专利名称：乙型肝炎病毒耐药基因突变的检测探针、检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体涉及与乙型肝炎病毒的核苷类似物治疗耐药性相关的基因突变检测。
背景技术：
乙型肝炎病毒(h印atitis B virus, HBV)属啫肝DNA病毒科，基因组长约3. 2Kb， 为部分双链环状DNA。乙型肝炎是全球广泛分布的传染病，但不同地区HBV感染的流行强度差异很大。据世界卫生组织报道，全球约20亿人曾感染过HBV，其中3. 5亿人为慢性HBV 感染者，每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝癌。2006年全国乙型肝炎流行病学调查结果表明，我国1 59岁一般人群乙肝病毒表面抗原(HBV surface antigen, HBsAg)携带率为7. 18%，5岁以下儿童的HbsAg携带率仅为0. 96%。据此推算， 我国现有的慢性HBV感染者约有9300万人，其中慢性乙型肝炎患者约2000万例。我国每年因肝病死亡的约有30万人左右。近年来，慢性乙型肝炎的治疗取得了很大改善，目前获得批准的用于治疗慢性乙型肝炎的药物有两大类，一类是干扰素，一类是核苷类似物。目前已经上市的核苷类似物药物有5种，分别是拉米夫定(Lamivudine，LAM, 1998年上市)、阿德福韦酯(Adefovir，ADV, 2002 年上市)、恩替卡韦(Entecavir, ETV，2005 年上市)、替比夫定(Telbivudine, LDT， 2007年上市)、替诺福韦(Tenofovir，TDF)、恩曲他滨(Emtricitabine, FTC)。这类药物是通过干扰病毒的逆转录过程和抑制DNA合成来抑制病毒DNA的复制，使患者的病毒DNA水平快速下降。这类药物的优势在于口服药物且安全可靠。但是核苷类似物药物只能抑制病毒复制，而不能根除病毒，因此需要长期使用。而随着核苷类药物在国内使用频率及年限的增加，HBV耐药突变率逐年增高，例如1998年批准使用的拉米夫定(LAM)，治疗1 4年的基因耐药率分别为14%、38%、49%、66%，且呈现继续上升趋势，其他类药物也出现不同程度的耐药性。目前报道的核苷类似物药物拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦、恩曲他滨在中国人群中常见的耐药基因突变位点有18个。rtV173L、rtL179P、rtL180M、 rtA181V/T、rtT184A/G/I/S、rtA194T/M、rtA200V、rtS202G/I、rtM204V/I/S、rtV207M/I/ L、rtS213T、rtV214A、rtQ215S、rtN236T、rtP237H、rtN238T/D、rtK241E、rtM250V。其中， rtV173L、rtM204V/I/S、rtL180M 与恩曲他滨的耐药有关；rtV173L、rtL179P、rtL180M、 rtA200V、rtM204V/I/S、rtV207M/I/L、rtS213T 与拉米夫定的耐药有关；rtV173L、rtL180M、 rtT184A/G/I/S、rtS202G/I、rtM204V/I/S、rtM250V 与恩替卡韦的耐药有关；rtM204V/I/ S与替比夫定耐药有关，rtA194T/M与替诺福韦耐药有关；rtA181V/T、rtK241E、rtQ215S、 rtN236T、rtP237H、rtN238T/D、rtV214A与阿德福韦酯耐药有关。耐药位点基因突变导致病人对核苷类似物产生耐药后，病人血清的谷丙转氨酶水平和病毒DNA水平升高，甚至病情恶化。
因此，建立简单、快速的乙型肝炎病毒耐药基因突变检测方法，能够监测上述18 个耐药基因突变位点中的一个或数个的突变情况，及时发现病人的耐药性情况，从而调整用药和治疗方案，这对于促进乙型肝炎病毒的临床治疗有非常重要的意义。
发明内容
本发明提供了一种检测乙型肝炎病毒的多耐药基因突变位点方法，检测探针以及检测试剂盒。本发明所能够检测的乙型肝炎病毒的耐药基因突变位点列表如下表1乙型肝炎病毒的耐药基因突变位点列表
