细胞培养改良的制作方法

专利名称：细胞培养改良的制作方法
细胞培养改良本申请是国际申请日为2007年9月13日的国际申请PCT/US2007/020027进入中国、申请号为200780041909. X的题为“细胞培养改良”的发明专利申请的分案申请。相关申请本申请要求2006年9月13日申请的美国临时申请60/845158、2006年12月21 日申请的美国临时申请60/876374的优先权。上述各优先权文件的内容以参考形式并于本文。技术领域和
背景技术：
重组DNA技术已提供了使得能够用于包括治疗、诊断、农业及研究目的各种应用的量的蛋白质生产方法。重组蛋白生产的目标之一是优化细胞培养基和条件以获得最大量的蛋白及最有效的生产方式。任何改良(包括增量改良)均可具有庞大的经济效益。在医药工业中，优化用于疾病治疗的生物制品的蛋白质生产是有利的，因为在大规模生产生物制品时任何改良均可具有显著影响。因此，仍需要最大化来自表达医药用生物蛋白的细胞培养的蛋白质生产。通常，哺乳动物细胞培养基基于市售培养基配方，包括，例如，DMEM或Ham氏F12。 通常，培养基配方并未充分富集(enriched)以支持细胞生长及生物蛋白表达的增加。仍需要改良细胞培养基、添加剂及用于改良蛋白生产的细胞培养方法。

发明内容
本发明提供用于改良细胞培养尤其哺乳动物细胞培养中的蛋白表达的方法及组合物。本发明涉及改良细胞培养基，包括用于蛋白表达和细胞生长的培养基和经优化用于蛋白表达的细胞培养生产培养基。本发明也包括用于在哺乳动物细胞培养中高蛋白表达的最佳化方法和培养基。具体而言，最优化细胞培养基用于在哺乳动物细胞培养物(例如CHO细胞)中表达抗体。也提供通过添加补充溶液(例如含有水解产物的溶液及浓缩基础培养基溶液)促进蛋白生产的改良补料分批方法及组合物。本发明提供用于哺乳动物细胞培养中的不含盐的改良基础生长培养基。本发明包括包含A部分、B部分及C部分的无血清细胞培养基，其中A部分基本上由排除下列组份的经修饰基础培养基组成碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂及单糖葡萄糖；B部分基本上由无机铁来源组成；且C部分包含重组生长因子、缓冲剂、渗透压调节剂、能量来源及至少两种不同的非动物水解产物。在一个实施方案中，A部分进一步包含非铁金属离子、维生素或二者组合。在一个实施方案中，B部分的无机铁来源为柠檬酸铁，例如约100-150mg/L或0. I-ImM终溶液浓度的柠檬酸铁。在另一个实施方案中，B部分的无机铁来源为柠檬酸铁，例如约122.5mg/L或 0. 5mM终溶液浓度的柠檬酸铁。在一个实施方案中，C部分的重组生长因子选自胰岛素或重组类似物、IGF-I及胰岛素与IGF-I的组合，例如约％ig/L至13mg/L胰岛素或其重组类似物。在一个实施方案中，排除于经修饰的基础培养基之外的缓冲剂为HEPES缓冲剂。在一个实施方案中，C部分的缓冲剂包含磷酸盐缓冲剂、HEPES及碳酸氢钠，例如约0. 1至3g/L碳酸氢钠、约0. 1至3g/L HEPES。在一个实施方案中，C部分的缓冲剂包含 1. 6g/L碳酸氢钠和/或约1. 8g/L HEPES0在一个实施方案中，磷酸盐缓冲剂包含约0. 01 至0. 5g/L磷酸二氢钠和磷酸氢二钠。在另一个实施方案中，C部分进一步包含天冬酰胺、谷氨酰胺或谷氨酰胺和天冬酰胺。在一个实施方案中，C部分的渗透压调节剂为NaCl，例如约1. 0至6. 5g/L NaCl。在一个实施方案中，C部分的能量来源为单糖，例如葡萄糖(如D-葡萄糖)、麦芽糖、甘露糖、半乳糖和果糖。在一个实施方案中，本发明的细胞培养基包含至多约7. Og/L的葡萄糖。在另一个实施方案中，本发明的细胞培养基包含C部分的至少两种不同的非动物源水解产物，该类水解产物为植物源水解产物和既非动物源也非植物源的水解产物。可用于本发明的植物源水解产物的实例为大豆源水解产物。既非动物源也非植物源的水解产物的实例为酵母源水解产物。在一个实施方案中，本发明的细胞培养基进一步包含甲氨喋呤。在一个实施方案中，细胞培养基进一步包含约IOOnM至5000nM的甲氨喋呤。在另一个实施方案中，细胞培养基进一步包含细胞保护剂或表面活性剂。可用于本发明细胞培养基的表面活性剂的实例为甲基纤维素或Pluronic多元醇，例如Pluronic F-68。在一个实施方案中，细胞培养基包含约0. l-5g/L Pluronic F-68。在一个实施方案中，细胞培养基包含约1.0g/L Pluronic F-68。在本发明的另一个实施方案中，细胞培养基进一步包含L-谷氨酰胺。在一个实施方案中，细胞培养基的pH值范围为7. 1至7. 3。在另一个实施方案中，本发明的细胞培养基的渗透压在约320至450m0sm/kg范围内。本发明包括无血清细胞培养基，该培养基包含下列各物质基础培养基；约 8-ianl/kg或116-U6mg/L柠檬酸铁；约2_6mg/kg重组人胰岛素；约2_5g/kg无水葡萄糖；约 0. 1-0. 5g/kg L-谷氨酰胺；约 l_3g/kg 碳酸氢钠；约 0. 01-0. 05g/kg NaH2PO4 · H2O ； 约0. 4-0. 5g/kgNa2HP04 · 7H20 ；及约1. 0-3. Og/kg酵母源水解产物。在一个实施方案中，细胞培养基包含基础培养基；约10. 0ml/kg或122mg/L柠檬酸铁；约4. Omg/kg重组人胰岛素；约3. 5g/kg无水葡萄糖；约0. 29g/kgL-谷氨酰胺；约1. 6g/kg碳酸氢钠；约0. 03g/kg NaH2PO4 · H2O ；约 0. 43-0. 44g/kg Na2HPO4 · 7H20 ；及约 2. 0g/kg 酵母源水解产物。在一个实施方案中，细胞培养基基本上由下列物质组成基础培养基；约10. 0ml/kg或12aiig/L柠檬酸铁；约4. 0mg/kg重组人胰岛素；约3. 5g/kg无水葡萄糖；约0. 29g/kg L-谷氨酰胺；约 1. 6g/kg 碳酸氢钠；约 0. 03g/kg NaH2PO4 .H2O ；约 0. 43-0. 44g/kg Na2HPO4 ·7Η20 ；及约 2. Og/ kg酵母源水解产物。本发明进一步提供基本由下列各物质组成的无血清细胞培养基基础培养基；约 8-ianl/kg或116-126mg/L柠檬酸铁；约2_6mg/kg重组人胰岛素；约2_5g/kg无水葡萄糖；约 0. 1-0. 5g/kg L-谷氨酰胺；约 l_3g/kg 碳酸氢钠；约 0. 01-0. 05g/kg NaH2PO4 · H2O ；约 0. 4-0. 5g/kgNa2HP04 · 7H20 ；及约1. 0-3. Og/kg酵母源水解产物。在一个实施方案中，细胞培养物基本上由下列各物质组成基础培养基；约8-iaiil/kg或116-126mg/L柠檬酸铁；约 2-6mg/kg重组人胰岛素；约2-5g/kg无水葡萄糖；约0. 1-0. 5g/kg L-谷氨酰胺；约l_3g/kg 碳酸氢钠；约 0. 01-0. 05g/kg NaH2PO4 .H2O ；约 0. 4-0. 5g/kg Na2HPO4 ·7Η20 ；及约 1. 0-3. Og/ kg酵母源水解产物。在一个实施方案中，细胞培养基进一步包含约2. 50mL/kg的甲氨喋呤。本发明也包括一种用于生产蛋白的方法，其包含在本发明的培养基中培养包含编码蛋白的核酸的哺乳动物细胞；并且将培养物转移至细胞培养生产培养基中，这样可生产蛋白。在一个实施方案中，该蛋白为抗体，包括(例如)D2E7(阿达木单抗)。本发明进一步提供包含下列各物质的无血清细胞生产培养基排除下列组份的经修饰的基础培养基；碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂及单糖葡萄糖；约8至ianl/kg或122. 45mg/L柠檬酸铁；约4至8mL/kg或10至Hmg/ kg重组人胰岛素；约5至9g/kg无水葡萄糖；约0. 5至0. 7g/kg L-谷氨酰胺；约1至2g/ kg 碳酸氢钠；约 1 至 2g/kg HEPES ；约 2 至 3g/kg NaCl ；约 0. 5 至 2g/kg Pluronic F-68 ； 约 0. 01 至 0. lg/kg NaH2PO4 · H2O ；约 0. 4 至 0. 5g/kg Na2HPO4 · 7H20 ；约 8 至 12g/kg 酵母源水解产物；及约60至70g/kg植物源水解产物。在一个实施方案中，细胞培养生产培养基基本由排除下列组份的经修饰基础培养基组成碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、 渗透压调节剂、表面活性剂和单糖葡萄糖；约8至12ml/kg或122. 45mg/L柠檬酸铁；约4至 8mL/kg或10至Hmg/kg重组人胰岛素；约5至9g/kg无水葡萄糖；约0. 5至0. 7g/kg L-谷氨酰胺；约1至2g/kg碳酸氢钠；约1至2g/kg HEPES ；约2至3g/kg NaCl ；约0. 5至2g/ kg Pluronic F-68 ；约 0. 01 至 0. lg/kgNaH2P04 · H2O ；约 0. 4 至 0. 5g/kg Na2HPO4 · 7H20 ；约 8至12g/kg酵母源水解产物；及约60至70g/kg植物源水解产物。在另一个实施方案中， 细胞培养生产培养基包含基础培养基；约10. 0ml/kg或122. 45mg/L柠檬酸铁；约6. OmL/ kg或iang/kg重组人胰岛素；约7. Og/kg无水葡萄糖；约0. 58至0. 59g/kg L-谷氨酰胺； 约 1. 6g/kg 碳酸氢钠；约 1. 8g/kg HEPES ；约 2. 4 至 2. 5g/kg NaCl ；约 1. Og/kg Pluronic F-68 ；约 0. 03 至 0. 04g/kg NaH2PO4 · H2O ；约 0. 43 至 0. 44g/kg Na2HPO4 · 7H20 ；约 10. 7g/kg 酵母源水解产物；及约6. 9至7. Og/kg植物源水解产物。本发明进一步提供包含下列各物质的无血清细胞生产培养基排除下列组份的经修饰的基础培养基；碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂及单糖葡萄糖；约8至ianl/kg或122. 45mg/L柠檬酸铁；约3至5mL/kg或6至8mg/kg 重组人胰岛素；约5至9g/kg无水葡萄糖；约0. 1至2g/kg L-谷氨酰胺；约1至2g/kg碳酸氢钠；约 1 至 2g/kg HEPES ；约 2 至 3g/kg NaCl ；约 0. 1 至 2g/kg Pluronic F-68 ；约 0. 01 至 0. lg/kg NaH2PO4 .H2O ；约 0. 4 至 0. 5g/kg Na2HPO4 ·7Η20 ；约 0. 4 至 0. 5g/kg L-天冬酰胺一水合物；约2至6g/kg酵母源水解产物；及约2至4g/kg植物源水解产物。在一个实施方案中，细胞培养基基本由下列各物质组成排除下列组份的经修饰基础培养基碳酸氢钠、 缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂及单糖葡萄糖；约8至iaiil/ kg或122. 45mg/L柠檬酸铁；约3至5mL/kg或6至8mg/kg重组人胰岛素；约5至9g/kg无水葡萄糖；约0. 1至2g/kg L-谷氨酰胺；约1至2g/kg碳酸氢钠；约1至2g/kg HEPES ；约 2 至 3g/kg NaCl ；约 0. 1 至 2g/kgPluronic F-68 ；约 0. 01 至 0. lg/kg NaH2PO4 .H2O ；约 0. 4 至0. 5g/kgNa2HP04 · 7H20 ；约0. 4至0. 5g/kg L-天冬酰胺一水合物；约2至6g/kg酵母源水解产物；及约2至4g/kg植物源水解产物。在一个实施方案中，细胞培养基包含经修饰的基础培养基；约10. 0ml/kg或122. 45mg/kg柠檬酸铁；约3. 8至3. 9mL/kg或7. 8mg/kg重组人类胰岛素；约7. Og/kg无水葡萄糖；约0. 8至0. 9g/kg L-谷氨酰胺；约1. 6g/kg碳酸氢钠；约 1. 8g/kg HEPES ；约 2. 6 至 2. 7g/kg NaCl ；约 1. Og/kg PluronicF-68 ；约 0. 03 至 0. 04g/kg NaH2P04 · H20 ；约 0. 43 至 0. 44g/kgNa2HP04 · 7H20 ；约 0. 45g/kg L-天冬酰胺一水合物；约4. Og/kg酵母源水解产物；及约2. 6g/kg植物源水解产物。本发明也包括包含下列各物质的无血清细胞培养基排除下列组份的经修饰基础培养基碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂及单糖葡萄糖；约8至10ml/kg或120至130mg/L柠檬酸铁；约3至5mL/kg或7. 8mg/kg重组人胰岛素；约5至9g/kg无水葡萄糖；约0. 8至0. 9g/kg L-谷氨酰胺；约0. 3至0. 5g/kg L-天冬酰胺一水合物；约1至2g/kg碳酸氢钠；约1至2g/kgHEPES ；约2至3g/kg NaCl ；约0. 5至 2g/kg Pluronic F-68 ；约 0. 01 至 0. lg/kg NaH2PO4 .H2O ；约 0. 1 至 1. Og/kg Na2HPO4 ·7Η20 ； 约2至6g/kg酵母源水解产物；及约2至4g/kg植物源水解产物。在一个实施方案中，细胞培养基基本由下列各物质组成排除下列组份的经修饰基础培养基碳酸氢钠、缓冲剂、 磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂及单糖葡萄糖；约8至10ml/kg或120 至130mg/L柠檬酸铁；约3至5mL/kg或7. 8mg/kg重组人胰岛素；约5至9g/kg无水葡萄糖；约0. 8至0. 9g/kg L-谷氨酰胺；约0. 3至0. 5g/kg L-天冬酰胺一水合物；约1至2g/ kg 碳酸氢钠；约 1 至 2g/kg HEPES ；约 2 至 3g/kg NaCl ；约 0. 5 至 2g/kg Pluronic F-68 ； 约 0. 01 至 0. lg/kgNaH2P04 · H2O ；约 0. 1 至 1. Og/kg Na2HPO4 · 7H20 ；约 2 至 6g/kg 酵母源水解产物；及约2至4g/kg植物源水解产物。在另一个实施方案中，细胞培养基包含经修饰的基础培养基；约10ml/kg或122mg/L柠檬酸铁；约3. 8至3. 9mL/kg或7. 8mg/kg重组人胰岛素；约7. Og/kg无水葡萄糖；约0. 87至0. 88g/kg L-谷氨酰胺；约0. 45g/kg L-天冬酰胺一水合物；约 1. 6g/kg 碳酸氢钠；约 1. 8g/kg HEPES ；约 2. 67 至 2. 68g/kg NaCl ；约 1. Og/ kg Pluronic F-68 ；约 0. 03 至 0. 04g/kgNaH2P04 · H2O ；约 0. 43 至 0. 44g/kg Na2HPO4 · 7H20 ； 约4. Og/kg酵母源水解产物；及约2. 6g/kg植物源水解产物。本发明包括包含下列各物质的无血清细胞培养基基础细胞生长培养基；约8至 ianl/kg或120至130mg/L柠檬酸铁；约2至6mg/kg重组人胰岛素；约150至250g/kg无水葡萄糖；约0. 1至0. 5g/kg L-谷氨酰胺；约1至2g/kg碳酸氢钠；及约5至15g/kg酵母源水解产物。在一个实施方案中，细胞培养基基本由下列各物质组成基础细胞生长培养基； 约8至ianl/kg或120至130mg/L柠檬酸铁；约2至6mg/kg重组人胰岛素；约150至250g/ kg无水葡萄糖；约0. 1至0. 