专利名称：水稻绿色原生质体的制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种原生质体的制备方法，特别涉及一种水稻绿色原生质体的制备方法。本发明还涉及制得的水稻绿色原生质体在光/叶绿体相关基因瞬时表达研究中的应用。
背景技术：
水稻是重要的粮食作物与模式生物之一，随着基因组序列的破译，对其基因功能进行鉴定具有重要意义。植物瞬时表达基因方法由于其快速、高效，被广泛应用于基因功能鉴定和高通量分析基因功能上。利用原生质体瞬时基因表达系统，可以快速鉴定水稻基因的功能，可以为细胞学、生理学和遗传学建立试验体系，因而高效快捷地进行水稻原生质体制备是开展上述工作的基础和关键。目前，如 Davey MR, Anthony P: Plant Cell Culture: Essential Methods. 2001、Hayashimoto A, Li Z, Murai N: A polyethylene glycol—mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants. Plant Physiol 1990，93 (3) :857-863 及 Bart R, Chern M, Park C-J, Bartley L, Ronald P: A novel system for gene silencing using siRNAs in rice leaf and stem-derived protoplasts. Plant Methods 2006, 2 (1) : 13等文章所述，水稻原生质体主要来源于水稻胚性细胞、悬浮细胞系和黄化苗。然而胚性细胞、悬浮细胞系和黄化苗的细胞均处于非正常状态，没有形成正常的叶绿体，不是一个正常生理状态的细胞体系，因而不适用于很多研究，尤其是与叶绿体和光合作用相关的研究。基于此，研究者们分别探索用水稻绿苗去制备绿色原生质体，Bart Rj Chern Mj Park C-Jj Bartley Lj Ronald P: A novel system for gene silencing using siRNAs in rice leaf and stem-derived protoplasts. Plant Methods 2006， 2(1) : 13禾口Chen S，Tao L，Zeng L，Vega-Sanchez ME, Umemura K，Wang GL: A highly efficient transient protoplast system for analyzing defence gene expression and protein-protein interactions in rice. Mol Plant Pathol 2006，7 (5) : 417-427 两篇文章分别使用2周龄和2月龄的水稻植株，并且在方法中使用抽真空、加入抗生素、使用有强烈毒性的巯基乙醇等步骤分离绿色原生质体，然而所分离到的绿色原生质体的转化效率很低，不如来自黄化苗的原生质体效率高。并且，仅仅做了植物抗性基因表达分析和siRNA 介导的基因沉默研究方面的应用。通过现有技术制备得到的水稻绿色原生质体，转染率普遍不高，难以满足基因瞬时表达的需要。如Bart R, Chern M, Park C-J, Bartley L, Ronald P: A novel system for gene silencing using siRNAs in rice leaf and stem-derived protoplasts. Plant Methods 2006, 2 (1) : 13 禾口 Chen S, Tao L, Zeng L, Vega-Sanchez ME, Umemura K, Wang GL: A highly efficient transient protoplast system for analyzing defence gene expression and protein-protein interactions in rice. Mol Plant Patkol2006, 7(5) :417-427所指出的，分离得到的水稻绿色原生质体的转化效率低于黄化苗原生质体，而已有报导的水稻黄化苗原生质的转化效率最高也只能达到70%。