核苷类似物药物相关的耐药基因突变位点拉米夫定 (LAM)rtV173L、rtL 179P、rtL 180M、rtA200V、rtM204V、rtM204I、rtM204S、 rtV207M、rtV207K rtV207L、rtS213T阿德福韦酯(ADV)rtA181V、rtA181T、rtV214A、rtQ215S、rtN236T、rtP237H、rtN238T、 rtN238D、rtK241E替诺福韦 (TDF)rtA194T, rtA194M恩替卡韦 (ETV)rtV173L、rtL180M、rtT184A、rtT184G、rtT184I、rtT184S、rtS202G、 rtS202K rtM204V、rtM204K rtM204S. rtM250V替比夫定 (LDT)rtL 18OM、rtM204V、rtM204I、rtM204S恩曲他滨 (FTC)rtV173L、rtL180M、rtM204V, rtM204I、rtM204S本发明提供了一种乙型肝炎病毒耐药基因突变的检测探针，所述的耐药基因突变位点为 rtV173L、rtL179P、rtL180M、rtA181V/T、rtT184A/G/I/S、rtA194T/M、rtA200V、 rtS202G/I、rtM204V/I/S、rtV207M/I/L、rtS213T、rtV214A、rtQ215S、rtN236T、rtP237H、 rtN238T/D、rtK241E、rtM250V中的任意一种或几种，所述的检测探针为5，-TAGGTCTATTTAC AGGCAGTTTTCG-3’。本发明还提供了一种乙型肝炎病毒耐药基因突变的检测试剂盒，所述的耐药基因突变位点为 rtV173L、rtL179P、rtL180M、rtA181V/T、rtT184A/G/I/S、rtA194T/M、rtA200V、 rtS202G/I、rtM204V/I/S、rtV207M/I/L、rtS213T、rtV214A、rtQ215S、rtN236T、rtP237H、 rtN238T/D、rtK241E、rtM250V中的任意一种或几种，所述的试剂盒包含有用于扩增所述耐药基因突变位点的PCR试剂和上述的检测探针，所述的PCR试剂中包含有一对引物，其序列如下正向引物5，-TTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCAC-3，反向引物5，-TAGGTCTATTTACAGGCAGTTTTCG-3，。
再一方面，本发明还提供了使用上述的检测试剂盒来检测乙型肝炎病毒耐药基因突变的方法，该方法包括以下步骤(1)取空腹受检者血清进行DNA抽提；(2)使用权利要求2中所述的PCR试剂对步骤(1)所提取的DNA进行PCR扩增；(3)将步骤⑵获得的PCR扩增产物酶解；(4)将权利要求1所述的检测探针与步骤(3)所获得的酶解产物混合进行测序 PCR反应；(5)用测序仪对步骤⑷获得的测序PCR产物进行测序，找出所述各耐药基因突变位点所在位置的对应序列，并与所述各耐药基因突变位点的标准序列比较，判断是否发生突变。本发明的一个具体实施方案中，步骤(2)所述的PCR扩增的反应体系为PCR Buffer 2. 5 μ 1、2· 5mM 的 dNTP Mix 2· 5 μ 1、5 IOU 的 Taq 酶 0. 2 μ 1、0· lug/ulDNA 模板 1μ l、10uM 引物各 1μ l、ddH20 16. 8 μ 1 ；所述的引物为权利要求2中所述的正向引物和反向引物；在本发明的一个具体实施例中，1 μ 1 DNA模板大约含有IOOngDNA ；反应条件为94°C 4分钟变性和酶激活，94°C 15秒变性，50°C 15秒退火，72°C 2分钟延长，循环25次，最后4°C延长5分钟以上。本发明的另一个具体实施方案中，步骤⑷所述的测序PCR的反应条件为960C 1分钟变性和酶激活，96°C 10秒变性，50°C 5秒退火，60°C 4分钟延长，循环 25次，最后4°C延长5分钟以上。所述的测序试剂可以为本领域技术人员所熟知的测序PCR反应所需试剂，例如 BigDye Terminator循环测序试剂盒。在本发明的一个具体实施方式