5g/kg L-谷氨酰胺；约1至2g/kg碳酸氢钠；及约5至15g/kg 酵母源水解产物。在另一个实施方案中，细胞培养基包含基础细胞生长培养基；约IOml/ kg或122. 45mg/L柠檬酸铁；约％ig/kg重组人胰岛素；约200g/kg无水葡萄糖；约0. 29至 0. 30g/kg L-谷氨酰胺；约1. 6g/kg碳酸氢钠；及约llg/kg酵母源水解产物。在另一个实施方案中，蛋白为抗体，包括(例如)完全人抗体、抗IL-12抗体，例如ABT-874。本发明也包括包含下列各物质的无血清细胞培养基基础细胞生长培养基；约8至ianl/kg或120至130mg/L柠檬酸铁；约2至6mg/kg重组人胰岛素；约1至3g/kg无水葡萄糖；约0. 1至lg/kg L-谷氨酰胺；约1至2g/kg碳酸氢钠；及约1至4g/kg酵母源水解产物。在一个实施方案中，细胞培养基基本由下列各物质组成基础细胞生长培养基；约 8至ianl/kg或120至130mg/L柠檬酸铁；约2至6mg/kg重组人胰岛素；约1至3g/kg无水葡萄糖；约0. 1至lg/kg L-谷氨酰胺；约1至2g/kg碳酸氢钠；及约1至4g/kg酵母源水解产物。在另一个实施方案中，细胞培养基包含基础细胞生长培养基；约10ml/kg或 122. 45mg/L柠檬酸铁；约％ig/kg重组人胰岛素；约1. 5g/kg无水葡萄糖；约0.四至0. 30g/ kg L-谷氨酰胺；约1. 6g/kg碳酸氢钠；及约2g/kg酵母源水解产物。在一个实施方案中， 细胞培养基的PH值为约7. 10至7. 30，渗透压在约300至340m0Sm/kg的范围内。在另一个实施方案中，细胞培养基包含至少8g/kg酵母源水解产物。在一个实施方案中，使用细胞培养在哺乳动物细胞(例如CHO细胞)中生产的蛋白为抗体，包括，例如，抗IL-12抗体或抗 EPO-R 抗体，例如 ABT-874。本发明进一步提供包含下列各物质的细胞培养基排除下列组份的经修饰基础培养基碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂及单糖葡萄糖；约8至ianl/kg或120至130mg/L柠檬酸铁；约2. 5至4. 5mL/kg或7. 8mg/kg重组人胰岛素；约5至9g/kg无水葡萄糖；约0. 5至lg/kg L-谷氨酰胺；约0. 1至lg/kg L-天冬酰胺一水合物；约1至2g/kg碳酸氢钠；约1至2g/kgHEPES ；约1至4g/kg NaCl ；约0. 1至 2g/kg Pluronic F-68 ；约 0. 01 至 0. lg/kg NaH2PO4 · H2O ；约 0. 1 至 lg/kg Na2HPO4 · 7H20 ； 约2至6g/kg酵母源水解产物；及约2至6g/kg植物源水解产物。在一个实施方案中，本发明细胞培养基基本由下列各物质组成排除下列组份的经修饰基础培养基碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂及单糖葡萄糖；约8至iaiil/kg 或120至130mg/L柠檬酸铁；约2. 5至4. 5mL/kg或7. 8mg/kg重组人胰岛素；约5至9g/kg 无水葡萄糖；约0. 5至lg/kg L-谷氨酰胺；约0. 1至lg/kg L-天冬酰胺一水合物；约1至 2g/kg 碳酸氢钠；约 1 至 2g/kgHEPES ；约 1 至 4g/kg NaCl ；约 0. 1 至 2g/kg Pluronic F-68 ； 约 0. 01 至 0. lg/kg NaH2PO4 · H2O ；约 0. 1 至 lg/kg Na2HPO4 · 7H20 ；约 2 至 6g/kg 酵母源水解产物；及约2至6g/kg植物源水解产物。在另一个实施方案中，细胞培养基包含经修饰的基础培养基；约10ml/kg或122. 45mg/L柠檬酸铁；约3. 8至3. 9mL/kg或7. 8mg/kg重组人胰岛素；约7. Og/kg无水葡萄糖；约0. 87至0. 88g/kg L-谷氨酰胺；约0. 45g/kg L-天冬酰胺一水合物；约 1. 6g/kg 碳酸氢钠；约 1. 8g/kg HEPES ；约 2. 67g/kg NaCl ；约 1. Og/kg Pluronic F-68 ；约 0. 03 至 0. 04g/kgNaH2P04 · H2O ；约 0. 43 至 0. 44g/kg Na2HPO4 · 7H20 ；约 4. Og/kg酵母源水解产物；及约2. 6g/kg植物源水解产物。本发明也包括包含下列各物质的细胞培养生产培养基经修饰以去除下列组份的经修饰基础培养基；碳酸氢钠、HEPES缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂及单糖葡萄糖；约8至ianl/kg或120至130mg/L柠檬酸铁；约4至8mL/kg或10 至Hmg/kg重组人胰岛素；约5至9g/kg无水葡萄糖；约0. 1至lg/kgL-谷氨酰胺；约1至 2g/kg碳酸氢钠；约 1 至2g/kg HEPES ；约 1 至3g/kg NaCl ；约0. 5至2g/kg Pluronic F-68 ； 约 0. 01 至 0. lg/kgNaH2P04 · H2O ；约 0. 1 至 lg/kg Na2HPO4 · 7H20 ；约 8 至 12g/kg 酵母源水解产物；及约6至8g/kg植物源水解产物。在一个实施方案中，本发明细胞培养生产培养基基本由下列各物质组成经修饰以去除下列组份的经修饰基础培养基碳酸氢钠、HEPES缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂及单糖葡萄糖；约8至iaiil/kg 或120至130mg/L柠檬酸铁；约4至8mL/kg或10至Hmg/kg重组人胰岛素；约5至9g/kg 无水葡萄糖；约0. 1至lg/kg L-谷氨酰胺；约1至2g/kg碳酸氢钠；约1至2g/kg HEPES ； 约 1 至 3g/kg NaCl ；约 0. 5 至 2g/kg Pluronic F-68 ；约 0. 01 至 0. lg/kgNaH2P04 · H2O ；约 0. 1至lg/kg Na2HPO4 · 7H20 ；约8至12g/kg酵母源水解产物；及约6至8g/kg植物源水解产物。在另一个实施方案中，细胞培养生产培养基包含经修饰的基础培养基；约10ml/kg 或122. 45mg/L柠檬酸铁；约6. OmL/kg或Umg/kg重组人胰岛素；约7. Og/kg无水葡萄糖； 约 0. 58 至 0. 59g/kg L-谷氨酰胺；约 1. 6g/kg 碳酸氢钠；约 1. 8g/kg HEPES ；约 2. 45g/kg NaCl ；约 1. Og/kg Pluronic F-68 ；约 0. 03 至 0. 04g/kg NaH2PO4 ·Η20 ；约 0. 43 至 0. 44g/kg Na2HPO4 · 7H20 ；约10. 7g/kg酵母源水解产物；及约6. 9至7. Og/kg植物源水解产物。本发明另一方面为包含下列各物质的细胞培养生产培养基排除下列组份的经修饰基础培养基碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂及单糖葡萄糖；约8至ianl/kg或110至130mg/L柠檬酸铁；约4至8mL/kg或11至15mg/kg 重组人胰岛素；约5至9g/kg无水葡萄糖；约0. 1至lg/kg L-谷氨酰胺；约1至2g/kg碳酸氢钠；约 1 至 2g/kg HEPES ；约 1 至 3g/kg NaCl ；约 0. 1 至 2g/kg Pluronic F-68 ；约 0. 01 至 0. lg/kg NaH2PO4 .H2O ；约 0. 1 至 lg/kg Na2HPO4 ·7Η20 ；约 12 至 16g/kg 酵母源水解产物； 及约8至10g/kg植物源水解产物。在一个实施方案中，细胞培养生产培养基基本由下列各物质组成排除下列组份的经修饰基础培养基碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂及单糖葡萄糖；约8至iaiil/kg或110至130mg/L柠檬酸铁； 约4至8mL/kg或11至15mg/kg重组人胰岛素；约5至9g/kg无水葡萄糖；约0. 1至lg/kg L-谷氨酰胺；约1至2g/kg碳酸氢钠；约1至2g/kg HEPES ；约1至3g/kg NaCl ；约0. 1至 2g/kg Pluronic F-68 ；约 0. 01 至 0. lg/kg NaH2PO4 · H2O ；约 0. 1 至 lg/kg Na2HPO4 · 7H20 ； 约12至16g/kg酵母源水解产物；及约8至10g/kg植物源水解产物。在另一个实施方案中，本发明细胞培养生产培养基包含经修饰的基础培养基；约10ml/kg或122. 45mg/L柠檬酸铁；约6. 5mL/kg或13mg/kg重组人胰岛素；约7. Og/kg无水葡萄糖；约0. 58至0. 59g/ kg L-谷氨酰胺；约 1. 6g/kg 碳酸氢钠；约 1. 8g/kg HEPES ；约 2. 45g/kg NaCl ；约 1. Og/kg Pluronic F-68 ；约 0. 03 至 0. 04g/kg NaH2PO4 .H2O ；约 0. 43 至 0. 44g/kg Na2HPO4 · 7H20 ；约 14. 2至14. 3g/kg酵母源水解产物；及约9. 2至9. 3g/kg植物源水解产物。在一个实施方案中，细胞培养基的pH为约6至8。在另一个实施方案中，细胞培养基的PH约7. 10至7. 20。在一个实施方案中，细胞培养基的渗透压约350至450m0sm/kg。在另一个实施方案中，细胞培养基的渗透压约373至403m0sm/kg。本发明的细胞培养基可进一步包含甲氨喋呤。在一个实施方案中，细胞培养基进一步包含例如约Ι-lOmL/kg甲氨喋呤。在另一个实施方案中，细胞培养基进一步包含例如约2. 50mL/kg甲氨喋呤。在一个实施方案中，在细胞培养物中表达的蛋白为抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，该抗体或其抗原结合片段为抗-TNFa抗体或抗-EPO-R抗体。在另一个实施方案中，抗-TNFa抗体或其抗原结合片段为完全人类抗TNF α抗体，包括，例如，完全人类抗-TNF α抗体D2E7(阿达木单抗)。在又另一个实施方案中，该抗体或其抗原结合片段为抗-IL-12或抗-IL-18抗体，包括完全人类抗-IL-12或抗-IL-18抗体。本发明也包括一种用于生产蛋白(例如抗体或其抗原结合部分)的方法，其包含在本文所呈现的细胞培养基中培养包含编码蛋白(例如抗体)的核酸的哺乳动物细胞。在一个实施方案中，细胞培养基为细胞培养生产培养基。可使用本发明方法及组合物生产的抗体或其抗原结合片段的实例包括抗IL-18抗体、抗-TNF α抗体、抗-IL-12抗体及抗EPO 受体(EP0-I )抗体。在一个实施方案中，本发明进一步包含从本文所述细胞培养生产培养基中分离蛋白。在一个实施方案中，本发明的细胞培养基及方法用于培养哺乳动物细胞，包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。本发明也包括本文所述任何细胞培养基中的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。本发明亦提供用于在哺乳动物细胞培养物(例如CHO细胞)中生产蛋白的改良补料分批方法和相关细胞培养基。本发明一方面为生产蛋白的补料分批方法，其包含在包含细胞培养生产培养基的细胞培养物中培养包含编码蛋白的核酸的哺乳动物细胞；及通过在一时段内向细胞培养物中添加水解产物富集(enrichment)溶液和基础富集溶液而向哺乳动物细胞馈料，其中水解产物富集溶液包含至少两种不同的非动物源水解产物；这样可生产蛋白。在一个实施方案中，基础富集溶液包含浓缩基础培养基。在另一个实施方案中，基础富集溶液包含基础培养基、天冬酰胺和葡萄糖。在另一个实施方案中，基础培养基为PF CHO。在一个实施方案中，水解产物富集溶液包含非衍生自植物或动物的第一水解产物和第二植物源水解产物。在一个实施方案中，非衍生自植物或动物和植物源的水解产物为酵母源水解产物。在一个实施方案中，植物源水解产物为大豆源水解产物。在一个实施方案中，所生产的蛋白为抗体或其抗原结合部分。可用于本发明的分批补料方法的抗体或其抗原结合部分的实例包括抗-TNF α抗体、抗-IL-12抗体、抗-IL-18 抗体及抗EPO受体(EP0-I )抗体。本发明包括产生抗TNF α抗体(包括，例如完全人类抗TNF α抗体，如阿达木单抗)的分批补料方法，其包含在包含细胞培养生产培养基的细胞培养物中培养包含编码抗-TNF α抗体的核酸的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞；并通过在一时段内向细胞培养物中添加水解产物富集溶液和基础富集溶液而向CHO细胞补料，其中基础富集溶液包含基础培养基、天冬酰胺和葡萄糖，且其中水解产物富集溶液包含至少两种不同的非动物源水解产物； 这样可生产抗-TNF α抗体。本发明包括生产抗-TNFa抗体的分批补料方法，其包含在包含细胞培养生产培养基的细胞培养物中培养包含编码抗-TNF α抗体的核酸的CHO细胞，该细胞培养生产培养基包含至少l_5g/L例如2. Og/L的葡萄糖，其中通过按需要向细胞培养生产培养基中添加葡萄糖以维持至少l_5g/L例如2. Og/L的葡萄糖浓度来控制葡萄糖浓度；并且通过在一时段内向细胞培养物中添加水解产物富集溶液和基础富集溶液而向CHO细胞补料，其中基础富集溶液包含基础培养基、天冬酰胺和葡萄糖，且其中水解产物富集溶液包含至少两种不同的非动物源水解产物；这样可生产抗-TNF α抗体。
11
