面标志，如神经干细胞(neural stemcell, NSC)。Stamm等进行的体外实验证实，外周血来源的⑶133+细胞可以分化为神经细胞，具有临床应用前景，可用于一些神经系统疾病的细胞治疗，包括脊髓损伤，阿尔茨海默综合征和帕金森氏病。血管内皮前体细胞(EPCs)区别于成熟内皮细胞的主要标志是⑶133。经研究发现内皮细胞不能结合⑶133的抗体。证实分化成熟的内皮细胞不具有⑶133。这些说明⑶133可以作为EPCs区别于成熟内皮细胞的一个表面标志。许多学者从脐带血和骨髓中分选出CD 133阳性细胞，体外培养证实能够分化为内皮细胞。因此有人提出，既然CD133+细胞在体外可以分化为内皮细胞，那么体内试验可能会在心肌梗塞患者中，通过血管再生改善患者 心功能。目前已经进入临床研究阶段。Bonanno等研究发现临床级分选脐带血⑶133阳性细胞可以得到适量原始造血前体细胞，这些细胞具有很高造血活性以及体外间充质细胞的潜能。目前分离胎盘干细胞的方法有机械分离法，灌洗法、胶原酶消化法，机械分离法对细胞损伤大且分离费时费力，不利于产业化，灌洗法主要用于成血管细胞，且细胞得率低；胶原酶消化法国内周胜利等的专利从胎盘组织中提取造血干细胞用于建立造血干细胞库的新方法(专利号01131190. 8)中提到，主要是分选组织来源的⑶34阳性细胞，其应用单一胶原酶消化胎盘组织15分钟，但上述方法只能得到极少量细胞，细胞数远远低于机械分离得到的细胞数。

发明内容
有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种操作简单方便的从胎盘组织中提取⑶133阳性干细胞的方法。从胎盘组织中提取⑶133阳性干细胞建立干细胞库用于临床治疗是本发明的要旨，实现这一技术方案是采用多酶消化法。本发明使用的多酶消化技术，可以快速将整个胎盘组织消化成单细胞，而且得到的细胞混悬液粘稠度不高，有利于浓缩细胞。本发明的提取的⑶133阳性造血干细胞流程方便、成本较低、一次可以快速处理一整个胎盘，且单核细胞数量多，可达5-10 X IO9个细胞，其中⑶133阳性含量高达2. 0-5. 0 %。该技术也适合构建造血干细胞库，所保存的造血干细胞可用于成人多次使用，可长期存放，便于随时取用。本发明的技术方案概括如下(I)采集胎盘及母血、脐带血，对采集的样品进行相关病原微生物检测；将采集信息录入系统；
(2)绒毛膜组织块在无菌条件下，用缓冲盐溶液反复冲洗，清除其中的血凝块和积血；(3)用酶消化的方法得到消化后的混合液，将混合后的消化液用滤网过滤得到细胞悬液；(4)用离心法浓缩细胞悬液后加入沉淀剂，并将其转入离心袋中；
(5)先用低离心力离心分离法将混合液中的红细胞和组织块杂质分离，去除红细胞和组织块杂质；(6)再用高离心力离心分离法将离心袋中的有核细胞浓缩，获得富含⑶133阳性细胞的混合物；(7)将离心袋中的胎盘造血干细胞转移至冻存管/袋中，并加入冻存保护剂；(8)将加有冻存保护剂的胎盘造血干细胞降温，放入液氮暂存库暂存；(9)对分离后细胞进行HLA配型、CD133阳性细胞含量检测、单核细胞计数、内毒素和微生物检测检测，将合格细胞转入液氮长期保存，并将相关信息录入系统。根据上述方法，我们达到了以下效果⑴可以对整个胎盘进行处理；⑵处理时间短，只有3个小时左右，最大程度的保持细胞特性；(3)细胞数量多，可达5-10 X IO9个/胎盘；(4)⑶133阳性率高，达到3. 0-6.0%，完全可以满足成人多次使用；(5)本发明最大的优 点是直接从胎盘组织中富集足够数量的CD133阳性干细胞。


图I为分离后的绒毛膜来源细胞免疫表型分析结果图；图2为胎盘绒毛膜来源⑶133阳性细胞的⑶133分选后流式表型分析图；图3为胎盘绒毛膜来源⑶133阳性细胞用内皮分化培养基培养后细胞⑶31表型检测图；图4为胎盘绒毛膜来源⑶133阳性细胞在N0D/SCID鼠体内重建造血的人⑶45阳性比例检测图。
具体实施例方式实施例一胎盘来源细胞的分离I.胎盘的采集，在产妇知情同意的情况采集胎盘。用无菌生理盐水冲洗胎盘，然后将胎盘装入专用的无菌采集盒中，并加入采集液。随后将胎盘4°C运输到实验地点，运输胎盘的时间不超过48小时。2.胎盘绒毛膜组织造血干细胞的分离(I)用机械的方法分离出绒毛膜组织；(2)将组织剪碎至0. 1-1立方厘米，然后用磷酸盐溶液反复冲洗组织块5次以上，使组织块无明显的血凝块及其它杂物；(3)按照与组织体积比I : I的比例加入胶原酶、胰酶和透明质酸酶和DNA酶的混合物，37°C恒温消化60分钟；⑷羟乙基淀粉与消化液I : 6加入，用三联袋离心的方法，先以50g离心10分钟，弃红细胞，然后再以500g离心10分钟，得到绒毛膜组织细胞，其中富含CD133阳性干细胞；(5)将绒毛膜组织细胞用保护液重悬到45体积，在其中加入5毫升的DMS0，然后以0. 5毫升/管取样4份，一份用来计数，另外几份留样做配型等相关检测；将剩余48毫升细胞悬液转入冻存袋，通过程序降温后转入液氮中保存。