同时，现有方法制备得到的水稻绿色原生质体，对小质粒的转化效率高，而对大于12 kb的质粒，转化效率很低，只能达到25% 30%，这也限制了大片段基因的研究。为更好地进行与水稻光合作用相关功能基因表达的研究，需要提供一种高效率、 简便、快速和低成本的水稻绿色原生质体基因表达系统。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型的水稻绿色原生质体的制备方法。本发明的另一个目的在于提供按本发明方法制备得到的原生质体在光/叶绿体相关基因瞬时表达研究中的应用。本发明所采取的技术方案是
水稻绿色原生质体的制备方法，包括以下步骤
1)将水稻种子的颖壳剥去，清洁消毒；
2)将种子播种在灭菌培养基上，无菌培养，在培养期间给予光照，以获得绿色的水稻幼苗；
3)取水稻幼苗的茎组织，切成小段投入渗透压调节液，置于暗处调节渗透压；
4)将处理得到的茎组织洗净，加入酶解液，暗处振荡酶解，使茎组织中的细胞游离；
5)加入W5溶液，振荡洗脱，过滤收集游离细胞，即得原生质体。优选的，培养基为1/2 MS培养基。种子培养的条件为26 °C，光照12 h，黑暗处理12 h，光照的强度为8000 Lux。种子培养的时间为7 10天。优选的，渗透压调节液为0. 6 M的无菌甘露醇溶液，处理时间为9 11 min。优选的，每10 ml的酶解液中含有MOO U纤维素酶RS、225 U离析酶R-10，其中， 甘露醇的浓度为0.5 M,MES的浓度为10 mM，pH为5. 7，55 °C温育10 min使其中的DNA酶和蛋白酶失活，冷却后加入10 mM CaCl2和0. 1% BSA，过滤灭菌。优选的，酶解液的酶解时间为4 5 h。本发明的有益效果是
使用本发明方法简单、高效，可以低成本地获得大量水稻绿色原生质体。制备得到的水稻绿色原生质体细胞生长状态良好、活力高，是含有叶绿体的、有光合活性的绿色原生质体，是更正常的、更接近生理水平的细胞体系。制备得到的水稻绿色原生质体细胞，易于转染适合于叶绿体、光合作用相关的研究目的。使用1/2 MS培养基，保证水稻种子可以很好地萌发，得到的茎组织具有很好的活性。本发明通过精心选择培养时间，调整培养参数，使获得的水稻绿色原生质体具有很好的细胞活力与光合活性，保证其可用于光/叶绿体相关基因的瞬时表达研究。使用0. 6 M的无菌甘露醇溶液处理水稻的茎组织9 11 min,有效的保证了细胞的活性，同时，使得茎组织分散均勻，不易聚集。通过精心调配酶解液，可以更好地将细胞壁去除，使细胞游离出来；同时，省去了抽真空步骤，不损伤细胞的活性，保证了原生质体的高活性和高产量。同时，避免使用抗生素以及剧毒的巯基乙醇，大大提高操作的安全和方便性。
图1是本发明方法制得的原生质体的二乙酸荧光素染色图； 图2是pUC-GFP转染本发明原生质体的实验结果图； 图3是CD3-998转染本发明原生质体的实验结果图4是使用质粒pUC-bZip63-SPYNE和pUC_SPYNE瞬时转化水稻绿色原生质体的免疫印迹图5是水稻绿色原生质体中蛋白的亚细胞定位图； 图6是水稻绿色原生质体中蛋白的相互作用图； 图7是叶绿素荧光仪检测最大光系统II量子产量图； 图8是光照培养的水稻绿色原生质体的基因瞬时表达图。
具体实施例方式
下面结合实施例，进一步说明本发明。实施例中使用的溶液组成如下
酶解液每10 ml的酶解液中含有MOO U纤维素酶RS、225 U离析酶R-10，其中，甘露醇的浓度为0.5 M,MES的浓度为10 mM，pH为5. 7，55 °C温育10 min使其中的DNA酶和蛋白酶失活，冷却后加入10 mM CaCl2和0. 1% BSA，过滤灭菌。W5 溶液154 mM NaCl，125 mM CaCl2, 5 mM MES (ρΗ5· 7)。PEG 溶液40% (ff/V) PEG4000 (Fluka)，0.3 M 甘露醇，0.1 M CaCl20MMG 溶液0. 5 M 甘露醇，15 mM MgCl2,4 mM MES (ρΗ5· 7)，过滤灭菌。WI 溶液0. 5 M 甘露醇，20 mM KCl, 4 mM MES (ρΗ5· 7)，过滤灭菌。