在一个实施方案中，本发明包括进一步回收抗-TNF α抗体。在又另一个实施方案中，在约32至38°C范围内(例如35°C )的温度下培养细胞培养物。在一个实施方案中，使细胞培养生产培养基的溶氧维持在20-65%之间，例如约 30%溶氧。在一个实施方案中，在整个培养过程中维持细胞培养生产培养基的渗透压不超过 500m0smo在一个实施方案中，水解产物富集溶液包含非衍生自植物或动物的第一水解产物及第二植物源水解产物。在另一个实施方案中，非衍生自植物或动物和植物源水解产物的水解产物为酵母源水解产物。在另一个实施方案中，植物源水解产物为大豆源水解产物。在一个实施方案中，水解产物富集溶液基本由下列各物质组成约50至^Og/kg，例如250至 280g/kg大豆源水解产物及约75至300g/kg，例如150至180g/kg酵母源水解产物。在一个实施方案中，水解产物富集溶液包含约50至^Og/kg，例如250至280g/kg大豆源水解产物及约75至300g/kg，例如150至180g/kg酵母源水解产物。在一个实施方案中，基础培养基为PF CH0。在一个实施方案中，基础富集溶液的pH值约9. 0至10. 5。在另一个实施方案中，分批补料方法的时段在约9至15天之间或为约12天。在另一个实施方案中，于该时段中以下各日中至少一日将基础富集溶液添加至细胞培养生产培养基中第4日、第6日、第9日及第11日。在一个实施方案中，于该时段中第4日、第7日或第4日和第7日将水解产物富集溶液添加至细胞培养生产培养基中。在另一个实施方案中，分批补料方法进一步包含根据pH值线性斜坡(linear ramp)调节细胞培养生产培养基的pH值，其中该pH值线性斜坡包含自约6. 5_8(例如，7. 1 至7. 2之间)的pH值起始且产生约6. 5-7.0(例如6. 9)的最终pH值。在一个实施方案中， 至少在约M小时的时间段内调节pH值线性斜坡。在另一个实施方案中，至少在约48小时的时间段内调节PH值线性斜坡。在另一个实施方案中，在约72小时的时间段内调节pH值线性斜坡。本发明也包括在分批补料方法中使用本文所述的细胞培养基，例如包含下列各物质的细胞培养生产培养基排除下列组份的经修饰基础培养基；碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂及单糖葡萄糖；约8至10ml/kg或110至 130mg/L柠檬酸铁；约4至8mL/kg或10至Hmg/kg重组人胰岛素；约5至9g/kg无水葡萄糖；约0. 1至lg/kg L-谷氨酰胺；约1至3g/kg碳酸氢钠；约1至3g/kg HEPES ；约2至3g/ kg NaCl ；约 0. 1 至 2g/kgPluronic F-68 ；约 0. 01 至 0. lg/kg NaH2PO4 .H2O ；约 0. 1 至 0. Ig/ IigNa2HPO4 · 7H20 ；约8至12g/kg酵母源水解产物；及约6至8g/kg植物源水解产物。在一个实施方案中，细胞培养生产培养基包含经修饰的基础培养基；约10. 0ml/kg或12M5mg/ L柠檬酸铁；约6. OmL/kg或iang/kg重组人胰岛素；约7. 0g/kg无水葡萄糖；约0. 58至 0. 59g/kgL-谷氨酰胺；约 1. 6g/kg碳酸氢钠；约 1. 8g/kg HEPES ；约 2. 45g/kgNaCl ；约 1. Og/ kg Pluronic F-68 ；约 0. 03 至 0. 04g/kg NaH2PO4 .H2O ；约 0. 43 至 0. 44g/kg Na2HPO4 ·7Η20 ； 约10. 7g/kg酵母源水解产物；及约6. 9至7. 0g/kg植物源水解产物。本发明也提供生产抗-IL12抗体(例如完全人类抗-IL12抗体(如ABT-874))的分批补料方法，其包含在包含细胞培养生产培养基的细胞培养物中培养包含编码抗体的核酸的CHO细胞；通过在一时段内向细胞培养物中添加水解产物富集溶液和基础富集溶液向 CHO细胞补料，其中基础富集溶液包含基础培养基、天冬酰胺和葡萄糖，且其中水解产物富集溶液包含至少两种不同的非动物源水解产物；这样可产生抗-IL12抗体。在一个实施方案中，水解产物富集溶液进一步包含葡萄糖。在一个实施方案中，本发明也包括回收抗-IL12抗体。在一个实施方案中，在约32至38°C范围内(例如约33°C )的温度下培养细胞培养物。在本发明的一个实施方案中，将细胞培养生产培养基的溶氧维持在20-65%之间， 例如约40%溶氧。在另一个实施方案中，细胞培养生产培养基的pH值约6. 7至7. 2。在本发明的另一个实施方案中，水解产物富集溶液包含非衍生自植物或动物的水解产物和植物源水解产物。在一个实施方案中，非衍生自植物或动物的水解产物为酵母源水解产物。在另一个实施方案中，植物源水解产物为大豆源水解产物。在另一个实施方案中，水解产物富集溶液基本由下列各物质组成约50至225g/kg，例如150至180g/kg大豆源水解产物、约75至300g/kg，例如250至280g/kg酵母源水解产物及约1至5g/L，例如2 至3g/L葡萄糖。在另一个实施方案中，水解产物富集溶液包含约50至225g/kg，例如150 至180g/kg大豆源水解产物、约75至300g/kg，例如250至280g/kg酵母源水解产物及约1 至5g/L，例如2至3g/L葡萄糖。在一个实施方案中，基础富集溶液包含基础培养基、天冬酰胺和葡萄糖。在另一个实施方案中，基础富集溶液的pH值约9. 7，渗透压约1400至1500m0sm。 在另一个实施方案中，基础富集溶液中的基础培养基为PF CH0。在一个实施方案中，分批补料方法的时段在14-15天之间。在一个实施方案中，自该时段的第5日起，每隔一天将基础富集溶液添加至细胞
培养生产培养基中。在本发明的一个实施方案中，自该时段的第6日起始，每天将基础富集溶液添加至细胞培养生产培养基中。在另一个实施方案中，自该时段的第5日起始，每天将基础富集溶液及水解产物富集溶液添加至细胞培养生产培养基中。本发明也包括在分批补料方法中使用本文所述的细胞培养基，例如包含下列各物质的细胞培养生产培养基排除下列组份的经修饰基础培养基；碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂及单糖葡萄糖；约8至iaiil/kg或110至 130mg/L柠檬酸铁；约5至8mL/kg或11至15mg/kg重组人胰岛素；约5至9g/kg无水葡萄糖；约0. 1至lg/kg L-谷氨酰胺；约1至2g/kg碳酸氢钠；约1至2g/kg HEPES ；约2至3g/ kg NaCl ；约 0. 1 至 2g/kgPluronic F-68 ；约 0. 01 至 0. lg/kg NaH2PO4 · H2O ；约 0. 1 至 Ig/ IigNa2HPO4 · 7H20 ；约6至12g/kg酵母源水解产物；及约6至8g/kg植物源水解产物。在一个实施方案中，细胞培养生产培养基包含约10ml/kg或122. 45mg/L柠檬酸铁；约6. 5mL/ kg或i:3mg/kg重组人胰岛素；约7. Og/kg无水葡萄糖；约0. 58至0. 59g/kg L-谷氨酰胺； 约 1. 6g/kg碳酸氢钠；约 1. 8g/kg HEPES ；约 2. 45g/kg NaCl ；约 1. Og/kgPluronic F-68 ；约 0. 03 至 0. 04g/kg NaH2PO4 · H2O ；约 0. 43 至 0. 44g/kgNa2HP04 · 7H20 ；约 10. 7g/kg 酵母源水
13解产物；及约6. 9至7. Og/kg植物源水解产物。在一个实施方案中，本发明以大规模培养细胞方法为特点。在一个实施方案中，大规模细胞培养大于约10L。在另一个实施方案中，大规模细胞培养为约13L。本发明也提供组合补料溶液，因为这些溶液可在一种溶液中提供养分组合所以是有利的。本发明包括包含下列各物质的组合补料溶液葡萄糖；基础培养基；除谷氨酰胺以外的氨基酸；及至少两种不同的非动物源水解产物。本发明也包括基本由下列各物质组成的组合补料溶液葡萄糖；基础培养基；除谷氨酰胺以外的氨基酸；及至少两种不同的非动物源水解产物。在一个实施方案中，补料溶液的pH值约6. 0至8. 0。在一个实施方案中，组合补料溶液包含约100至250g/kg葡萄糖。在一个实施方案中，组合补料溶液包含氨基酸天冬酰胺，例如约1. 0至15. Og天冬酰胺；或约3. 0至5. Og/ kg天冬酰胺。在一个实施方案中，组合补料溶液中的至少两种不同的非动物源水解产物为植物源水解产物和既非动物源也非植物源的水解产物。在一个实施方案中，非动物源或植物源水解产物为酵母源水解产物。在一个实施方案中，植物源水解产物为大豆源水解产物。在一个实施方案中，组合补料溶液包含为PF-CHO或DMEM/F12培养基的基础培养基。在一个实施方案中，基础细胞培养基为经修饰的基础培养基且排除以下组份碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂、谷氨酰胺和葡萄糖。在另一个实施方案中，组合补料溶液进一步具有小于约15NTU的浊度。本发明以维持细胞培养生产培养基的稳定葡萄糖含量的方法为特点，其包含添加本文所述的组合补料溶液。本发明的另一方面为制造包含下列各物质的组合补料溶液的方法基础培养基、 葡萄糖及至少两种不同的非动物源水解产物，其包含将葡萄糖与基础细胞培养基组合至溶液中；将a)溶液的pH值调节至约9. 5至10. 5 ；将至少两种不同的非动物源水解产物添加至b)溶液中；并调节c)溶液的pH值，这样组合补料溶液的pH值约6. 5至7. 5。在一个实施方案中，步骤c)包含添加既非以动物源也非植物源的第一水解产物和第二植物源水解产物。在一个实施方案中，非动物源或植物源水解产物为酵母源水解产物。在另一个实施方案中，植物源水解产物为大豆源水解产物。本发明进一步提供增加由哺乳动物细胞培养物生产的蛋白(例如抗体或其抗原结合部分)的方法。本发明提供由哺乳动物细胞培养物生产至少约1.5g/L抗体的方法，其包含在细胞培养生产培养基中培养包含编码抗体的核酸的哺乳动物细胞；及向细胞培养生产培养基中添加pH值约6. 7至7. 2的组合补料溶液，其中该组合补料溶液包含葡萄糖、基础细胞培养基、除谷氨酰胺以外的氨基酸及至少两种不同的非动物源水解产物，这样可生产至少约1.5g/L抗体。在一个实施方案中，生产至少2g/L抗体。在另一个实施方案中，生产至少4g/L抗体。在另一个实施方案中，生产至少5g/L抗体。在另一个实施方案中，本发明提供用于产生约6g/L抗体的方法。在一个实施方案中，组合补料溶液包含约100至250g/kg葡萄糖。本发明也提供用于增加哺乳动物细胞培养物所生产抗体的滴度的方法，其包含在细胞培养生产培养基中培养包含编码抗体的核酸的哺乳动物细胞；及向细胞培养生产培养基中添加pH值约6. 7至7. 2的组合补料溶液，其中该组合补料溶液包含葡萄糖、基础细胞培养基、除谷氨酰胺以外的氨基酸及至少两种不同的非动物源水解产物；这样所产生抗体的滴度比根据步骤a)且排除步骤b)培养的对照哺乳动物细胞培养物高至少50%。在一个实施方案中，所生产的抗体滴度比对照物高至少100%。在另一个实施方案中，所生产的抗体滴度比对照物高至少150 %。在一个实施方案中，当细胞密度达到每毫升至少2. 0 X IO6个细胞时添加组合补料溶液。在一个实施方案中，当细胞密度达到每毫升约3. 5X IO6个细胞时添加组合补料溶液。本发明进一步提供在哺乳动物细胞培养物中生产蛋白(例如抗体或其抗原结合部分)的方法，其包含在细胞培养生产培养基中培养包含编码蛋白的核酸的哺乳动物细胞；及使用反馈控制系统来监控细胞培养生产培养基中的代谢指示剂水平，藉此将组合补料溶液添加至细胞培养生产培养基中，其中在该反馈控制系统所测定的时间点将组合补料溶液添加至细胞培养生产培养基中，这样以生产抗体。在一个实施方案中，代谢指示剂为葡萄糖或谷氨酰胺。在另一个实施方案中，补料溶液为包含下列各物质的组合补料溶液葡萄糖；基础细胞培养基；除谷氨酰胺以外的氨基酸；及至少两种不同的非动物源水解产物。 在一个实施方案中，抗体为抗-TNF α抗体、抗-IL-12抗体、抗-IL-18抗体及抗-EPO受体 (EPO-R)抗体。在一个实施方案中，使用本发明方法生产至少1. 5g/L滴度的抗体。在另一个实施方案中，生产至少2g/L的滴度。在本发明的一个实施方案中，组合补料溶液包含约3. 0至12. 5g/kg天冬酰胺。在本发明的一个实施方案中，组合补料溶液包含约100至200g/kg葡萄糖。在另一个实施方案中，本发明进一步包含监控细胞培养基中的葡萄糖含量，使得葡萄糖水平维持于约0. 25与20. Og/L之间。在一个实施方案中，使用自动取样装置监控葡萄糖水平。在一个实施方案中，使用本文公开的方法和组合物生产的抗体或其抗原结合部分选自抗-TNFa抗体、抗-IL-18抗体、抗-EPO-R抗体及抗IL-12抗体。在一个实施方案中， 抗体或其抗原结合部分为完全人类抗体。在一个实施方案中，抗-TNF α抗体为D2E7(阿达木单抗)。在一个实施方案中，抗IL-18抗体为ABT-325。在一个实施方案中，抗IL-12抗体为 ABT-874。本发明也提供测定在哺乳动物细胞培养物中生产蛋白的补料曲线的方法，其包含在细胞培养生产培养基中培养包含编码抗体的核酸的哺乳动物细胞；及使用反馈控制系统监控细胞培养生产培养基中的代谢指示剂，藉此将组合补料溶液添加至细胞培养生产培养基中，其中将组合补料溶液添加至细胞培养生产培养基中以达到目标代谢指示剂设定点； 及测定每天添加至细胞培养生产培养基中的组合补料溶液的量，这样以测定补料曲线。在一个实施方案中，代谢指示剂为葡萄糖或谷氨酰胺。本发明也包括在哺乳动物细胞培养物中生产蛋白的分批补料方法，其包含根据使用本发明方法测定的补料曲线将组合补料溶液添加至哺乳动物细胞培养物中。本发明的另一方面为包括丁酸钠和/或N-乙酰半胱氨酸的改良细胞培养基。本发明以在哺乳动物细胞培养物中生产抗体使得抗体滴度为至少300mg/L的方法为特点，该方法包含在细胞培养生产培养基中培养包含编码抗体的核酸的哺乳动物细胞；向细胞培养基中添加丁酸钠、N-乙酰半胱氨酸或其组合，其中添加丁酸钠至终浓度约0. ImM至IOmM且添加N-半胱氨酸至终浓度约ImM至80mM ；这样以生产至少300mg/L滴度的抗体。在一个实施方案中，抗体滴度至少为约100mg/L。在一个实施方案中，抗体滴度至少为约200mg/ L0在一个实施方案中，抗体滴度至少为约250mg/L。在一个实施方案中，抗体滴度至少为约 300mg/L。在一个实施方案中，抗体滴度至少为约400mg/L。本发明也提供在哺乳动物细胞培养物中生产抗体，使得抗体滴度至少比对照哺乳动物细胞培养物高10%的方法，该方法包含a)在细胞培养生产培养基中培养包含编码抗体的核酸的哺乳动物细胞；及b)向细胞培养基中添加丁酸钠、N-乙酰半胱氨酸或其组合， 其中添加丁酸钠至终浓度约0. ImM至IOmM且添加N-乙酰半胱氨酸终浓度至约ImM至80mM， 使得抗体滴度至少比对照物高10%，其中对照哺乳动物细胞培养包含步骤a)且排除步骤 b)。在一个实施方案中，哺乳动物细胞培养物的抗体滴度比对照哺乳动物细胞培养物改良至少四％。在一个实施方案中，哺乳动物细胞培养物的抗体滴度比对照哺乳动物细胞培养物改良至少40%。在一个实施方案中，哺乳动物细胞培养物的抗体滴度比对照哺乳动物细胞培养物改良至少70%。在一个实施方案中，哺乳动物细胞培养物的抗体滴度比对照哺乳动物细胞培养物高至少90%。在一个实施方案中，在哺乳动物细胞培养物的生长期向哺乳动物细胞培养物中添加丁酸钠、N-乙酰半胱氨酸或其组合。在一个实施方案中，在培养时间的第4天与第7天之间向哺乳动物细胞培养物中添加丁酸钠、N-乙酰半胱氨酸或其组合。在一个实施方案中，在培养时间的第0天向哺乳动物细胞培养物中添加丁酸钠、 N-乙酰半胱氨酸或其组合。在另一个实施方案中，丁酸钠的终浓度为约0. ImM至10mM。在一个实施方案中， 丁酸钠的终浓度为约0. ImM至8. OmM。在一个实施方案中，丁酸钠的终浓度为约0. ImM至 3. OmM 丁酸钠。在一个实施方案中，N-乙酰半胱氨酸的终浓度为约20mM至60mM。在一个实施方案中，N-乙酰半胱氨酸的终浓度为约10mM。在一个实施方案中，N-乙酰半胱氨酸的终浓度为约8mM。本发明进一步提供与对照哺乳动物细胞培养物相比使哺乳动物细胞培养物的寿命延长至少35%的方法，该方法包含a)在细胞培养生产培养基中培养包含编码抗体的核酸的哺乳动物细胞；及b)将约ImM至80mM N-乙酰半胱氨酸添加至细胞培养基中，使得哺乳动物细胞培养物的寿命与对照哺乳动物细胞培养物相比延长至少35%，其中对照哺乳动物细胞培养包含步骤a)且排除步骤b)。在一个实施方案中，哺乳动物细胞培养物的寿命与对照哺乳动物细胞培养物相比延长至少约45%。在一个实施方案中，哺乳动物细胞培养物的寿命与对照哺乳动物细胞培养物相比延长至少约55%。在一个实施方案中，本发明方法包含将终浓度为约SmM的N-乙酰半胱氨酸添加至
细胞培养生产培养基中。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分选自抗-TNF α抗体、抗_IL_18抗体 (例如ABT-325)及抗IL-12抗体。
本发明提供包含A部分、B部分及C部分的无血清细胞培养基，其中A部分基本由排除下列组份的经修饰基础培养基组成碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂及单糖葡萄糖；B部分基本由无机铁来源组成；且C部分包含重组生长因子、缓冲剂、渗透压调节剂、能量来源及至少两种不同的非动物水解产物。在一个实施方案中，C部分基本由下列各物质组成重组生长因子；缓冲剂；渗透压调节剂；能量来源； 及至少两种不同的非动物水解产物。本发明也提供包含下列各物质的无血清细胞培养生产培养基维生素含量降低且排除下列组份的经修饰基础培养基碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂及单糖葡萄糖；约10ml/kg或122. 45mg/L柠檬酸铁；约6. 5mL/kg或13mg/ kg重组人胰岛素；约7. Og/kg无水葡萄糖；约0. 58至0. 59g/kg L-谷氨酰胺；约1. 6g/kg 碳酸氢钠；约 1. 8g/kg HEPES ；约 2. 45g/kg NaCl ；约 1. Og/kg Pluronic F-68 ；约 0. 03 至