3.流式细胞仪分析。将分离后的细胞按每个样本I X IO6细胞分管，按专业人士熟知的方法使用抗体标记后，用PBS重悬到400 u L装入流式管。用BD公司FACS Calibur流式细胞分析仪检测、分析。如图I所示结果我们分离的细胞主要来源于胎盘组织(只有2. 36%的血细胞)，分离的细胞群包括总细胞4. 04%的⑶133阳性细胞，总细胞20%左右的⑶73阳性和⑶105阳性的间充质干细胞。实施例二 胎盘绒毛膜来源⑶133阳性细胞的分选分选方法同实施例一，仅将来源换为胎盘绒毛膜组织。将分选后的细胞，通过使用专业人士都熟知的磁珠分选方法，从胎盘来源细胞分理出CD133阳性细胞。图2所示结果通过⑶133磁珠分选后，获得的⑶133阳性细胞纯度为总细胞的93. 07%。实施例三胎盘绒毛膜来源⑶133阳性细胞分化成内皮细胞
图3所示结果用间充质干细胞培养基培养后的细胞(中图)CD31阳性比例为2. 85%，用内皮细胞培养基培养后的细胞(右图)⑶31阳性比例为74. 36%。实施例四胎盘绒毛膜来源细胞重建照射后N0D/SCID鼠的造血系统以勃脉力A溶液重悬胎盘绒毛膜来源细胞，调整细胞浓度5xl07个/毫升(高剂量组)和IxlO7个/毫升(低剂量组)。按表I将动物分组，经尾静脉输入100微升的相应剂量的细胞或勃脉力A溶液。细胞植入6周后，取存活小鼠骨髓分离单个核细胞，以流式细胞仪检测骨髓和外周血中表达人⑶45+细胞数，检测移植胎盘绒毛膜来源⑶133阳性细胞植入情况。图4所示结果在N0D/SCID鼠骨髓内人的⑶45阳性细胞比例，高剂量组植入率83. 73±23. 20%，低剂量组植入率29. 83±13. 01% ;中图为高剂量组最高植入率和右图为低剂量组最高植入率。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种从胎盘绒毛膜组织中提取造血干细胞的方法，包括以下步骤 米集胎盘； 用机械的方法将胎盘绒毛膜处理成组织块； 在无菌条件下，用磷酸盐溶液将所述组织块反复冲洗； 用酶消化所述组织块得到消化后的混合液，将混合液过滤得到细胞悬液； 用离心法移出血浆，并浓缩细胞悬液，获得富含造血干细胞的混合物。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述造血干细胞为CD133阳性干细胞。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，对采集的胎盘进行了病原微生物检测。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述离心法为两步离心法，即先用低离心力移除混合液中的红细胞和组织块杂质，再用高离心力将离心袋中的造血干细胞浓缩，获得富含⑶133阳性细胞的混合物；
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，还包括储存方法，即将所述富含造血干细胞的混合物转移至冻存管中，加入冻存保护剂；将加有冻存保护剂的造血干细胞降温，放入液氮中储存。
6.一种根据权利要求1-5任意一种方法获得的造血干细胞。
7.一种利用权利要求6所述的造血干细胞建造造血干细胞库的方法，其特征在于，还包括在分离前将胎盘的采集信息录入系统； 对分离后造血干细胞进行检测，将合格造血干细胞转入液氮长期保存，并将相关信息录入系统的方法。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述造血干细胞为CD133阳性干细胞。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述检测包括HLA配型、CD133阳性细胞含量检测、单核细胞计数、内毒素和微生物检测。
全文摘要
本发明公布了一种从胎盘绒毛膜组织中提取CD133阳性干细胞的方法。(1)采集胎盘，将胎盘采到胎盘采集盒中，加入保护液；(2)在胎盘进入分离干细胞的操作之前进行信息登记及血清学病毒检测；(3)清洗掉胎盘组织中血凝块及积血；(4)采用机械的方法分离胎盘干细胞；(5)浓缩、纯化胎盘干细胞，提取胎盘来源CD133阳性干细胞；(6)保存CD133阳性干细胞。保存的CD133阳性细胞可以用于造血干细胞移植，血管再生、神经损伤修复等。本发明的制作CD133阳性干细胞流程方便、成本较低、一次可以快速处理一整个胎盘，且单核细胞数量多，CD133阳性干细胞的含量高达2.0-5.0％。该技术也适合构建CD133阳性干细胞库，所保存的CD133阳性干细胞可用于成人多次使用，可长期存放，便于随时取用。
文档编号C12N5/0735GK102757935SQ20111011203
公开日2012年10月31日 申请日期2011年4月29日 优先权日2011年4月29日
发明者王涛, 邵元康, 韩忠朝 申请人:北京汉氏联合生物技术有限公司