1/2 MS 培养基=NH4NO3(825 mg/L)，MgS04.7H20(185 mg/L)，KH2PO4(85 mg/L)， KNO3 (950 mg/L) ,CaCl2·2Η20 (440 mg/L)，KI (0· 83 mg/L)，H3BO3 (6· 2 mg/L) ,MnS04*4H20(22. 3 mg/L) , ZnS04*7H20(8. 6 mg/L), Na2MoO4·2H20 (0. 25 mg/L), CuSO4*5H20 (0. 025 mg/L)， CoC12*6H20(0. 025 mg/L), Na2EDTA*2H20(37. 3 mg/L), FeSO4*7H20(27. 8 mg/L)，肌醇(100 mg/L)，烟酸(0.5 mg/L)，盐酸吡哆辛(0.5 mg/L)，盐酸硫胺素(0. 1 mg/L)，甘氨酸(2 mg/ L)，蔗糖(15 %)，用KOH调pH至6.0，加入琼脂粉(10 g/L)，高压灭菌，即可制成固体1/2 MS 培养基。水稻绿色原生质体的分离
1)将水稻种子剥去颖壳，加入75%乙醇消毒1 min，无菌水清洗3遍；2. 5%次氯酸钠消毒20 min，在超净台内使用无菌水清洗5遍；
2)将消毒后的种子均勻的播种在1/2MS培养基上，培养期间，光照12 h，之后黑暗处理12 h，如此交替处理培养7 10天，光照的光强度约为8000 Lux，培养温度为沈°C ；
3)取水稻幼苗切取幼嫩的茎组织用于原生质体制备，用锋利的刀片将一束长约5cm 的幼茎切成0.5 mm长的小段，放入0.6 M无菌甘露醇中黑暗下处理9 11 min调节渗透压；4)收集处理后的茎组织，投入酶解液中，置于黑暗处轻摇(60 80 rpm)酶解4 5 h，使细胞游离；
5)酶解后，加入等体积的W5溶液，用手剧烈摇动10s，然后通过40 ym尼龙过滤网收集在圆底离心管中；
6)用W5溶液反复洗脱3 5次，洗脱液收集到的原生质体溶液置于水平离心机中离心1500 rpm, 3 min，移除上清，得到水稻绿色原生质体。制得的水稻绿色原生质体可根据基因研究表达的需要选择在暗处或光照条件下培养，一般表达与光合作用相关的基因时需要在光照条件下培养。分离8天龄的水稻绿色原生质体
1)水稻“日本晴”在萌发于1/2 MS培养基上，12 h光照(约8000 Lux) /12 h黑暗， 26 °C，培养至8天龄；
2)选取幼嫩的茎组织用于原生质体制备，用锋利的刀片将一束幼茎(约30棵，约5 cm长茎段)切成0.5 mm长的小段，放入0.6 M甘露醇中黑暗下处理10 min以调节渗透压；
3)在黑暗下轻微摇动，酶解4 5h，通过40 μ m尼龙过滤网收集绿色原生质体，并用W5溶液洗脱酶解残渣3 5次以获得尽可能多的原生质体；
4)加入MMG溶液重悬原生质体，并调至浓度为2 X IO6个细胞/mL，使用0.01% 二乙酸荧光素染色，荧光观察检测活细胞，活细胞呈现出绿色荧光。检测结果如图1所示。检测结果显示，其中的活细胞占细胞总数的95%以上。可见，通过本发明方法制备得到的水稻绿色原生质体，具有极佳的活性。计数显示，上述实施例中制备得到的原生质体细胞高达1 X IO7个，细胞大小在 7 25 μπι之间。按每个转染使用2 X IO5个细胞计，足够50次转染使用。水稻原生质体瞬时转化
1)在2 mL离心管中加入5 10 μ g质粒DNA ；
2)加入100 μ L原生质体轻轻混合；
3)加入110 μ L PEG溶液，充分混合，放置于25 ！黑暗处理15 min ；
4)用440 μ L W5溶液稀释上述液体，充分摇勻液体终止转化反应，水平离心1500 rpm, 3 min,去除上清；
5)加入1mL WI溶液重悬原生质体，转移到6孔板中，根据不同应用目的，在黑暗或者光照条件下培养6 16 h ；
6)收取原生质体到2 mL离心管中，水平离心1500 rpm，4 min，留有上清约100 μ L， 轻弹悬起原生质体；
7)根据不同应用目的，使用所获得的瞬时表达了基因的原生质体。高效的水稻绿色原生质体瞬时基因表达系统