中，骤(4)所述的测序PCR的反应体系为所述的步骤(3)获得的酶解产物3 μ l、BigDye Terminator循环测序试剂1 μ 1和7pm/ul检测探针 2μ 1。本发明能够非常方便地检测出乙型肝炎病毒耐药基因突变情况，运用1对PCR扩增引物，以及一个检测探针就能检测出目前所公开的18个乙型肝炎病毒耐药基因突变位点中的任意一个或数个。不仅特异性好，并且所有的突变位点检测均可在一次检测过程中完成，操作方便，避免了多次操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率。另外，本发明提供的检测方法不仅能够检测出乙型肝炎病毒耐药基因突变情况， 还能够在同一次操作中也检测出乙型肝炎病毒的基因分型情况，操作简单、高效率。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1乙型肝炎病毒耐药基因突变位点检测1、取空腹受检者血清进行DNA抽提采集空腹受检者静脉血1ml，注入无菌1. 5ml离心管中，于室温静置2小时，转入 4°C静置1小时，8000rpm/分离心5分钟，吸取200 μ 1上清转入另一无菌1. 5ml离心管中， 获得血清标本；(如测定在5日内进行，标本存放于4°C，如果测定时间延迟，标本必须存于-20°C。标本运送应保存4°C以下。)取50 μ 1浓缩液(主要成分聚乙二醇)到确定数量的0. 5ml离心管中，再加入上述获得的血清标本50 μ 1，振荡混勻后4°C静置5分钟，15000rpm离心10分钟，吸弃上清。 加入20 μ 1裂解缓冲液(主要成分NaCl)，剧烈振荡或用枪头搅碎至无沉淀后短暂离心，沸水浴10分钟，15000rpm离心5分钟，取上清液，即获得本实施例的检测用DNA样本。2、PCR扩增反应所采用的一对正反向引物如下正向引物5，-TTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCAC-3，反向引物5，-TAGGTCTATTTACAGGCAGTTTTCG-3，。PCR 扩增的反应体系为PCR Buffer 2. 5 μ 1、2. 5mM 的 dNTP Mix 2. 5μ1、5 IOU的Taq酶0. 2μ 1、DNA模板1μ l(100ng左右)、IOuM正向引物反向引物各1 μ 1、ddH20 16. 8μ 1 ；反应条件为94°C 4分钟变性和酶激活，94°C 15秒变性，50°C 15秒退火，72°C 2分钟延长，循环25次，最后4°C延长5分钟以上。3、PCR扩增产物的酶解上述的PCR扩增产物取1 μ 1(检测用DNA样本浓度彡5X 103IU/ml)，再向其中加入2μ1酶试剂(其中包含2U SAP酶、IU核酸外切酶)后混勻。37°C 60分钟，80°C 15分钟，最后4°C保存。4、酶解后产物的测序PCR反应该测序PCR反应所采用检测探针为5’ -TAGGTCTATTTACAGGCAGTTTTCG-3，。测序PCR的反应体系为步骤3获得的酶解产物(取阳性)3μ1、测序试剂 (BigDye Terminator循环测序试剂盒)1 μ 1和7pm/ul检测探针2 μ 1。反应条件为96°C 1分钟变性和酶激活，96°C 10秒变性，50°C 5秒退火，60°C 4分钟延长，循环25次，最后4°C延长5分钟以上。5、测序以及结果分析步骤4获得的测序PCR反应产物进行纯化后，在自动化的基因测序仪(ABI3730) 上进行测序。分析测序结果，找出表1中所述18个耐药基因突变位点所在位置的对应序列， 并与表1中所述18个耐药基因突变位点的标准序列比较，判断是否发生突变。具体来说，采用测序结果分析程序Chromas，按Find快捷键，找到第173位乙肝病毒耐药基因突变位点前的保守序列“CTATGGGA”后，按照顺序统计出第173位-第250位之间的18个耐药基因突变位点序列；将统计完成的18个耐药基因突变位点序列与对应的标准序列比较，找出发生突变的耐药位点。检测结果参下表2 ；表2实施例IDNA样本的乙肝病毒耐药基因突变位点检测结果
