专利名称：斜生纤孔菌鲨烯合酶基因及其编码的蛋白质和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学、基因工程技术领域。具体地，本发明涉及一种在斜生纤孔菌中表达的IoSQS蛋白(斜生纤孔菌鲨烯合酶蛋白，honotus obliquus squalene synthase, IoSQS)及其核酸序列，是斜生纤孔菌鲨烯合酶基因及其编码的蛋白质和应用。
背景技术：
斜生纤孑L 菌 Inonotus obliquus (Pers. :Fr. ) J. Schroet.,俗称舊甘(chaga)、 桦树茸、白桦茸，属于担子菌门(Basidiomycota)、层菌纲(Hymeno-mycetes)、非褶菌目 (Aphyllophorales)、 秀革孑L菌禾斗(Hymenochaetaceae)、揭孑L菌属(Inonotus),主要分布于北纬45° -50°地区，在我国主要生长于吉林、黑龙江、西藏、青海等高海拔山区的桦属树木上，形成显著的黑色瘤状菌核。斜生纤孔菌作为药用真菌具有抗肿瘤、防治艾滋病、抗衰老、增强免疫、防治糖尿病等疗效。其药效作用主要跟斜生纤孔菌中的三萜类化合物桦褐孔菌醇、白桦脂醇等的活性有关。研究发现桦褐孔菌醇在野生斜生纤孔菌原药材中的含量可达0. 2%，而人工培养的斜生纤孔菌菌丝体中，桦褐孔菌醇的含量大大降低。随着野生资源的日益枯竭及对药用真菌斜生纤孔菌需求量的日益增加，有必要通过现代生物技术提高人工培养斜生纤孔菌菌丝体桦褐孔菌醇及其前体的含量来满足人们对斜生纤孔菌的需求。鲨烯合酶(Squalene Synthase)，简称SQS，它催化两个分子的法呢基焦磷酸生成鲨烯，第一步反应是两分子的FPP通过异戊烯基转移反应缩合成前鲨烯焦磷酸(PSQPP)，并释放出一分子无机二磷酸。在该过程中，其中一个FPP的C(I)-CQ)的双键作为另一个FPP 的异戊烯基受体；第二步反应是PSQPP在NADPH作为供氢体的情况下，通过正碳离子重排转化为鲨烯，该反应发生在细胞中的光面内质网上。鲨烯合酶在三萜、留醇的生物合成中起着关键的作用。由于鲨烯合酶催化的底物FPP处十类异戊二烯代谢途径中的分支点，因此，调控鲨烯合酶的活性能够直接影响留醇、三萜类以及以FPP为前体物的其他类异戊二烯化合物的生物合成。因此利用现代生物技术将SQS基因导入斜生纤孔菌中，获得转基因的真菌菌株，并进行大规模的培养，是实现从根本上提高桦褐孔菌醇等三萜类物质含量的最佳途径。￠)(寸iLi·白勺 巾，“Journal of microbiology and biotechnology (it^ 物学和生物技术杂志)，2007，17 (7) :1106-1112”等报道了从灵芝中克隆了鲨烯合酶基因， 但至今尚未发现有与本发明主题相同的文献报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种斜生纤孔菌Io-SQS蛋白编码序列。使其包含所述基因的融合基因构建体，携带该构建体的新的重组表达载体，被所述的表达载体转化真菌原生质体细胞，以及由转化原生质体产生的所述基因的转基因菌株及其后代，包括菌丝体及发酵液，所获得的转基因菌株将具有显著提高的桦褐孔菌醇等三萜类化合物含量。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的—种斜生纤孔菌鲨烯合酶基因，为以下核苷酸序列之一1)所述基因具有SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列；2) SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列；3) SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列其等位基因及衍生的核苷酸序列。一种斜生纤孔菌鲨烯合酶基因编码的蛋白质，具有以下氨基酸之一1)所述蛋白质具有SEQ ID No. 2中所示的第1_491位的氨基酸序列所构成；2) SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。含有本发明的斜生纤孔菌鲨烯合酶基因全序列或部分片段的重组载体，均属于本发明的保护范围。这些重组载体包括质粒和真菌表达载体。含有本发明的斜生纤孔菌鲨烯合酶基因的宿主细胞，如含有上述重组载体的宿主细胞也属于本发明的保护范围。所述宿主细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞、酵母细胞或一些真菌的原生质体。优选大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或斜生纤孔菌原生质体。本发明的斜生纤孔菌鲨烯合酶基因的应用，包括用所述的真菌表达载体转化斜生纤孔菌原生质体；斜生纤孔菌鲨烯合酶基因序列提供一种转基因斜生纤孔菌菌株。具体解释说明如下本发明所分离出的DNA分子包括编码具有斜生纤孔菌Io-SQS蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID No. 1中从核苷酸第109-1584位的核苷酸序列至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55°C条件下与SEQ ID No. 1中从核苷酸第109-1584位的核苷酸序列杂交。所述的编码具有SEQ ID No. 2所述的氨基酸序列的多肽。所述的序列具有SEQ ID No. 1中从核苷酸第109-1584位的核苷酸序列所构成。本发明分离出的斜生纤孔菌Io-SQS蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO. 2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。