0.04g/kg NaH2PO4 .H2O ；约 0. 43 至 0. 44g/kg Na2HPO4 ·7Η20 ；约 10. 7g/kg 酵母源水解产物； 及约6. 9至7. Og/kg植物源水解产物。本发明也提供包含下列各物质的无血清细胞培养基维生素含量降低且排除下列组份的经修饰基础培养基碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、 表面活性剂及单糖葡萄糖；约150g/kg无水葡萄糖；约5. Og/kg L-天冬酰胺一水合物；约
1.6g/kg碳酸氢钠；约65g/kg酵母源水解产物；及约41g/kg植物源水解产物。本发明进一步提供包含下列各物质的无血清细胞培养基维生素含量降低且排除下列组份的经修饰基础培养基碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂及单糖葡萄糖；约10ml/kg或122. 45mg/L柠檬酸铁；约6. 5mL/kg或Umg/ kg重组人胰岛素；约200g/kg无水葡萄糖；约0. 58至0. 59g/kg L-谷氨酰胺；约1. 6g/kg 碳酸氢钠；约 1. 8g/kg HEPES ；约 2. 45g/kg NaCl ；约 1. Og/kgPluronic F-68 ；约 0. 03 至 0. 04g/kg NaH2PO4 · H2O ；约 0. 43 至 0. 44g/kgNa2HP04 · 7H20 ；约 10. 7g/kg 酵母源水解产物； 及约6. 9至7. Og/kg植物源水解产物。本发明也提供改良培养基的以下实施方案。本发明包括用于培养CHO细胞以表达重组生物制品的改良培养基，其包含A、B和C部分，其中A部分包含水、氨基酸、维生素及其他辅因子；B部分包含无机铁来源；且C部分包含重组生长因子、缓冲剂、渗透压调节剂、 能量来源、非铁金属离子、水解产物及附加试剂。在一个实施方案中，C部分包含碳酸氢钠、HEPES、磷酸二氢钠及磷酸氢二钠、氯化钠、Pluronic F-68及葡萄糖。在另一个实施方案中，添加1. 5g/L碳酸氢钠。在另一个实施方案中，添加1. 8g/L HEPES。在另一个实施方案中，添加0. 1-0. 5g/L磷酸二氢钠及磷酸氢二钠。在另一个实施方案中，添加lg/L至6.5g/L氯化钠。在另一个实施方案中，添加 1.0g/L Pluronic F-68。在一个实施方案中，添加lg/L至7g/L葡萄糖。在一个实施方案中，维生素选自PABA (对氨基苯甲酸)、生物素、D-Ca泛酸盐(维生素B5)、叶酸、内消旋肌醇、烟酰胺、PyrodoXine(维生素B6)、核黄素(维生素B2)、硫胺素(维生素Bi)和氰钴胺 (Cyanocobalamin)(维生素B12)。在另一个实施方案中，其他辅因子选自脂因子、醇胺、氨基酸和肽。在另一个实施方案中，脂因子选自氯化胆碱及磷脂酰胆碱。在另一个实施方案中，醇胺为乙醇胺。在一个实施方案中，氨基酸选自天冬酰胺、谷氨酰胺及腐胺。在一个实施方案中，肽为谷胱甘肽。在一个实施方案中，添加0. 4mg/L至1. 65mg/L谷胱甘肽。在另一个实施方案中，B部分的无机铁来源为柠檬酸铁。在一个实施方案中，添加 10mL/L或12aiig/L柠檬酸铁。在另一个实施方案中，使柠檬酸铁保持12aiig/L的浓度。在一个实施方案中，重组生长因子为胰岛素或重组类似物、IGF-I或胰岛素与IGF-I的组合。 在一个实施方案中，添加細g/L至13mg/L胰岛素或重组类似物。在另一个实施方案中，添加 25ng/L至150ng/L IGF-1。在另一个实施方案中，添加50ng/L至100ng/L IGF-1。在另一个实施方案中，将25ng/L至150ng/L IGF-1添加至胰岛素中。在一个实施方案中，将50ng/ L至100ng/L IGF-I添加至胰岛素中。在另一个实施方案中，渗透压调节剂选自NaCl、KCl、KN03。在一个实施方案中，添加Og/L至10g/L渗透压调节剂。在另一个实施方案中，添加Og/L至6. 5g/L渗透压调节剂。在另一个实施方案中，能量来源为单糖，例如葡萄糖(例如D-葡萄糖)、麦芽糖、甘露糖、半乳糖及果糖。在一个实施方案中，添加1. Og/L至7. Og/L葡萄糖。在另一个实施方案中，添加1.5g/L至5. Og/L葡萄糖。在另一个实施方案中，以氯化物和硫酸盐的形式添加非铁金属离子。在一个实施方案中，非铁金属离子选自钾、镁、铜、硒、锌、镍、锰、锡、镉、钼酸盐、钒酸盐及硅酸盐。在一个实施方案中，缓冲剂选自碳酸盐、氯化物、硫酸盐和磷酸盐。在一个实施方案中，缓冲剂选自 NaHCO3、CaCl2, MGSO4、NaH2PO4、Na2HPO4, C3H3O3Na 和称作 HEPES 的 N-[2-羟乙基]哌嗪-N' -[2-乙烷磺酸]。在本发明的一个实施方案中，添加至培养基中的附加试剂之一为甲氨喋呤。在一个实施方案中，甲氨喋呤用于使表达抗-IL-18、抗-IL-12、抗-TNFa (例如完全人类抗-TNFa)或抗EPO-R抗体的CHO细胞的生长。在一个实施方案中，添加IOOmM至5000nM。 在一个实施方案中，向培养基中添加500nM甲氨喋呤。在一个实施方案中，添加IOOnM甲氨喋呤。在一个实施方案中，添加5000nM甲氨喋呤。在本发明的另一个实施方案中，附加试剂之一为细胞保护剂，例如甲基纤维素或 pluronic多元醇(例如Pluronic F-68)。在一个实施方案中，添加0. 5g/L至1. 0g/L甲基纤维素。在一个实施方案中，添加0. 5g/L至1.0g/L Pluronic F-68。在一个实施方案中， 添加 0. 7g/L 至 1. 2g/L Pluronic F-68。在另一个实施方案中，将A部分的pH增加至最大pH值10。在一个实施方案中，在添加水解产物之后将A部分的pH降低至最小值7. 0。本发明也提供用于表达完全人类抗-TNF α抗体的CHO细胞的改良培养基，其包含10. 0ml/kg或122mg/kg柠檬酸铁；2mL/kg或4. 0mg/kg重组人胰岛素；3. 5g/kg无水葡萄糖；0. 292g/kg L-谷氨酰胺；1. 6g/kg 碳酸氢钠；0. 031g/kg NaH2PO4 · H2O ；0. 436g/ IigNa2HPO4 · 7H20 ；2. 0g/kg 水解产物；及 2. 50mL/kg 甲氨喋呤。本发明也提供用于表达完全人类抗-TNF-α抗体的CHO细胞的改良培养基，其包含10. 0ml/kg或12ang/kg柠檬酸铁；6. 0mL/kg或12mg/kg重组人胰岛素；7. 0g/kg无水葡萄糖；0. 584g/kg L-谷氨酰胺；1. 6g/kg 碳酸氢钠；1. 8g/kg HEPES ；2. 45g/kg NaCl ；1. Og/ kg PluronicF-68 ；0. 031g/kg NaH2PO4 .H2O ；0. 436g/kg Na2HPO4 ·7Η20 ；10. 7g/kg 水解产物； 6. 92g/kg 植物蛋白胨(Phytone peptone)；及 2. 50mL/kg 甲氨喋呤。本发明也包括用于表达完全人类抗-TNF-α抗体的CHO细胞的改良培养基，其包含10ml/kg或122mg/L柠檬酸铁；3. 88mL/kg或7. 8mg/kg重组人胰岛素；7. Og/kg无水葡萄糖；0. 876g/kg L-谷氨酰胺；0. 45g/kg L-天冬酰胺一水合物；1. 6g/kg碳酸氢钠；1. Sg/ kgHEPES ；2. 67g/kg NaCl ；1. Og/kg Pluronic F-68 ；0. 03IgAgNaH2PO4 · H2O ；0. 436g/kg Na2HPO4 · 7H20 ；10. 7g/kg水解产物；6. 92g/kg植物蛋白胨；及2. 50mL/kg甲氨喋呤。本发明进一步提供用于表达完全人类抗-TNF-α抗体的CHO细胞的改良培养基， 其包含10ml/kg或122mg/L柠檬酸铁；3. 88mL/kg或7. 8mg/kg重组人胰岛素；7. Og/kg无水葡萄糖；0. 876g/kg L-谷氨酰胺；0. 45g/kg L-天冬酰胺一水合物；1. 6g/kg碳酸氢钠； lg/kgHEPES ；2. 67g/kg NaCl ；1.Og/kg Pluronic F-68 ；0. 031g/kgNaH2P04 · H2O ；0.436g/kg Na2HPO4 · 7H20 ；4. Og/kg水解产物；2. 6g/kg植物蛋白胨；及2. 50mL/kg甲氨喋呤。本发明的另一方面为用于表达抗IL-18抗体的CHO细胞的改良培养基，其包含 10ml/kg或122mg/L柠檬酸铁；3. 88mL/kg或7. 8mg/kg重组人胰岛素；7. Og/kg无水葡萄糖；0. 876g/kg L-谷氨酰胺；0. 45g/kg L-天冬酰胺一水合物；1. 6g/kg碳酸氢钠；1. Sg/ kg HEPES ；2.675g/kg NaCl ；1.Og/kg Pluronic F-68 ；0.031g/kg NaH2PO4· H2O ；0.436g/kg Na2HPO4 · 7H20 ；4. Og/kg酵母源水解产物；2. 579g/kg植物蛋白胨；及2. 50mL/kg甲氨喋呤。本发明提供用于表达抗IL-18抗体的CHO细胞的改良培养基，其包含10ml/kg 或122mg/L柠檬酸铁；6. 5mL/kg或Umg/kg重组人胰岛素；7. Og/kg无水葡萄糖；0. 584g/ kg L-谷氨酰胺；1. 6g/kg 碳酸氢钠；1. 8g/kg HEPES ；2. 45g/kg NaCl ；1. Og/kg Pluronic F-68 ；0. 031g/kg NaH2PO4 · H2O ；0. 436g/kg Na2HPO4 · 7H20 ；10. 7g/kg 酵母水解产物；及 6. 92g/kg植物蛋白胨。本发明提供用于表达抗IL-18抗体的CHO细胞的改良培养基，其包含150. Og/kg 无水葡萄糖；5. Og/kg L-天冬酰胺一水合物；65. Og/kg酵母水解产物；及41. Og/kg植物蛋白胨。本发明也提供用于表达抗-IL-18抗体的CHO细胞的改良培养基，其包含10ml/ kg或122mg/kg柠檬酸铁；6. 5mL/kg或13mg/kg重组人胰岛素；200. Og/kg无水葡萄糖； 0. 584g/kg L-谷氨酰胺；1. 6g/kg 碳酸氢钠；1. 8g/kg HEPES ；2. 45g/kg NaCl ；1. 0ml/kg Pluronic F-68 ；0. 031g/kg NaH2PO4 · H2O ；0. 436g/kg Na2HPO4 · 7H20 ；10. 7g/kg 酵母水解产物；及6. 92g/kg植物蛋白胨。本发明包括用于表达抗-IL-18抗体的CHO细胞的改良培养基，其包含10ml/kg 或12ang/kg柠檬酸铁；2111171^或％^/1^重组人胰岛素；3. 5+1. 5g/kg无水葡萄糖；0. 292g/ kg L-谷氨酰胺；1. 6g/kg碳酸氢钠；2g/kg酵母水解产物；及0. 25mL/kg甲氨喋呤。本发明包括用于表达抗IL-18抗体的CHO细胞的改良培养基，其包含10ml/kg或 12ang/kg柠檬酸铁；2111171^或％^/1^重组人胰岛素；3. 5+1. 5g/kg无水葡萄糖；0. 292g/kg L-谷氨酰胺；1. 6g/kg碳酸氢钠；llg/kg酵母水解产物；及0. 250mL/kg甲氨喋呤。本发明包括用于表达抗-IL-18抗体的CHO细胞的改良培养基，其包含10ml/kg 或12ang/kg柠檬酸铁；2mL/kg或％ig/kg重组人胰岛素；200g/l无水葡萄糖；0. 292g/kg L-谷氨酰胺；1. 6g/kg碳酸氢钠；8g/kg酵母水解产物；及0. 250mL/kg甲氨喋呤。本发明包括用于表达抗IL-18抗体的CHO细胞的改良培养基，其包含10ml/kg或 122mg/kg柠檬酸铁；3. 88mL/kg或7. 76mg/L重组人胰岛素；7. Og/Ι无水右旋糖；0. 876g/L L-谷氨酰胺；1. 6g/kg碳酸氢钠；1. 8g/L HEPES ；2. 67g/L NaCl ；1. 0g/L Pluronic ；0. 03Ig/LNaH2PO4 · H2O ；0. 436g/L Na2HPO4 · 7H20 ；4. Og/L 酵母粉(yeastolate) ；2. 579g/L 植物蛋白胨；0. 05mL/kg 甲氨喋呤；3. 5mL/L 2N NaOH ；及 2. 91g/L 2N HCl ；其产生 7. 10 至 7. 20 的终 pH值及373至403m0smo/kg的终渗透压。本发明包括用于表达抗IL-18抗体的CHO细胞的改良培养基，其包含IOml/ kg或12ang/kg柠檬酸铁；13mg/L重组人胰岛素；7. Og/1无水右旋糖；0. 584g/L L-谷氨酰胺；1. 6g/kg 碳酸氢钠；1. 8g/LHEPES ；2. 45g/L NaCl ；1. Og/L Pluronic ；0. 031g/L NaH2PO4 · H2O ；0. 436g/L Na2HPO4 · 7H20 ；10. 7g/L 酵母粉；6. 92g/L 植物蛋白腺；0. 05mL/kg 甲氨喋呤；5. 67mL/L 2N NaOH ；及2. 5g/L 2N HCl ；其产生7. 10至7. 20的终pH值和373至 403m0smo/kg的终渗透压。本发明包括用于表达抗IL-18抗体的CHO细胞的改良培养基，其包含10ml/kg或 12ang/kg柠檬酸铁；％ig/kg重组人胰岛素；1. 5g/kg无水右旋糖；0. 292g/kg L-谷氨酰胺； 1. 6g/kg碳酸氢钠；2. Og/L酵母粉；及0. 25mL/kg甲氨喋呤；其产生7. 10至7. 30的终pH值和300至;340m0smo/kg的终渗透压。本发明包括用于表达抗IL-18抗体的CHO细胞的改良培养基，其包含10ml/kg或 122mg/kg柠檬酸铁；i:3mg/kg重组人胰岛素；7. Og/kg无水右旋糖；0. 584g/kg L-谷氨酰胺；1. 6g/kg碳酸氢钠；1. 8g/kg HEPES ；2. 45g/kg NaCl ；1. 0g/kg Pluronic F-68 ；0. 031g/ IigNaH2PO4 · H2O ；0. 436g/kg Na2HPO4 · 7H20 ；10. 7g/L 酵母粉；及 6. 92g/kg 植物蛋白胨； 5. 67mL/kg NaOH ；及 2. 5mL/kg HCl ；其产生 7. 10 至 7. 20 的终 pH 值和 373 至 403m0smo/kg 的终渗透压。本发明包括用于表达抗IL-18抗体的CHO细胞的改良培养基，其包含10ml/kg或 122mg/kg柠檬酸铁；7. 76mg/kg重组人胰岛素；7. Og/Ι无水右旋糖；0. 876g/kg L-谷氨酰胺；1. 6g/kg 碳酸氢钠；1. 8g/kgHEPES ；2. 67g/kg NaCl ；1. 0g/kg Pluronic F-68 ；0. 031g/ IigNaH2PO4 · H2O ；0. 436g/kg Na2HPO4 · 7H20 ；4. 0g/L 酵母粉；及 2. 579g/L 植物蛋白胨； 0. 05mL/L 甲氨喋呤；3. 5mL/kg NaOH ；及 2. 91mL/kgHCl ；其产生 7. 10 至 7. 20 的终 pH 值和 373至403m0smo/kg的终渗透压。