权利要求
1.一种乙型肝炎病毒耐药基因突变的检测探针，所述的耐药基因突变位点为 rtV173L、rtL179P、rtL180M、rtA181V/T、rtT184A/G/I/S、rtA194T/M、rtA200V、rtS202G/I、 rtM204V/I/S、rtV207M/I/L、rtS213T、rtV214A、rtQ215S、rtN236T、rtP237H、rtN238T/D、 rtK241E、rtM250V中的任意一种或几种，其特征在于，所述的检测探针为5，-TAGGTCTATTTA CAGGCAGTTTTCG-3’。
2.—种乙型肝炎病毒耐药基因突变的检测试剂盒，所述的耐药基因突变位点为 rtV173L、rtL179P、rtL180M、rtA181V/T、rtT184A/G/I/S、rtA194T/M、rtA200V、rtS202G/I、 rtM204V/I/S、rtV207M/I/L、rtS213T、rtV214A、rtQ215S、rtN236T、rtP237H、rtN238T/D、 rtK241E、rtM250V中的任意一种或几种，其特征在于，所述的试剂盒包含有用于扩增所述耐药基因突变位点的PCR试剂和权利要求1所述的检测探针，所述的PCR试剂中包含有一对引物，其序列如下正向引物5’ -TTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCAC-3，反向引物5’ -TAGGTCTATTTACAGGCAGTTTTCG-3，。
3.—种乙型肝炎病毒耐药基因突变的检测方法，其特征在于，该检测方法使用如权利要求2所述的检测试剂盒，其包括以下步骤(1)取空腹受检者血清进行DNA抽提；(2)使用权利要求2中所述的PCR试剂对步骤(1)所提取的DNA进行PCR扩增；(3)将步骤(2)获得的PCR扩增产物酶解；(4)将权利要求1所述的检测探针与步骤(3)所获得的酶解产物混合进行测序PCR反应；(5)用测序仪对步骤(4)获得的测序PCR产物进行测序，找出所述各耐药基因突变位点所在位置的对应序列，并与所述各耐药基因突变位点的标准序列比较，判断是否发生突变。
4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)所述的PCR扩增的反应体系为PCR Buffer 2. 5 μ 1、2· 5mM 的 dNTP Mix 2· 5 μ 1、5 IOU 的 Taq 酶 0· 2 μ 1、0· lug/ul DNA 模板 1 μ IUOuM 引物各 1 μ UddH2O 16. 8 μ 1 ；所述的引物为权利要求2中所述的正向引物和反向引物；反应条件为94°C 4分钟变性和酶激活，94°C 15秒变性，50°C 15秒退火，72°C 2分钟延长，循环25次，最后4°C延长5分钟以上。
5.如权利要求3或4所述的检测方法，其特征在于，步骤(4)所述的测序PCR的反应条件为960C 1分钟变性和酶激活，96°C 10秒变性，500C 5秒退火，60°C 4分钟延长，循环25次， 最后4°C延长5分钟以上。
全文摘要
本发明提供了一种检测乙型肝炎病毒的多耐药基因突变位点方法，检测探针以及检测试剂盒。本发明能够非常方便地检测出乙型肝炎病毒耐药基因突变情况，运用1对PCR扩增引物，以及一个检测探针就能检测出目前所公开的18个乙型肝炎病毒耐药基因突变位点中的任意一个或数个。不仅特异性好，并且所有的突变位点检测均可在一次检测过程中完成，操作方便，避免了多次操作过程中存在的诸多不确定因素，可大大提高检测准确率。另外，本发明提供的检测方法不仅能够检测出乙型肝炎病毒耐药基因突变情况，还能够在同一次操作中也检测出乙型肝炎病毒的基因分型情况，操作简单、高效率。
文档编号C12Q1/70GK102286645SQ20111025427
公开日2011年12月21日 申请日期2011年8月30日 优先权日2011年8月30日
发明者潘加奎 申请人:解码(上海)生物医药科技有限公司