专利名称：一种用于麦芽糖生产的固定化催化剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种淀粉加工为麦芽糖的专用固定化催化剂及其制备方法，属于酶工程和农副产品深加工技术领域。
背景技术：
麦芽糖具有较高的营养价值，其甜度只有蔗糖的1/3，比蔗糖更为适口。在食品工业上主要有以下应用特点1)麦芽糖不参加胰岛素代谢，有利于糖尿病的防治；2)结晶性低，有防止淀粉凝聚的作用；3)热稳定性高，耐酸稳定性高，焦化性低，受热不易产生有色物质；4)具有较小的吸水性，一般吸收69Γ12%的水分后，就不再吸水也不再释放水分，有助于抑制糖果的脱水，使糖果保持柔软而延长糖果的货架期；5)适合于连续真空薄膜熬糖和浇模成型，尤其对制造硬糖效果明显，并可降低糖果的粘度，提高糖果的风味。在医药上，由于麦芽糖在人体代谢中不需胰岛素就能被吸收，因此是糖尿病患者的营养剂和辅助冶疗剂， 用纯麦芽糖输液滴注静脉。此外，麦芽糖还是多种重大产品(如海藻糖、异麦芽糖)的原料。麦芽糖的生产是通过水解淀粉制得，通常以麦芽糖浆形式作为产品形式，也有高纯度结晶麦芽糖产品形式。麦芽糖浆是以淀粉为原料，经酶法水解而制成的一种以麦芽糖为主的糖浆，按制法与麦芽糖含量不同可分为饴糖、高麦芽糖浆和超高麦芽糖浆等(表1)。表1各类麦芽糖浆的主要糖组成成分
权利要求
1.一种重组酵母，命名为酿酒酵母Qsaccharomyces cerevisiae) HH20110602,所表达的β-淀粉酶经过酵母α凝集素在酿酒酵母W303-1A细胞表面锚定而得到固定，获得重组酵母，已保藏于中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO =M 2011220。
2.一种用权利要求1所述重组酵母制备的用于高麦芽糖浆生产的固定化催化剂，其特征在于本质为β -淀粉酶，通过将β -淀粉酶分子在酿酒酵母W303-1A细胞表面锚定实现其固定化的；所述固定化催化剂即为固定化淀粉酶；所表达的β-淀粉酶经过酵母α凝集素在酿酒酵母W303-1A细胞表面锚定而得到固定，获得重组酵母CCTCC NO =M 2011220，进一步大规模培养此重组酵母细胞，离心收获细胞，用戊二醛溶液悬浮和紫外线下照射此重组酵母，获得固定化β -淀粉酶；酶活为50 250 DPVg ；PH为3. 0 10. 5，温度为55 75°C，固定化催化剂稳定。
3.权利要求2所述的固定化催化剂的制备方法，其特征在于步骤为1)制备β-淀粉酶基因以红薯为原料，用十六烷基三甲基溴化铵法提取红薯 RNA，用反转录技术获得其cDNA，以cDNA为模板，设计引物扩增β -淀粉酶基因β，PCR 扩增条件是是95°C预变性5 min;以94°C 1 min,54°C 1 min、72°C 2 min进行循环30 轮；最后72°C延伸10 min ；所述PCR所用引物为BB-F5’ -ATGGCTCCAATCCCCGGT-3’，BB-R:5' -ATAAAAGAGCTTTTGGCGCTAATCAAACGGGTTTGAGCCAT-3，；2)制备α凝集素编码基因eig-Sc以酿酒酵母W303-1A基因组DNA为原料，用多聚酶链反应PCR技术扩增来源于酿酒酵母染色体W303-1A的α凝集素编码基因<^-5b，反应条件是95°C 预变性 5 min;以 94°C 30 s、56°C 1 min, 72 °C 2 min 进行循环 30 轮；最后 72°C 延伸10 min ；所述PCR扩增f-5b，所用引物为AF:5' -TGGCTCAAACCCGTTTGATTAGCGCCAAAAGCTCTTTTATC-3’，AR:5，- TTTGATTATGTTCTTTCTAT-3，；所述酿酒酵母W303-1A来源于中国典型培养物保藏中心；3)制备融合基因amy-β ~agSc 利用重叠PCR的方法，将上述β -淀粉酶基因amy- β 和α凝集素编码基因ag-Sc在读框内进行融合，获得融合基因amy- β ~agSc ；所述重叠PCR，所用引物为上游引物 BB-F:5’ -ATGGCTCCAA TCCCCGGT- 3，，下游引物 AR: 5’ -TTTGATTATGTTCTTTCTAT- 3'；PCR 程序如下95°C 预变性 5 min;以 94°C 30 s、55°C 1 min、72°C 3 min 进行 30 个循环；72°C延伸 10 min ；4)制备重组酵母CCTCCNO =M 2011220 将质粒pMGK经酶切纯化、pfu聚合酶补平纯化后与上述融合基因β -ag-Sc连接，获得重组质粒pBA-AG，将该重组质粒pBA_AG 经fecll线性化，电转化入酿酒酵母W303-1A中，转化液涂布于G418浓度为300 μg /mL的 YPD平板，30°C培养3 5d，挑取转化子点种于YPGS平板(YNB 0. 34%，硫酸铵1%，淀粉1%，葡萄糖0.5%)30°C培养2 d后用碘液染色，筛选转化子，由此获得了淀粉酶锚定于其表面的重组酵母 CCTCC NO :Μ 2011220 ；5)发酵收获细胞在15 1000L发酵罐中分别加入70%体积的培养基，其质量浓度为1% 3%葡萄糖、0. 5% 2. 5%酵母膏、0. 5% 3. 0% NaCl、其余为超纯水、pH 3. 5 5. 5的培养基；将重组酵母CCTCC NO =M 2011220以体积比为0.5% 10%接入培养基中，控制温度为 300C 士2°C、溶氧不低于20%、ρΗ4. 0 5. 0下培养48 72 h，收获细胞；6)用0.广1倍该细胞体积的0.19Γ1. 5%戊二醛溶液悬浮细胞，再在1(T30 cm紫外线下照射3(T120 min，4(TC以下低温烘干至水分小于5%，获得产品固定化β-淀粉酶，即固定化催化剂。
4.权利要求2所述的固定化催化剂的应用，其特征在于此固定化催化剂用于高麦芽糖浆生产，分批或连续使用；反复使用10次以上。
全文摘要
本发明涉及一种用于麦芽糖生产的固定化催化剂及其制备方法，属于酶工程和农副产品深加工技术领域。本发明以红薯为原料，用反转录技术提取其β-淀粉酶基因，再与来源于酿酒酵母的α凝集素编码基因在读框内进行融合，融合基因转化酿酒酵母W303-1A，获得了β-淀粉酶在酵母表面锚定的酿酒酵母，进一步大规模培养此重组酵母细胞，收获细胞，用化学、物理方法稳定和交联此重组酵母，获得固定化β-淀粉酶，该酶活为50~250DPo/g。运用该固定化β-淀粉酶可从液化淀粉直接生产出55%~65%的高麦芽糖浆；此固定化β-淀粉酶反复使用10次，酶活丢失率小于20%。
文档编号C12P19/22GK102277308SQ20111021577
公开日2011年12月14日 申请日期2011年7月29日 优先权日2011年7月29日
发明者左志锐, 沈微, 王正祥, 石贵阳 申请人:江南大学