本发明包括用于表达抗IL-18抗体的CHO细胞的改良培养基，其包含10ml/kg 或12ang/kg柠檬酸铁；i;3mg/kg重组人胰岛素；7. Og/Ι无水右旋糖；0. 584g/kg L-谷氨酰胺；1. 6g/kg 碳酸氢钠；1. 8g/kgHEPES ；2. 45g/kg NaCl ；1. 0g/kg Pluronic F-68 ；0. 031g/ IigNaH2PO4 · H2O ；0. 436g/kg Na2HPO4 · 7H20 ；10. 7g/L 酵母粉；及 6. 92g/L 植物蛋白胨； 0. 05mL/L 甲氨喋呤；5. 67mL/kg NaOH ；及 2. 5mL/kgHCl ；其产生 7. 10 至 7. 20 的终 pH 值和 373至403m0smo/kg的终渗透压。本发明包括用于表达抗IL-18抗体的CHO细胞的改良培养基，其包含10ml/kg 或12ang/kg柠檬酸铁；i;3mg/kg重组人胰岛素；7. Og/Ι无水右旋糖；0. 584g/kg L-谷氨酰胺；1. 6g/kg 碳酸氢钠；1. 8g/kgHEPES ；1. 0g/kg Pluronic F-68 ；0. 031g/kg NaH2PO4 · H2O ； 0. 436g/kgNa2HP04 · 7H20 ； 14. 27g/L 酵母粉；9. 23g/L 植物蛋白胨；0. 05mL/L 甲氨喋呤； 8. 95mL/kg NaOH ；及 4. lmL/kg HCl ；其产生 7. 10 至 7. 20 的终 pH 值及 373 至 403m0smo/kg 的终渗透压。本发明也提供通过增加终滴度增加CHO细胞系生产IgGl抗体的生产率的方法，其包含添加丁酸钠；及添加N-乙酰半胱氨酸。在一个实施方案中，IgGl抗体为抗-IL-18。在一个实施方案中，通过终滴度的增加测量生产率的增加。在一个实施方案中，通过添加 0. ImM至IOmM浓度的丁酸钠达到终滴度的增加。在一个实施方案中，丁酸钠的浓度为0. ImM 至8.0mM。在一个实施方案中，丁酸钠的浓度为0. ImM至3. OmM。在一个实施方案中，丁酸钠的浓度为0. 125mM至2.0mM。在一个实施方案中，丁酸钠的浓度为0. 125mM。在一个实施方案中，终滴度增加10-80%。在一个实施方案中，终滴度增加20-60%。在一个实施方案中，终滴度增加35-55%。在一个实施方案中，终滴度增加40%。在一个实施方案中，通过添加0. ImM至IOmM浓度的N-乙酰半胱氨酸达到改良的细胞培养物寿命。在一个实施方案中，细胞培养物寿命增加5-50 %。本发明也提供通过增加终滴度增加CHO细胞系生产IgGl抗体的生产率的细胞培养基，其包含SR_371 ；和丁酸钠。在一个实施方案中，IgGl抗体为抗-IL-18。在一个实施方案中，通过增加10-80%的终抗-IL-18滴度测量生产率增加。在一个实施方案中，通过增加20-60 %的终抗-IL-18滴度测量生产率增加。在一个实施方案中，通过增加35-55 %的终抗-IL-18滴度测量生产率增加。在一个实施方案中，通过增加40%的最终抗-IL-18滴度测量生产率增加。在一个实施方案中，所添加的丁酸钠浓度为0. 125mM至8. OmM0在一个实施方案中，所添加丁酸钠的浓度为0. 2mM至3. OmM。在一个实施方案中，所添加丁酸钠的浓度为0. 3mM至2. OmM。在一个实施方案中，所添加丁酸钠的浓度为0. 125mM。在一个实施方案中，所添加N-乙酰半胱氨酸的浓度为OmM至10mM。在一个实施方案中，所添加N-乙酰半胱氨酸的浓度为5mM至10mM。在一个实施方案中，平均终滴度增加5-50%。在一个实施方案中，平均终滴度增加15-35%。在一个实施方案中，平均终滴度增加％_35%。


图1图解描述了作为接种活细胞密度的函数的ABT-874生长滴度。第15日的滴度结果与补料活细胞密度强烈相关。对以上数据的多项式拟合(polynominal fit)表明最佳补料密度约为每毫升3. 5X IO6个细胞。过程参数为pH = 6. 9 ;T = 35°C ；DO = 40% ；4Χ 培养基中的接种比率为1 5或1 4;在特定密度下以初始体积开始补料历时10天。
具体实施例方式I.定义尽管本申请案中所使用的术语为本领域的标准术语，但本文中提供某些术语的定义以确保申请专利范围含义的清晰性和确定性。如本文所使用，术语"抗体"意指包含由四条多肽链组成的免疫球蛋白分子，其中两条重(H)链和两条轻(L)链以双硫键互联。各重链由重链可变区(本文中缩写为HCVR 或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域组成，CH1、CH2和CH3。各轻链由轻链可变区(本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。 可将VH及VL区进一步细分为高变区(称作互补决定区(CDR))，其与称作骨架区(FR)的更保守区域散布。各VH和VL由三个⑶R和四个FR组成，其按照以下次序自氨基端至羧基端排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。可使用本发明方法及组合物生产的抗体实例包括肿瘤坏死因子(TNF)-Ci抗体(也称作抗-TNF α抗体)、白介素(IL)-12抗体(也称作抗-IL-12抗体)、白介素(IL)-18抗体(也称作抗-IL18抗体)和EP0/R抗体(本文中一
21称作抗-EP0/R抗体)。可使用本发明生产TNFa抗体更详细地描述于美国专利第6090382 号、第6258562号和第6509015号中，其各自以全文引用的方式并入本文中。本发明也可用于生产抗体片段。如本文所用，术语抗体的"抗原结合部分"或“抗原结合片段”(或简单地"抗体部分")指保留了与抗原(例如hTNFa)结合的能力和特异性的抗体的一个或多个片段。已显示全长抗体片段可执行抗体的抗原结合功能。术语抗体的"抗原结合部分"涵盖的结合片段的实例包括(1汗油片段，由￥1^、￥!1、(^及011结构域组成的单价片段；(ii)F(ab' ) 2片段，包含在铰链区由双硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH及CHl结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的 Fv 片段；(ν) dAb 片段(Ward 等，(1989)Nature 341 :544-546)，其由 VH 或 VL 结构域组成；(vi)分离的互补决定区(CDR)；及(vii)双重可变结构域(DVD)抗体。此外，尽管 Fv片段的两个结构域(VL和VH)由分离基因编码，但可使用重组方法通过合成接头使它们接合，该合成接头使其能够成为单一蛋白链，其中VL与VH区配对以形成单价分子(称作单链 Fv(scFv)；参见，例如 Bird 等，(1988) Science 242 :423-426 ；及 Huston 等，(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879-5883)。该等单链抗体也涵盖于术语抗体的〃抗原结合部分"中。也涵盖其他形式的单链抗体，例如双功能抗体。双功能抗体为二价双特异性抗体，其中VH及VL结构域表达于单一多肽链上，但使用因过短而不允许两个结构域在同一个链上配对的接头，藉此迫使该等结构域与另一条链的互补结构域配对且产生两个抗原结合位点(参见例如 Holliger 等，(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :6444-6448 ；Poljak 等， (1994) Structure 2 :1121-1123)。可通过本发明方法生产的抗体部分的实例更详细地描述于美国专利第6090382号、第6258562号、第6509015号，其各自以全文引用的方式并入本文。使用本发明方法及组合物生产的抗体片段或部分也包括于本发明范畴内。如本文所用，术语"重组人抗体"意欲包括通过重组方式制备、表达、生产或分离的所有人抗体，例如使用转染至宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体；自重组、组合人类抗体库(下文进一步描述)分离的抗体；自转移了人类免疫球蛋白基因的动物(例如小鼠) 分离的抗体(参见例如iTaylor等，(1992) Nucl. Acids Res. 20 6287)；或通过涉及将人类免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他方式制备、表达、生产或分离的抗体。 该等重组人类抗体具有衍生自人类生殖系免疫球蛋白序列的可变和恒定区。然而，在某些实施方案中，体外诱变该等重组人类抗体(或当使用转移了人类Ig序列的动物时，体内体细胞诱变)且因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列为尽管衍生自人类生殖系VH和VL 序列且与其相关，但可能并非天然存在于体内人类抗体生殖系谱系中的序列。如本文所用，“经分离抗体"意指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如特异性结合至hTNFa的经分离抗体基本上不含特异性结合除hTNF α以外的抗原的抗体)。然而，特异性结合hTNFa的经分离抗体可与其他抗原(例如来自其他物种的 TNFa分子)具有交叉反应性。此外，经分离抗体可基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。术语"基础培养基"指能够支撑细胞生长的任何培养基。基础培养基供应标准无机盐，例如锌、铁、镁、钙和钾，以及痕量元素、维生素、能量来源、缓冲剂系统和必需氨基酸。基础培养基的实例包括但不限于达氏经修饰伊氏培养基(Dulbecco' s Modified Eagle' s Medium) (DMEM)、DME/F12、极限必需培养基(MEM)、基础培养基 Eagle (BME) ,RPMI1640、F-10、F-12、α -极限必需培养基(α -MEM)、Glasgow氏极限必需培养基(G-MEM)、PF CHO(SAFC Biosciences)和Iscove氏经修饰杜氏培养基。如本文所使用，术语"经修饰基础培养基"指排除、减低或增加至少一种标准成份、组份或养分(即本领域已知的经典配方基础培养基中发现的至少一种成份、组份或养分)的基础培养基。如"经修饰基础培养基"的上下文中所用的术语"经修饰"也可指基础培养基内个别组份之间比例的变化。在本发明的优选实施方案中，经修饰基础培养基排除至少一种以下组份碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸钠(磷酸二氢钠及/或磷酸氢二钠)、渗透压调节剂、表面活性剂和葡萄糖，例如单糖葡萄糖。如本文所使用，术语"细胞培养基"、“培养基"和"培养基配方"指使细胞在多细胞生物体或组织外部的人造体外环境中维持、生长、繁殖或扩增的营养溶液。可优化细胞培养基以用于特定细胞培养用途，该细胞培养基包括，例如，经配制以促进细胞生长的细胞培养生长培养基或经配制以促进重组蛋白生产的细胞培养生产培养基。术语养分、成份和组份可于本文中互换使用，指构成细胞培养基的组成成分。如本文所使用，术语"细胞培养生产培养基"或"生产培养基"指经设计用于细胞培养物生产期的细胞培养基。在优选的实施方案中，生产培养基经设计用于生产期中的重组蛋白表达。本文(包括实施例部分的表2-7)提供生产培养基的实例。如本文所使用，术语"分批补料细胞培养"和"分批补料培养"指起初向培养容器中供应细胞(优选哺乳动物动物)和培养基并在培养期间连续或以离散增量向培养物中补入附加培养养分，在培养终止前具有或不具有周期细胞和/或产物收集的细胞培养。“分批补料方法"指向分批补料细胞培养物中供应附加养分的方法。举例而言， 分批补料方法可包含根据预定补料程序在给定时段内添加补充培养基。如本文所使用，术语"补料"指接种后向培养物中进行的任何物质的任何添加。 补料可为一或多次添加。如本文所使用，术语"补料溶液"、“补料培养基"和"补入培养基"指含有在接种后某时起始向培养物中添加的一种或多种养分的培养基。在一个实施方案中，补料溶液为包含下列各物质的组合补料基础培养基和至少一种水解产物，例如大豆源水解产物、 酵母源水解产物或两种类型水解产物的组合。在本发明的另一个实施方案中，补料溶液可仅包括基础培养基，例如浓缩基础培养基，或可仅包括水解产物或浓缩水解产物。如本文所使用，术语"反馈控制系统"指监控给定参数的方法，藉此添加附加试剂或进行细胞培养物的环境修饰以满足所需参数设定点。在一个实施方案中，所给定参数为哺乳动物细胞培养物的葡萄糖含量，藉此使用葡萄糖含量来确定应于何时将补料溶液 (例如组合补料溶液)添加至细胞培养物中。可使用反馈控制系统维持使哺乳动物细胞培养物中蛋白生产最佳化所需要的营养组份。如本文所使用，术语"补料曲线"指以补料溶液(例如组合补料溶液)补充哺乳动物细胞培养物的时间表。优选使用反馈控制系统产生补料曲线。可使用"基因工程"方法(例如用重组病毒进行病毒感染、转染、转化或电穿孔)使细胞经"基因工程设计"以在将允许表达多肽的重组核酸序列导入细胞时表达特定多肽或蛋白。参见，例如 Kaufman 等，(1990)，Meth. Enzymol. 185 :487-511 ；Current Protocols in Molecular Biology， Ausubel(Wiley&Sons， New York, 1988,5.^季更新)。用于表达相关蛋白的基因工程细胞和/或细胞系的方法和载体为本领域技术人员熟知。基因工程技术包括但不限于表达载体、靶向同源重组和基因活化(参见，例如 Chappel，美国专利第5272071号)以及通过基因工程转录因子进行的转录活化(参见，例如 Segal 等，1999，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (6) :2758-63)。多肽任选在异源控制元件 (例如天然状态不引导该多肽生产的启动子)控制下表达。举例而言，启动子可为引导哺乳动物多肽表达的强病毒启动子(例如CMV，SV40)。宿主细胞可或不可正常生产该多肽。举例而言，宿主细胞可为经基因工程设计以生产人类多肽的CHO细胞，意指已将编码人类多肽的核酸导入CHO细胞中。或者，宿主细胞可为经基因工程设计以生产水平增加的通常仅以极低含量存在的人类多肽(例如通过用强病毒启动子替代内源性启动子)的人类细胞。如本文所使用，“生长期"指经培养细胞快速分裂并且数量增加的时段。在生长期中，一般可在培养基中和经设计以使细胞增殖最大化的条件下培养细胞。术语"水解产物"包括任何酶消化物，尤其是通过用至少一种能够使物质组份分解为简单形式(例如分解为包含单糖或双糖和/或单肽、二肽或三肽的制剂)的酶处理待萃取物质(例如植物组份或酵母细胞)而制备的特定类型的萃取物。“水解产物"可进一步被酶消化，例如木瓜酶，和/或由自体分解、热解和/或胞浆溶解形成。在本发明的优选实施方案中，水解产物并非由动物来源制备，即非动物源。优选的非动物源水解产物实例包括植物源水解产物，例如大豆源水解产物，及既非衍生自植物也非衍生自动物来源的水解产物，例如酵母源水解产物。术语"水解产物富集溶液"和"水解产物富集培养基"指含有水解产物或水解产物组合(即自不同来源萃取的水解产物)作为添加至细胞培养物中的主要成份的培养基。例如，可将水解产物富集溶液添加至细胞培养物中以增强蛋白生产。类似地，术语"基础富集溶液"和"基础富集培养基"指含有基础培养基(或基础培养基组合)作为主要成份的培养基。在一个实施方案中，将水解产物富集溶液或基础富集溶液或两种富集溶液的组合添加至细胞培养物中以增加细胞培养物在蛋白生产中的生产率。如果在含有附加试剂或改变的蛋白生产工艺参数的培养物中生产的多肽量超过在不含有附加试剂或改变的蛋白生产工艺参数的相同培养物中生产的多肽量，则通过添加附加试剂或改变蛋白生产工艺的参数"增加"了蛋白生产。改变蛋白生产工艺的实例包括但不限于添加培养基添加剂，增加补充培养基的量，变化培养温度及细胞培养的氧浓度。可使用补充溶液(例如补料溶液)向细胞培养物提供附加试剂。术语"成份"指任何可用于细胞培养基中以维持或促进细胞增殖增长的化合物 (无论其为化学来源或生物来源)。术语"组份"、“养分"及"成份"可交替使用且均意指该类化合物。用于细胞培养基的典型成份包括氨基酸、盐、金属、糖、脂质、核酸、激素、 维生素、脂肪酸、蛋白及其类似物。促进或维持细胞离体培养的其他成份可由本领域技术人员在本发明范畴内根据特定需要加以选择。如本文所使用，术语"接种"指向培养基中添加细胞以起始培养。“生产期"指细胞生产最大量的重组多肽或蛋白的时段。生产期的特征在于细胞分裂少于生长期中的细胞分裂，且也包括使用经设计以使多肽生产最大化的培养基和培养条件。