利用PEG介导的瞬时转化原生质体方法，分别转化pUC-GFP (4. 5 1Λ)和⑶3-998 (13 1Λ，融合了一段入质体信号肽的融合蛋白)，统计转化效率。pUC-GFP的转化效率为53 75%,大质粒⑶3-998 (13 kb)的转化效率为45 66%。其转化结果分别如图2和3所示。实验发现，本发明的水稻绿色原生质体，对大质粒同样具有非常高的转染效率。免疫印迹检测水稻绿色原生质体瞬时基因表达产物
使用来自 Walter Μ, Chaban C, Schutze K, Batistic 0, Weckermann K, NakeC, Blazevic D, Grefen C, Schumacher K, Oecking C et al Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation. Plant J 2004， 40(3):428-438 的质粒 pUC_bZip63_ SPYNE 和 pUC-SPYNE，瞬时转化水稻绿色原生质体，免疫印迹(Western blot)检测其所表达的蛋白， 分别检测到瞬时表达的约55 kDa的bZIP63-c-myc-YFPN和约20 kDa的c-myc_YFPN蛋白。 其结果如图4所示。在水稻绿色原生质体中检测蛋白的亚细胞定位
两个已知的叶绿体蛋白 OsTRX m5、BASl [Chi YH, Moon JC, Park JH, Kim HS, Zulfugarov IS, Fanata WI, Jang HH, Lee JR, Lee YM, Kim ST et al: Abnormal chloroplast development and growth inhibition in rice thioredoxin m knock-down plants. Plant Physiol 2008，148 U) : 808—817 禾口 Baier Μ, Dietz K-J: The plant 2-Cys peroxiredoxin BASl is a nuclear-encoded chloroplast protein: its expressional regulation, phylogenetic origin, and implications for its specific physiological function in plants. Plant J 1997, 12 (1) : 179-190]与一个预测的叶绿体蛋白 OsTRX m2(预测网站WoLFPSORT, http://wolfpsort.org/; TargetP 1.1 server, http://www. cbs. dtu. dk/services/TargetP/)融合GFP后，通用荧光观察检测其在水稻绿色原生质体细胞中的亚细胞定位。这三个融合蛋白所发出的荧光与叶绿体自发荧光重叠或者位于叶绿体之中(图5)，均能正确定位到其的目的细胞器。并且它们各自的定位状态不一样，OsTRX m5充满于整个叶绿体中，OsTRX m2在叶绿体中呈现多个荧光点，BASl在每个叶绿体中只有一个大的荧光点。这种不同的形态提示它们在叶绿体中具有各自特异的亚细胞定位。在水稻绿色原生质体中检测蛋白的相互作用
在细胞复杂的调控网络中，蛋白通常通过相互作用参与特定的信号通路。因此，在活细胞中鉴定蛋白的相互作用具有非常重要的意义。转录因子bZIP63在细胞核中形成二聚体发挥功能(Walter Μ, Chaban C, Schutze K, Batistic 0，Weckermann K, Nake C, Blazevic D, Grefen C, Schumacher K, Oecking C et al·. Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation. Plant J 2004，40 (3) : 428-438)。将 bZIP63 分别融合到 YFP 的 N 端 (YN)和C端(YC)，应用水稻绿色原生质体瞬时表达bZIP63-YN和bZIP63_YC，通过bZIP63 发生相互作用，重构了 YFP蛋白以产生黄色荧光，因此，在细胞核中检测到YFP荧光。作为负对照，bZIP63-YN和空质粒YC，空质粒YN和bZIP63_YC，两个空质粒YN和YC不能重建YFP 荧光。实验结果如图6所示。具有光合活性的水稻绿色原生质体