所述的蛋白多肽是具有SEQ ID NO. 2序列的多肽。本发明所提供的载体DNA分子转化的宿主原生质体，它是真核细胞。该宿主原生质体包含所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。在本发明中，“分离的”、“纯化的，，DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。在本发明中，术语“斜生纤孔菌Io-SQS蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有斜生纤孔菌Io-SQS蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO. 1中第109-1584位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO. 1序列的编码框第109-1584位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO. 1中第109-1584位核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQ ID N0. 2所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO. 1中从核苷酸第109-1584位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO. 1中从核苷酸第109-1584位的核苷酸序列的同源性至少70 %，较佳地至少80 %，更佳地至少90 %，最佳地至少95 %的核苷酸序列。该术语还包括能编码具有与天然的斜生纤孔菌Io-SQS蛋白相同功能的蛋白的 SEQ ID NO. 1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个 (通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和 /或取代，以及在5 ’和/或3 ’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。在本发明中，术语“斜生纤孔菌Io-SQS蛋白或多肽”指具有斜生纤孔菌Io-SQS蛋白活性的SEQ ID NO. 2序列的多肽。该术语还包括具有与天然斜生纤孔菌Io-SQS蛋白相同功能的SEQ ID NO. 2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内， 更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时， 通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括斜生纤孔菌Io-SQS蛋白的活性片段和活性衍生物。本发明的斜生纤孔菌Io-SQS蛋白多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与斜生纤孔菌Io-SQS 蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用斜生纤孔菌Io-SQS蛋白多肽的血清获得的多肽或蛋白。在本发明中，“斜生纤孔菌Io-SQS蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID N0. 2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。表1.保守性变异多肽中的取代残基
权利要求
1.斜生纤孔菌鲨烯合酶基因及其编码的蛋白质和应用，斜生纤孔菌鲨烯合酶基因的特征在于所述的核苷酸序列由SEQ ID NO. 1中第109-1584位的核苷酸序列所构成；所述的氨基酸序列由SEQ ID NO. 2中第1-491位的氨基酸序列所构成。
2.根据权利要求1所述的斜生纤孔菌鲨烯合酶基因及其编码的蛋白质和应用，其质粒的特征在于所述质粒含有权利要求1所述的斜生纤孔菌鲨烯合酶基因的完整编码阅读框序列。
3.根据权利要求1所述的斜生纤孔菌鲨烯合酶基因及其编码的蛋白质和应用，其真菌表达载体的特征在于所述真菌表达载体含有权利要求1所述的斜生纤孔菌鲨烯合酶基因的完整编码阅读框序列。
4.根据权利要求1所述的斜生纤孔菌鲨烯合酶基因及其编码的蛋白质和应用，其应用的特征在于用权利要求4所述的真菌表达载体转化斜生纤孔菌原生质体。
5.根据权利要求1所述的斜生纤孔菌鲨烯合酶基因及其编码的蛋白质和应用，其应用的特征在于用权利要求1所述的斜生纤孔菌鲨烯合酶基因序列提供的一种转基因斜生纤孑L菌。
全文摘要
本发明公开了一种斜生纤孔菌鲨烯合酶基因及其编码的蛋白质与用途，本发明所提供的鲨烯合酶基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。所示基因编码的蛋白质具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。本发明提供的鲨烯合酶基因可以通过基因工程技术提高斜生纤孔菌中桦褐孔菌醇的含量，可用于利用转基因技术来提高斜生纤孔菌中桦褐孔菌醇含量的研究和产业化中。而这些次生代谢产物在临床上具有抗肿瘤、防治艾滋病等潜在的应用价值，对保护人民的健康生长有所帮助。因而本发明具有很大的应用前景。
文档编号C12N9/12GK102399798SQ20111018878
公开日2012年4月4日 申请日期2011年7月2日 优先权日2011年7月2日
发明者冯友建, 孙勇, 曹小迎, 李长根, 王力, 蒋继宏, 郑竹君, 魏江春 申请人:徐州师范大学