“重组多肽"或"重组蛋白"为由基因工程方法生产的多肽或蛋白。在优选的实施方案中，通过在细胞培养物中培养表达该类蛋白的细胞获得重组蛋白。“过渡期"意指"生长期"与"生产期"之间的细胞培养时段。在过渡期中，可将培养基和环境条件由经设计以使增殖最大化的培养基和条件转变为经设计以使多肽生产最大化的培养基和条件。本发明提供通过哺乳动物(例如中国仓鼠卵巢(CHO))细胞培养物生产蛋白(优选重组蛋白，例如抗体)的新颖组合物和方法。本文所述的细胞培养基及方法已用于重组蛋白生产，尤其是重组(完全人类、人源化或嵌合)单克隆抗体的生产。培养基和方法已经多种抗体产品修饰以并入可增加哺乳动物(例如CH0)细胞的生长和生产率的各种改良和进步。下文详细提供本发明的改良组合物和方法的各方面。II.所关注蛋白一般而言，本发明方法和组合物适用于生产重组蛋白。重组蛋白为通过基因工程方法生产的蛋白。根据本发明方法和组合物生产的尤其优选蛋白为以蛋白为主的治疗剂， 也称作生物制品。优选地，该蛋白作为细胞外产物分泌。可使用本发明方法和组合物生产的蛋白包括但不限于抗体或其片段。可通过本领域中已知的许多技术来操做编码免疫球蛋白分子的DNA以产生能够编码重组蛋白(例如单链抗体、亲和力增强的抗体或其他以抗体为主的多肽)的DNA(参见，例如Larrick等， 1989, Biotechnology 7 :934-938 ；Reichmann 等，1988, Nature 332 :323-327 ；Roberts 等， 1987，Nature 328 :731-734 ；Verhoeyen 等，1988，Science239 :1534-1536 ；Chaudhary 等， 1989, Nature 339 :394_397，均以参考形式并于本文)。生产完全人类抗体(例如使用转殖基因动物制备，且任选在活体外进一步修饰者)以及人源化抗体的重组细胞也可用于本发明。术语人源化抗体也涵盖单链抗体。参见，例如Cabilly等，美国专利第4816567 号；Cabilly等，欧洲专利第0125023B1号；Boss等，美国专利第4816397号；Boss等，欧洲专利第 0120694B1 号；Neuberger, M. S.等，WO 86/01533 ；Neuberger, M. S.等，欧洲专利第0194276B1号；Winter，美国专利第5225539号；Winter,欧洲专利第0239400B1号； Queen等，欧洲专利第0451216B1号；及Padlan，Ε. Α.等，EP 0519596Α1，均以参考形式并于本文。举例而言，本发明可用于生产免疫特异性辨识特异细胞靶标的人类和/或人源化抗体，该类特异细胞靶标例如任一上述蛋白、人类EGF受体、her-2/neu抗原、CEA抗原、 前列腺特异性膜抗原(PSMA)、CD5、CDlla、CD18、NGF、CD20、CD45、CD52、Ep-cam、其他癌细胞表面分子、TNFa、TGF-bl、VEGF、其他细胞因子、α4β7整合素(integrin)、IgE、病毒蛋白(例如巨细胞病毒)。可使用本发明组合物和方法生产的抗体的实例包括但不限于抗-TNF α抗体、抗-IL-12抗体、抗-IL-18抗体和抗-EPO受体(EP0-I )抗体。在一个实施方案中，抗-TNFa抗体为完全人类抗-TNFa抗体，例如阿达木单抗/D2E7 (参见美国专利第6090382号，其以参考的方式并于本文；Humira ; Abbott Laboratories)。在一个实施方案中，抗-IL-12抗体为完全人类抗-IL-12抗体，例如ABT-874 (Abbott Laboratories ； 参见美国专利第69141 号，其以参考方式并于本文)。在一个实施方案中，抗-IL-18抗体为完全人类-IL-18抗体(例如ABT-325)，例如也可参见US 20050147610A1中描述的抗体。在一个实施方案中，抗_EP0/R(亦称作ABT-007)抗体为完全人类抗体，如以引用的方式并入本文的美国专利公开案第US 20060018902A1号中所描述者。
可使用本发明方法和组合物生产的蛋白类型的另一实例包括融合蛋白。融合蛋白为融合至异源蛋白或肽的蛋白或结构域或蛋白(例如可溶性胞外结构域)。该类融合蛋白的实例包括以含有免疫球蛋白分子部分的融合物表达的蛋白；以含有拉链部分的融合蛋白表达的蛋白；及新颖多功能蛋白，例如细胞因子和生长因子融合蛋白(即GM-CSF及IL-3、 MGF及IL-3)。WO 93/08207及WO 96/40918描述了被称作CD40L的分子各种可溶性寡聚物形式的制备，分别包括免疫球蛋白融合蛋白和拉链融合蛋白；其中所论述的技术可应用于其他蛋白。另一种融合蛋白为重组TNFR:Fc，也称作依那西普(entanerc印t)。依那西普 (或Enbrel ;Amgen/Wyeth)为p75TNF α受体胞外部分的两个分子的二聚体，各分子由融合至人类IgGl的232氨基酸Fc部分的235氨基酸TNFR衍生的多肽组成。实际上，任何分子均可表现为融合蛋白，包括但不限于细胞受体分子的胞外结构域、酶、激素、细胞激素、免疫球蛋白分子部分、拉链结构域和表位。III.本发明的细胞培养基本发明提供用于生产或表达重组蛋白(例如抗体)的哺乳动物细胞培养的细胞培养基。本文所述各种细胞培养基可独立或共同地用于改良细胞培养，包括增加蛋白生产和延长细胞寿命。在优选的实施方案中，本发明的细胞培养基为无血清的，意指培养基不含血清 (例如胎牛血清(FBS)、马血清、山羊血清或本领域技术人员已知的其它衍生自动物的血清)。在第一方面，本发明提供包括全部或部分经修饰基础培养基的哺乳动物细胞培养基。经修饰基本细胞培养基可衍生自本领域已知的标准基础细胞培养基。适当的基础培养基包括但不限于杜氏经修饰伊氏培养基(DMEM)、DME/F12、极限必需培养基 (MEM)、基础培养基 Eagle (BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、α -极限必需培养基(α -MEM)、 Glasgow氏极限必需培养基(G-MEM)、PF CHO及Iscove氏经修饰杜氏培养基。可用于本发明的基础培养基的其他实例包括BME基础培养基(Gibco-Invitrogen ；也可参见 Eagle, H(1965)Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 89, 36)；杜氏经修饰 Eagle 培养基(DMEM，粉末) (Gibco-Invitrogen(#31600)；也可参见 Dulbecco and Freeman(1959)Virology 8,396; Smith 等(1960)Virology 12,185. Tissue Culture Standards Commitee, In Vitro 6: 2,93) ；CMRL 1066 培养基(Gibco-Invitrogen (#11530)；也可参见 Parker R. C.等(1957) Special Publications, N. Y. Academy of Sciences,5,303)。可修饰基础培养基以移除存在于标准基础培养基中的特定非营养组份，例如各种无机和有机缓冲剂、表面活性剂和氯化钠。如本文所述，从基础细胞培养基移除该类组份可使剩余营养组份的浓度增加并改良总细胞生长和蛋白表达。此外，根据细胞培养条件的要求可将省略的组份添加回含有经修饰基础细胞培养基的细胞培养基中。如下所述，已发现从基础细胞培养基分离特定成份(即添加经修饰基础细胞培养基作为细胞培养基中的成份)，且随后将成份添加回细胞培养基中作为分离成份会提供对细胞培养物生长和蛋白生产有利的特性。本发明的经修饰基础培养基排除任何(或所有)以下成份碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂和单糖葡萄糖。这些成份常见于市售基础细胞培养基中。
可通过市售培养基服务(例如SAFC Pharma )完成组份(例如碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂和/或单糖葡萄糖)的排除。本领域技术人员将了解在一个实施方案中可使用市售细胞培养基服务(即定制培养基服务) 获得经修饰基础培养基。定制培养基服务的实例可由以下公司提供例如，SAFC(原JRH Bioscience)、InvitrOgen 、Atlanta Biologicals 及 Lonza。或者，本领域普通技术人员可根据制造基础细胞培养基的标准方法制备本发明经修饰基础细胞培养基，其中省略了本文所述的特定成份(参见例如FreshneH2005) Culture of Animal Cells :A Manual of Basic Technique ；BD Bionutrients Technical Manual, (2006) ,HH Jenkins (1999), Animal Cell Biotechnology,Methods and Protocols, Humana Press ；Doyle and Griffiths 编辑，(1997)Essential Techniques Mammalian Cell Culture, John Wiley and Sons ；Butler 编辑(1991)Mammalian Cell Biotechnology :A Practical ApproachOxford University Press ；Darling 及 Morgan (1994) Animal Cells :Culture and Media, John Wiley and Sons ;Freshney 编辑 (1992), Animal Cell Culture :A Practical Approach (第 2 版)，Oxford University Press ；Pollard 及 Walker(1997), Basic Cell Culture Protocols (第 2 片反)，Humana Press, (Part of the Methods in Molecular Biology series，第 75 卷)，其各以参考形式并于本文)。在一个实施方案中，本发明的细胞培养基含有经修饰的基础细胞培养基；铁来源 (优选为无机的，例如柠檬酸铁)；重组生长因子；缓冲剂；表面活性剂；渗透压调节剂；能量来源；及至少两种不同的非动物水解产物。此外，经修饰的基础细胞培养基任选可含有氨基酸、维生素或氨基酸与维生素的组合。如本文所使用，术语"铁"意指用以补充培养基的衍生自非动物的铁来源。细胞培养基中的铁来源优选为无机的。铁来源优选为无机的且包括(例如)铁盐和亚铁盐，例如柠檬酸铁或硫酸亚铁。优选螯合盐，例如柠檬酸铁和柠檬酸铁铵。然而，也可使用并非自动物来源分离的其他铁来源，例如提供等量铁的化学铁螯合剂或重组蛋白铁载剂。可使用的铁螯合化合物包括但不限于铁螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-双(β-胺基乙醚)-Ν，Ν，Ν' ,N'-四乙酸(EGTA)、甲磺酸去铁胺、二巯基丙醇、二乙撑三胺五乙酸(DPTA) 和反-1，2-二胺基环己烷-Ν，Ν，Ν' ,N'-四乙酸(⑶ΤΑ)以及柠檬酸铁螯合剂和硫酸亚铁螯合剂。尤其优选的铁来源为柠檬酸铁，其优选以0. I-ImM浓度存在于终体积细胞培养基中。在另一个实施方案中，柠檬酸铁的浓度为100-150mg/L，例如12ang/L。上述mM(例如 0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9 和 1. 0)和 mg/L(例如 100、110、120、130、140 和 150)的中间数也可为本发明的一部分。可包括于细胞培养基中的生长因子的非限制性实例为胰岛素或其重组类似物、 IGF-I及胰岛素与IGF-I的组合。尤其优选的重组生长因子为胰岛素或其重组类似物，其优选以约-g/L至13mg/L的浓度存在于终体积细胞培养基中。上述胰岛素浓度的中间数也可为本发明的一部分，例如 4,4. 5、5、5· 5、6、6· 5、7、7· 5、8、8. 5、9、9· 5、10、10· 5、11、11· 5、 12,12. 5 和 13。细胞培养基也可包括缓冲剂。在一个优选的实施方案中，缓冲剂自经修饰的基本细胞培养基中排除而作为分离组份添加至细胞培养基中(也向其中添加经修饰的基础细胞培养基)。用于细胞培养基中的缓冲剂为本领域已知。细胞培养基中可包括的缓冲剂的非限制性实例为磷酸盐缓冲剂、HEPES和碳酸氢钠。在一个实施方案中，碳酸氢钠作为缓冲剂添加至细胞培养基中，终浓度约0. l_3g/L。在一个实施方案中，碳酸氢钠作为缓冲剂添加至细胞培养基中，终浓度约1. 6g/L。在一个实施方案中，HEPES作为缓冲剂添加至细胞培养基中，终浓度0. l-3g/L。在另一个实施方案中，HEPES作为缓冲剂添加至细胞培养基中，终浓度1.8g/L。在一个实施方案中，将磷酸盐缓冲剂(例如磷酸二氢钠及磷酸氢二钠)添加至细胞培养基中，其终浓度介于0.01与0.5g/L之间。上述浓度的中间数也为本发明的一部分，例如碳酸氢钠或 HEPES 的浓度为 0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9,1. 0,1. 1、 1. 2,1. 3,1. 4,1. 5,1. 6,2. 7,1. 8,1. 9,2. 0,2. 1,2. 2,2. 3,2. 4,2. 5,2. 6,2. 7,2. 8,2. 9 和 3. 0 或磷酸盐缓冲剂的浓度为 0. 01,0. 02,0. 03,0. 04,0. 05,0. 06,0. 07,0. 08,0. 09,0. 1,0. 12、 0. 14,0. 16,0. 18,0. 2,0. 22,0. 24,0. 26,0. 28,0. 3,0. 32,0. 36,0. 38,0. 4,0. 42,0. 44,0. 46、 0. 48 和 0. 5g/L。包括缓冲剂以帮助将细胞培养基维持在期望的pH。在一个实施方案中，细胞培养基的PH在6. 0至8. 0、6. 5至7. 5、及7. 1至7. 2之范围内。这些pH值中间数(例如6. 1、6. 2、 6. 3,6. 4,6. 5,6. 6,6. 7,6. 8,6. 9,7. 0,7. 1,7. 2,7. 3,7. 4,7. 5,7. 6,7. 7,7. 8,7. 9 及 8. 0)以及本文所述的所有其他数值也为本发明的一部分。使用任何上述值的组合作为上限和/或下限值的范围也包括于本发明范畴内。细胞培养基也可包括渗透压调节剂，例如NaCl。在一个实施方案中，将NaCl添加至细胞培养基中，终浓度在约1.0至6.5g/L之间。在一个实施方案中，细胞培养基的渗透压在260至450m0smO/kg的范围内。在一个实施方案中，细胞培养基的渗透压在320至 450m0smo/kg的范围内。