绿色原生质体，相对于目前常用的黄化原生质，具有正常的叶绿体，因而可以用于叶绿体/光合作用相关的研究目的，而黄化原生质有着这方面的应用缺陷。通过Imaging-PAM 叶绿素荧光仪检测最大光系统II量子产量(Fv/Fm)表明，黄化原生质体完全不具有光合能力，而绿色原生质体是具有光合活性的细胞。实验结果如图7所示。水稻绿色原生质体应用于叶绿体/光合作用相关研究
在光下培养的绿色原生质体，当用叶绿体逆行信号诱导剂norf lurazon (NF, 500 nM)处理，可以检测到光合作用相关基因OsLhcbl、OsLhcp、GADPH琳RbcS^mmk,与水稻植株响应NF的表现一致。转录因子OsGLKl在光下可以上调表达光合相关基因，并且也对叶绿体逆行信号敏感(Nakamura H, Muramatsu M, Hakata M, Ueno 0, Nagamura Y, Hirochika H, Takano M, Ichikawa H: Ectopic Overexpression of The Transcription Factor OsGLKl Induces Chloroplast Development in Non-Green Rice Cells. Plant and Cell Physiology 2009, 50 (11) : 1933-1949)。在水稻绿色原生质体中表达OsGLKl_GFP，光合作用相关基因OsLhcM、OsUwp、GADPim RbcS上调表达30 168倍，而当NF处理后，该上调被减弱30 75%。类似的，瞬时表达空GFP，OsLhcb 1、OsLhcp、和TfecS在NF处理后也会下调表达。作为对照，Western blot检测到瞬时表达的约70 kDa的0sGLKl_GFP和 27 kDa的GFP，并且在NF处理前后其各自的表达量基本一致，实验结果如图8所示。
权利要求
1.水稻绿色原生质体的制备方法，包括以下步骤1)将水稻种子的颖壳剥去，清洁消毒；2)将种子播种在灭菌培养基上，无菌培养，在培养期间给予光照，以获得绿色的水稻幼苗；3)取水稻幼苗的茎组织，切成小段投入渗透压调节液，置于暗处调节渗透压；4)将处理得到的茎组织洗净，加入酶解液，暗处振荡酶解，使茎组织中的细胞游离；5)加入W5溶液，振荡洗脱，过滤收集游离细胞，即得原生质体。
2.根据权利要求1所述的水稻绿色原生质体的制备方法，其特征在于种子培养的条件为26 °C，光照12 h，黑暗处理12 h，光照的强度为8000 Lux0
3.根据权利要求1或2所述的水稻绿色原生质体的制备方法，其特征在于种子培养的时间为7 10天。
4.根据权利要求1或2所述的水稻绿色原生质体的制备方法，其特征在于培养基为 1/2 MS培养基。
5.根据权利要求1所述的水稻绿色原生质体的制备方法，其特征在于渗透压调节液为0. 6 M的无菌甘露醇溶液，处理时间为9 11 min。
6.根据权利要求1所述的水稻绿色原生质体的制备方法，其特征在于每10ml的酶解液中含有2400 U纤维素酶RS、225 U离析酶R-10，其中，甘露醇的浓度为0. 5 M，MES的浓度为10 mM, pH为5. 7,55 °C温育10 min使其中的DNA酶和蛋白酶失活，冷却后加入10 mM CaCl2 和 0. 1% BSA，过滤灭菌。
7.根据权利要求1所述的水稻绿色原生质体的制备方法，其特征在于酶解液的酶解时间为4 5 h。
8.以上任意一项权利要求所述方法制得的水稻绿色原生质体在光/叶绿体相关基因瞬时表达研究中的应用。
全文摘要
本发明通过调整水稻幼苗的生长条件，缩短了水稻的培养时间，同时采用酶法制备得到水稻绿色原生质体，并优化了制备方法，避免了抽真空和使用剧毒试剂，使水稻绿色原生质体的制备方法更为简单和安全。本发明方法制得的原生质体细胞存活率高，转化效率高，适用于目的基因编码蛋白的亚细胞定位、蛋白相互作用和蛋白免疫印迹等多种分析，特别适用于光/叶绿体相关基因的瞬时表达研究。
文档编号C12N15/82GK102311937SQ20111026931
公开日2012年1月11日 申请日期2011年9月13日 优先权日2011年9月13日
发明者张洋, 王宏斌, 王金发, 苏建斌 申请人:中山大学