所述NaCl浓度和mOsmo/kg值的中间数(例如1、1. 5、2、2. 5、3、 3. 5、4、4· 5、5、5· 5、6 和 6. 5 的 NaCl 浓度和 260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、 360、370、380、390、400、410、420、430、440、450 的mOsmo/kg范围)以及本文所述所有其他数值也为本发明的一部分。使用任何上述值的组合作为上限和/或下限值的范围也包括于本发明范畴内。本发明的细胞培养基中也可添加能量来源。优选地，能量来源为单糖。可用于细胞培养基中的单糖实例包括葡萄糖(例如D-葡萄糖)、麦芽糖、甘露糖、半乳糖和果糖。在一个实施方案中，将葡萄糖添加至细胞培养基中，最终浓度约3. 5-7. Og/L。在一个实施方案中，将葡萄糖添加至细胞培养基中，终浓度不大于7. 0g/L。在一个实施方案中，将葡萄糖添加至细胞培养基中，终浓度约7. 0g/L。上述葡萄糖浓度的中间数(例如3.5、3.6、3.7、3.8、 3. 9,4. 0,4. 2,4. 4,4. 6,4. 8,5. 2,5. 8、6、6. 2,6. 4,6. 6,6. 8 和 7)以及本文所述所有其他数值也为本发明的一部分。使用任何上述值的组合作为上限和/或下限值的范围也包括于本发明范畴内。本发明细胞培养基的一个重要成份为添加的水解产物。本发明的细胞培养基可包括源自单一来源(例如酵母或大豆)的水解产物，或可包括水解产物的组合(例如酵母与和豆源水解产物)。优选地，用于本发明细胞培养基的水解产物为非动物源的。非动物源水解产物的实例包括植物源水解产物和非植物源水解产物，例如酵母源水解产物、Tryprone, 酪蛋白水解产物、酵母萃取物、或经木瓜酶消化的大豆蛋白胨。用于本发明培养基的水解产物可商业购买，包括例如来自例如 Quest International, Norwich, N. Y. ，OrganoTechnie,S. A. France, Deutsche Hefewerke GmbH, Germany,或 DMV Intl. Delhi, N. Y.来源的 HyPep 1510. RTM.、Hy-SoyRTM.、Hy-Yeast 412. RTM.和 Hi_Yeast444. RTM.。酵母萃取物和大豆水解产物的来源公开于WO 98/15614、WO 00/03000、WO 01/23527和美国专利第5741705 号中。也可用于本发明的酵母源水解产物的实例包括TC酵母粉(BD Diagnostic)和酵母粉UF(SAFC Biosciences)，而植物源水解产物的实例包括大豆水解产物UF(SAFC Biosciences)和HyQ 大豆水解产物(HyClone Media)。在一个实施方案中，本发明的细胞培养基进一步包括谷氨酰胺，例如L-谷氨酰胺。L-谷氨酰胺的适当来源可为各种商业来源，例如Gibco (目录号25030-081)。本发明的细胞培养基(包括下文实例部分描述的细胞培养基)可任选包括甲氨喋呤。在用于培养CHO细胞的细胞培养基中，甲氨喋呤用量的实例包括约IOOnM至5000nM甲氨喋呤。上述甲氨喋呤摩尔浓度的中间数(例如100、200、300、400、500、600、700、800、900、 1000、1200、1400、1600、1800、2000、2400、2600、2800、3000、3200、3400、3600、3800、4000、 4200、4400、4600、4800和500nM)以及其他中间数也为本发明的一部分。使用任何上述值的组合作为上限和/或下限值的范围也包括于本发明范畴内。在大规模生物反应器中，CHO细胞特别易受容器内气体喷射和叶轮混合所产生的剪切力的影响。因此，本发明的细胞培养基也可任选包括细胞保护剂。如本文所使用，术语"细胞保护剂"意指保护真核细胞免受损害的物质。例如，该损害可由剪切力或生物反应容器中的气泡喷射效应引起。为使细胞损害的发生降至最低，培养基最好含有细胞保护剂，例如甲基纤维素、聚乙二醇、聚乙烯醇或Pluronic多元醇。其中，优选Pluronic. RTM. (多元醇，BASF Wyandotte Corp.)多元醇F68，因为其不像聚乙烯醇，其为无毒物质且不像聚乙二醇，其并不干扰下游纯化。本发明的细胞培养基也可包括非铁金属离子。非铁金属离子的实例包括但不限于氯化物和硫酸盐、钾、镁、铜、硒、锌、镍、锰、锡、镉、钼酸盐、钒酸盐和硅酸盐。本发明的细胞培养基也可包括维生素和酶辅因子。该类维生素和酶辅因子的实例包括但不限于PABA(对氨基苯甲酸)、维生素K(生物素)、维生素Β5 (D-泛酸钙)、叶酸、 内消旋肌醇、烟酰胺(菸酸酰胺)、维生素Β6(盐酸吡多辛(PyrdoxineHCl))(及盐酸吡哆醛(PyrodoxalHCl))、维生素B2(核黄素)、维生素Bl (硫胺素)和维生素B12(氰钴胺素 (cyanocobalamin))。或者，可向培养基中添加维生素C (L_抗坏血酸)。也可添加氯化胆碱，通常认为其为维生素但也可作为脂质因子。此外，本发明的细胞培养基也可包括脂质样因子。脂质因子的实例包括氯化胆碱和磷脂酰胆碱。也可包括脂质生产助剂，例如醇胺(例如乙醇胺)。在本发明的方法和组合物中，优选在无血清培养基中培养细胞。应用于培养基的术语"无血清"包括不含有血清(例如胎牛血清)的任何哺乳动物细胞培养基。本发明范畴内也包括本文所述的任何改良细胞培养基中的哺乳动物细胞，例如 CHO细胞。在本发明的一方面提供为生产特定抗体而优化的细胞培养基配方。优选配方的实例包括用于表达下列抗体的CHO细胞生长或蛋白生产的细胞培养基抗-TNFa抗体、 抗-IL-12抗体、抗-IL-18抗体和抗-EPO受体(EPO-R)抗体。本发明中包括表达抗-TNFa抗体(包括完全人类抗-TNF α抗体)的哺乳动物细
29胞(例如CHO细胞)的细胞培养基。在优选的实施方案中，完全人类抗-TNF α抗体为阿达木单抗(也称作D2E7及Humira : Abbott Laboratories)。阿达木单抗(包括核酸和氨基酸序列)的特征描述于美国专利第6090382中，其以参考形式并于本文。可通过在细胞培养生长培养基中培养包含编码蛋白(例如阿达木单抗)的核酸的哺乳动物细胞(例如CHO 细胞)，将细胞培养物转移至细胞培养生产培养基中且将蛋白从细胞培养生产培养基中分离生产阿达木单抗。在一个实施方案中，本发明提供为包含编码阿达木单抗的核酸的CHO细胞而优化的细胞培养生长培养基。为表达阿达木单抗的CHO细胞而优化的无血清细胞培养生长培养基的配方包括基础培养基；柠檬酸铁(例如约8-12ml/kg，约10. 0ml/kg或12aiig/L)；重组人胰岛素(例如约2-6mg/kg，约4. Omg/kg)；无水葡萄糖(例如约2_5mg/kg，约3. 5g/kg)； L-谷氨酰胺(例如约0. 29g/kg)；碳酸氢钠(例如约1. 6g/kg) ；NaH2PO4 ·H2O (例如约0. 03g/ kg) ；Na2HPO4 · 7H20(例如约0. 43至0. 44g/kg)；及酵母源水解产物(例如约2. 0g/kg)。为表达阿达木单抗的CHO细胞而优化的无血清细胞培养生长培养基的另一实例包括以下成份排除下列组份的经修饰基础培养基碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂和单糖葡萄糖；柠檬酸铁(例如约10. 0ml/kg或122. 45mg/kg)；重组人胰岛素(例如约3. 8至3. 9mL/kg或7. 8mg/kg)；无水葡萄糖(例如约7. 0g/kg) ；L-谷氨酰胺(例如约0. 8至0. 9g/kg)；碳酸氢钠(例如约1. 6g/kg) ；HEPES (例如约1. 8g/kg)； NaCl (例如约 2. 6 至 2. 7g/kg) ；Pluronic F-68 (例如约 1. 0g/kg) ；NaH2PO4 · H2O(例如约 0. 03 至 0. 04g/kg) ；Na2HPO4 ·7Η20 (例如约 0. 43 至 0. 44g/kg) ；L-天冬酰胺一水合物(例如约0.45g/kg)；酵母源水解产物(例如约4. 0g/kg)；及植物源水解产物(例如约2. 6g/kg)。 表达阿达木单抗的细胞培养生长培养基可进一步包括甲氨喋呤，例如约2. 50mL/kg。在一个实施方案中，本发明提供为表达抗体(包括，例如，人类抗-TNF α抗体(例如阿达木单抗)或红细胞生成素受体(EP0/R)抗体)的CHO细胞而优化的细胞培养生产培养基。抗-EP0/R抗体的实例描述于美国专利公开案第20040071694号中，其以参考形式并于本文。为表达抗体(例如阿达木单抗或抗-EP0/R抗体)的CHO细胞而优化的无血清细胞培养生产培养基配方包括排除下列组份的经修饰基础培养基碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂和单糖葡萄糖；柠檬酸铁(例如约 10. 0ml/kg或122. 45mg/L)；重组人胰岛素(例如约6. 0mL/kg或12mg/kg)；无水葡萄糖(例如约7. 0g/kg) ；L-谷氨酰胺(例如约0. 58至0. 59g/kg)；碳酸氢钠(例如约1. 6g/kg)； HEPES (例如约 1. 8g/kg) ；NaCl (例如约 2. 4至 2. 5g/kg) ；Pluronic F_68(例如约 1. 0g/kg)； NaH2PO4 ·H2O (例如约 0. 03 至 0. 04g/kg) ；Na2HPO4 ·7Η20(例如约 0. 43 至 0. 44g/kg)；酵母源水解产物(例如约10. 7g/kg)；及植物源水解产物(例如约6. 9至7. 0g/kg)。在一个实施方案中，细胞培养生产培养基具有介于约7. 1至7. 2范围内的pH值及介于373至403m0Sm/ kg范围内的渗透压。本发明的另一方面涉及使由CHO细胞生产的抗-白介素-12 (IL-12)抗体(例如完全人类IL-12抗体)的生产最优化的细胞培养基。在优选的实施方案中，完全人类抗-IL12 抗体为ABT-874。ABT-874(包括核酸和氨基酸序列)的特点描述于美国专利第69141 号中，其以参考文献的形式并于本文。在一个实施方案中，为表达ABT-874的CHO细胞生长而优化的无血清细胞培养生长培养基包括下列各物质排除下列组份的经修饰基础培养基碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂和单糖葡萄糖；柠檬酸铁(例如约10ml/kg 或122. 45mg/L)；重组人胰岛素(例如约3. 8至3. 9mL/kg或7. 8mg/kg)；无水葡萄糖(例如约7. Og/kg) ；L-谷氨酰胺(例如约0. 87至0. 88g/kg) ；L-天冬酰胺一水合物(例如约 0. 45g/kg)；碳酸氢钠(例如约 1. 6g/kg) ；HEPES (例如约 1. 8g/kg) ；NaCl (例如约 2. 67 至 2. 68g/kg)；约 PluronicF-68 (例如 1. Og/kg) ；NaH2PO4 · H2O (例如约 0. 03 至 0. 04g/kg)； Na2HPO4 · 7H20(例如约0. 43至0. 44g/kg)；酵母源水解产物(例如约4. Og/kg)；及植物源水解产物(例如约2. 6g/kg)。在一个实施方案中，用于表达ABT-874的无血清细胞培养生产培养基包括下列各物维生素含量降低且排除下列组份的经修饰基础培养基碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂和单糖葡萄糖；柠檬酸铁(例如约10ml/kg或 122. 45mg/L)；重组人胰岛素(例如约6. 5mL/kg或13mg/kg)；无水葡萄糖(例如约7. Og/ kg) ；L-谷氨酰胺(例如约0. 58至0. 59g/kg)；碳酸氢钠(例如约1. 6g/kg) ；HEPES (例如约 1. 8g/kg) ；NaCl (例如约 2. 45g/kg) ；PluronicF-68 (例如约 1. Og/kg) ；NaH2PO4 · H2O (例如约0. 03至0. 04g/kg) ；Na2HPO4 · 7H20(例如约0. 43至0. 44g/kg)；酵母源水解产物(例如约10. 7g/kg)；及植物源水解产物(例如约6. 9至7. Og/kg)。在一个实施方案中，本发明提供表达抗体(例如抗-IL12及抗-EP0/R抗体)的 CHO细胞的无血清细胞培养生长培养基，其包含下列各物质基础培养基；柠檬酸铁(例如约10ml/kg或122. 45mg/L)；重组人胰岛素(例如约4mg/kg)；无水葡萄糖(例如约1. 5g/ kg) ；L-谷氨酰胺(例如约0. 29至0. 30g/kg)；碳酸氢钠(例如约1. 6g/kg)；及酵母源水解产物(例如至少约2g/kg)。在一个实施方案中，表达抗体(例如抗-IL-12及抗-EP0/R抗体)的CHO细胞的细胞培养生长培养基具有约7. 10至7. 30的pH值及约300至340m0smO/ kg的渗透压。细胞培养基也可含有酵母源水解产物(例如至少约8g/kg)。本发明的另一方面涉及为由CHO细胞生产抗白介素18(IL_18)抗体(例如完全人类IL-18抗体)的生产而优化的细胞培养基。可使用本发明方法和组合物生产的完全人类 IL-18抗体的实例描述于PCT公开案WO 01/058956中，其以参考形式并于本文。在一个实施方案中，为CHO细胞中IL-18抗体生产而优化的细胞培养生长培养基包括下列成份排除下列组份的经修饰基础培养基碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、 磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂的单糖葡萄糖；柠檬酸铁(例如约10ml/kg或 122. 45mg/L)；重组人胰岛素(例如约3. 8至3. 9mL/kg或7. 8mg/kg)；无水葡萄糖(例如约7. Og/kg) ；L-谷氨酰胺(例如约0. 87至0. 88g/kg) ；L-天冬酰胺一水合物(例如约045g/kg)；碳酸氢钠(例如约1. 6g/kg) ；HEPES (例如约1. 8g/kg) ；NaCl (例如约 2. 67g/kg) ；Pluronic F_68(例如约 1. Og/kg) ；NaH2PO4 · H20(例如约 0. 03 至 0. 04g/kg)； Na2HPO4 · 7H20(例如约0. 43至0. 44g/kg)；酵母源水解产物(例如约4. Og/kg)；及植物源水解产物(例如约2. 6g/kg)。用于表达完全人类IL-18抗体的细胞生长的细胞培养基可具有7. 10至7. 20的pH值及373至403m0smO/kg的渗透压。上述数值(例如所述胰岛素、pH 或渗透压值)的中间数也为本发明的一部分。为CHO细胞中IL-18抗体生产而优化的细胞培养生产培养基实例包括下列成份经修饰的基础培养基，其经修饰以去除下列组份碳酸氢钠、HEPES缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂和单糖葡萄糖；柠檬酸铁(例如约10ml/kg或 122. 45mg/L)；重组人胰岛素(例如约6. OmL/kg或12mg/kg)；无水葡萄糖(例如约7. Og/ kg) ；L-谷氨酰胺(例如约0. 58至0. 59g/kg)；碳酸氢钠(例如约1. 6g/kg) ；HEPES (例如约 1. 8g/kg) ；NaCl (例如约 2. 45g/kg) ；PluronicF-68 (例如约 1. Og/kg) ；NaH2PO4 · H2O (例如约0. 03至0. 04g/kg) ；Na2HPO4 ·7Η20(例如约0. 43至0. 44g/kg)；酵母源水解产物(例如约10. 7g/kg)；及植物源水解产物(例如约6. 9至7. Og/kg)。用于生产完全人类抗-IL-18 抗体的细胞培养生产培养基的另一实例包括排除下列组份的经修饰基础培养基碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂和单糖葡萄糖；柠檬酸铁 (例如约10ml/kg或122. 45mg/L)；重组人胰岛素(例如约6. 5mL/kg或13mg/kg)；无水葡萄糖(例如约7. Og/kg) ；L-谷氨酰胺(例如约0. 58至0. 59g/kg)；碳酸氢钠(例如约1. 6g/ kg) ；HEPES (例如约 1. 8g/kg) ；NaCl (例如约 2. 45g/kg) ；Pluronic F-68 (例如约 1. Og/kg)； NaH2PO4 · H2O (例如约 0. 03 至 0. 04g/kg) ；Na2HPO4 · 7H20(例如约 0. 43 至 0. 44g/kg)；酵母源水解产物(例如约14. 2至14. 3g/kg)；及植物源水解产物(例如约9. 2至9. 3g/kg)。 生产完全人类IL-18抗体的CHO细胞的细胞培养基可具有7. 10至7. 20的pH值及373至 403m0smO/kg的渗透压。上述数值(例如所述胰岛素、pH或渗透压值)的中间数也为本发明的一部分。除实施例部分所述的示例性培养基以外，下文也描述了与改良抗体生产分批补料方法和补充培养基相关的本发明范畴内的培养基的其它实例。本发明培养基可用于通过使培养基或其组份与所有或部分细胞群接触来实现适当细胞培养。可通过混合、添加、组合、接种或搅拌一或多种细胞与一或多种化合物、溶液、 培养基等而使培养基与细胞接触。亦可通过(例如)"补料"以替代或补充下文更详细描述的培养细胞的培养基而使培养基与细胞一次性、以增量形式或以逐步方式接触。IV.用于改良蛋白生产的方法和组合物本发明方法或组合物涉及哺乳动物细胞培养。在一个实施方案中，所使用的哺乳动物细胞为CHO细胞。已描述将DNA导入哺乳动物细胞中的既定方法。Kaufman，R. J.，Large Scale Mammalian Cell Culture，1990，第15-69页。使用市售试剂(例如阳离子脂质试剂 Lipofectamine 、lipofectamine -2000 或 lipofectamine -plus (可购自 Invitrogen)) 的附加方案可用以转染细胞。Feigner等人(1987).，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 7413-7417。此外，用涂渍了核酸的颗粒进行电穿孔或轰击可用以使用程序转染哺乳动物细胞，例如下列文献中的程序:A Laboratory Manual，第2版，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)和 Fitzpatrick-McElligott(1992)，Biotechnology(NY)10(9) 1036-40。可使用本领域已知方法(例如对细胞毒性药物的抗性)进行稳定转化子的选择。 Kaufman 等人((1990)，Meth. Enzymology 185 :487-511)描述了若干选择机制，例如二氢叶酸还原酶(DHFR)抗性。DHFR选择的适当宿主菌株可为缺失DHFR的CHO菌株DX-Bl 1。 Urlaub 及 Chasin (1980)，Proc. Natl. AcacUci. USA 77:4216-4220。可将表达 DHFR cDNA 的质粒导入菌株DX-Bll中且只有含有质粒的细胞可于适当选择培养基中生长。可并入表达载体中的可选择标记的其他实例包括赋予抗生素(例如G418及勻霉素B)抗性的cDNA。 可基于对这些化合物的抗性选择含有载体的细胞。
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已显示可改良哺乳动物表达载体的异源基因表达的附加控制序列包括下列元件 衍生自CHO细胞的表达加强序列元件(EASE) (Morris等，Animal Cell Technology,第 529-534页(1997)；美国专利第63U951B1号、第6027915号和第6309841B1号)及来自腺病毒 2 的三联前导序列(TPL)和 VA 基因 RNA (Gingeras 等(1982)，J. Biol. Chem. 257 13475-13491)。病毒来源的内部核糖体进入位点(IREQ序列使得双顺反子mRNA有效翻译(Oh 禾口 Sarnow (1993), Current Opinion in Genetics and Development 3:295-300; Ramesh 等人(1996)，Nucleic Acids Research 24:2697-2700)。异源 cDNA 以双顺反子 mRNA部分(后面为筛选标记的基因(例如DHFR))表达的部分已显示可改良宿主的转染能力和异种 cDNA 的表达(Kaufman 等人(1990)，Methods in Enzymo 1. 185 :487-511)。采用双顺反子mRNA的示例性表达载体为Mosser等，Biotechniques 22 :150-161(1997)描述的 pTR-DC/GFP 及 Morris 等，Animal Cell Technology，第 529-534 页(1997)描述的 p2A5I。Mosley等人已描述了一种可用的高表达载体pCAVN0T((1989)，Cell 59: 335-348)。可如 Okayama 及 Berg 所公开经((1983), Mol. Cell. Biol. 3 280)构建用于哺乳动物宿主细胞中的其他表达载体。适用在C127鼠类乳腺上皮细胞中哺乳动物cDNA的稳定高水平表达的系统可大体上如Cosman等人所述构建((1986)，Mol. Immunol. 23 :935)。 Cosman等人描述的可用高表达载体PMLSV Nl/N4((1984)，Nature312 :768)已保藏为ATCC 39890。其它可用的哺乳动物表达载体描述于EP专利第-A-0367566号和WO 01/27299Α1ο 载体可衍生自反转录病毒。可添加异源信号序列替代天然信号序列，该类异源信号序列例如以下序列之一美国专利第4965195号中描述的IL-7信号序列；Cosman等人描述的IL-2 受体信号序列(Nature 312 :768(1984)) ；EP专利第0367566号描述的IL-4信号肽序列； 美国专利第4968607号中描述的IL-I受体型信号肽；及EP专利第O 460 846号中描述的 II型IL-I受体信号肽。可在真核细胞中重组生产多肽且优选由适合于细胞培养物中生长的宿主细胞分泌。用于本发明的宿主细胞优选为哺乳动物细胞。该类细胞也可经基因工程改造表达所关注基因，可为适合于细胞培养物中生长的哺乳动物生产细胞和/或可为同源细胞株。常用于工业中的该类细胞的实例为VER0、BHK、HeLa, CVl (包括Cos)、MDCK、293、3T3、骨髓瘤细胞株(例如NS0、NSl)、PC12、WI38细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，该类细胞广泛地用于生产数种复合重组多肽，例如细胞激素、凝血因子和抗体(Brasel等(1996)，BloodSS 2004-2012 ；Kaufman 等(1988)，J. Biol Chem 263 :6352-6362 ；McKinnon 等(1991)，J Mol Endocrinol 6 :231-239 ；Wood 等(1990)，J. Immunol. 145 :3011-3016)。缺乏二氢叶酸还原酶(DHFR)的突变细胞株(Urlaub等(1980)，Proc Natl Acad Sci USA 77 :4216_4220，其以参考形式并于本文)DXBll和DG-44为合乎需要的CHO宿主细胞株，因为有效DHFR可选择和可扩增基因表达系统使得该类细胞中高水平表达重组多肽(Kaufman R.J. (1990)，Meth Enzymol 185 :537_566，其以参考形式并于本文)。此外，这些细胞易于作为粘附或混悬培养物操纵且显示相对优良的遗传稳定性。CHO细胞和其中表达的重组多肽已被广泛地特性研究且已经管理机构许可用于临床商业制造。也可使用生产抗体的杂交瘤细胞株实践本发明方法。制造杂交瘤的方法为本领域熟知。参见例如Berzofsky等，Paul编辑，Fundamental Immunology，第 2 版，第 315-356 页，347-350，Raven Press Ltd. ,New York(1989)。衍生自上述细胞系的细胞株也适用于实践本发明。
用编码重组蛋白的多聚核苷酸序列转化适当的哺乳动物宿主细胞(例如CHO细胞)后，鉴定并分离显示稳定表达重组蛋白的细胞。可根据本领域的已知方法，通过将适当 DNA载体转染至二氢叶酸还原酶缺乏(DHFR-)的中国仓鼠卵巢细胞(CHO AM-1/D，美国专利第62109M号)中，随后分离且检测显示最高重组蛋白表达的个别纯系而完成重组蛋白的稳定表达。基于小规模旋转器和较大规模生物反应器中的生长和生产，选择特定细胞株作为生产重组蛋白的细胞株。可通过本领域熟知的方法(例如，通过在不含血清的条件下于96和/或M孔板中进行多轮限制性稀释)，使用本发明细胞培养基克隆生产最高含量重组蛋白的细胞。基于各种悬浮容器中的生产和生长特征来选择克隆。可进行酶免疫测定法(EIA)选择生产最高水平重组蛋白的克隆。可通过使克隆在介于IOOml至高达3L范围内的各种振荡器或旋转烧瓶及生物反应器中的生长来测量生长特征(包括倍增时间和密度)。选择最佳克隆(例如可在培养物中达到最高密度的最快倍增时间的克隆)且选择其作为用于重组蛋白生产的细胞系。在一个实施方案中，重组蛋白生产用于商业目的且使用大规模生物反应器进行。通常，在组织培养板(例如IOcm培养板、96孔培养板等)或其他粘附培养(例如微载体珠)和悬浮培养(例如滚瓶中)，在无菌、温度受控和大气条件下进行细胞培养。培养物可在摇瓶、小规模生物反应器和/或大规模生物反应器中生长。生物反应器为用以培养细胞的装置，在生物反应器中可监测、调节并控制环境条件，例如温度、空气、搅拌和/或 PH值。本发明方法(包括分批补料方法)和组合物可用于大规模哺乳动物细胞培养，例如 10L、11L、12L、13L、14L等。在一个实施方案中，本发明的大规模细胞培养方法和组合物适用于CHO细胞培养和抗体生产。根据本发明，在促进所关注多肽(可为抗体或重组多肽)生产的条件下培养哺乳动物宿主细胞。本领域技术人员可选择使用本文所述的一或多种经研发以使特定培养宿主细胞中的细胞生长、细胞活力和/或重组多肽生产最大化的细胞培养基。或者，本发明方法和组合物可与市售细胞培养基组合使用。哺乳动物细胞的适当培养条件为本领域已知(参见例如Animal cell culture =A Practical Approach,D. Rickwood编，Oxford university press,New York(1992))且可与的本发明的改良方法组合。可以悬浮状态或附著至固体基质上培养哺乳动物细胞。此外， 也可(例如)在具有或不具有微载体的流体化床生物反应器、中空纤维生物反应器、滚瓶、 摇瓶或搅拌槽生物反应器中培养哺乳动物细胞且以分批、分批补料、连续、半连续或灌注模式进行。根据本发明的方法可用以改良单一阶段和多阶段培养过程中的重组多肽生产。在单一阶段过程中，将细胞接种至培养环境中且在单一生产期间采用所公开的方法。在多阶段过程中，在两个或两个以上不同阶段中培养细胞。举例而言，首先可在生长期，在使细胞增殖和活力最大化的环境条件下培养细胞，接着在使多肽生产最大化的条件下将其转移至生产期。生长期和生产期可在一或多个过渡期之后或被一或多个过渡期所分离。在多阶段过程中，至少可在生产期中采用本发明方法。为达成理解而非限制目的，本领域技术人员应理解蛋白生产的细胞培养和培养周期可包括三种通用类型即，连续培养、分批培养和分批补料培养。在连续培养中，例如，在培养期间向细胞提供新鲜培养基补充物(即补入培养基)，同时每日移除旧培养基且(例
34如)每日或连续收集产物。在连续培养中，可每日添加并可连续(即点滴或灌注)添加补入培养基。对于连续培养而言，可如需要将细胞保持于培养物，只要细胞保持存活并且维持环境和培养条件即可。在分批培养中，最初在培养基中培养细胞且在培养周期中或在培养周期结束前不移除、替代也不补充该培养基，即不用新鲜培养基向细胞"补料"。在培养周期结束时，收集所需产物。对于分批补料培养而言，通过在培养周期中每日(或连续地)一或多次用营养溶液补充培养基，即在培养期间用补入培养基对细胞"补料"，延长培养周期时间。分批补料培养可包括如下所述的各种补料方案和次数，例如每日、每隔一日、每两日等、每日一次以上或每日少于一次等。此外，可用补入培养基对分批补料培养物连续补料。接着，在培养/ 生产周期结束时收集所需产物。本发明优选涵盖分批补料细胞培养物，其中使用可增加蛋白生产并可延长蛋白生产期的优化补料溶液进行补料。改良分批补料培养物水解产物和基础富集溶液本发明的一方面为使用改良分批补料方法和补充基础溶液及水解产物溶液组合增加蛋白生产的方法和组合物。改良分批补料方法部分基于添加两种富集溶液(即水解产物富集溶液和基础富集溶液)，该类富集溶液在蛋白生产时段中添加至细胞培养基中。用于本发明的分批补料方法的水解产物富集溶液包含并非衍生自植物或动物的第一水解产物和第二植物源水解产物。并非衍生自植物或动物且并为植物源水解产物的水解产物的实例为酵母源水解产物。可用于水解产物富集溶液中的植物源水解产物的实例为大豆源水解产物。基础富集溶液包括基础培养基，例如PF CH0、天冬酰胺和葡萄糖，且水解产物富集溶液包括至少两个不同的非动物源水解产物。在一定时段中以一定时间间隔(例如在11-15天的时段中以每日时间间隔)将水解产物和基础富集溶液添加至细胞培养物中，且可于同一日或不同日添加。本发明表征了一种生产抗-TNFa抗体(例如阿达木单抗/D2E7)的分批补料方法，其包含在介于32至38°C范围内的培养温度下在细胞培养物中培养包含编码抗-TNFa 抗体的核酸的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一个实施方案中，培养温度为35°C。向CHO细胞补入水解产物富集溶液和基础富集溶液以处理(例如解决或校正)营养缺乏以使生产率最大化。将水解产物和基础富集溶液添加至细胞培养物中。在一个实施方案中，细胞培养生产培养基包含介于20与65%之间的溶氧，例如约30%溶氧。在一个实施方案中，细胞培养生产培养基含有蛋白生产所需的葡萄糖含量，例如至少约l_5g/L葡萄糖。在一个实施方案中，细胞培养生产培养基包含约1.5-2.5g/L葡萄糖。在另一个实施方案中，细胞培养生产培养基包含约2g/L葡萄糖。在整个蛋白生产培养过程中，可通过按需要向细胞培养生产培养基中添加葡萄糖以维持所给定浓度(例如至少约2. Og/L葡萄糖)来控制葡萄糖浓度。在一个实施方案中，用于抗-TNFa抗体的分批补料方法的水解产物富集溶液基本由下列各物组成约50-280g/L大豆源水解产物(包括其间的范围和数值，例如，100-225， 50-225，225-275和265g/L)和约75_300g/L酵母源水解产物(包括其间的范围和数值，例如，100-250,150-200，145-175 和 165g/L)。为用于在CHO细胞中生产抗-TNF α抗体(例如阿达木单抗/D2E7)的分批补料方法而优化的基础富集溶液具有约9. 0至10. 5的ρΗ值(包括其间的范围和数值，例如，9. 1、9. 2,9. 3,9. 4,9. 5,9. 6,9. 7,9. 8,9. 9,10,10. 1,10. 2,10. 3,10. 4,10. 5)。添加水解产物富集
溶液和基础富集溶液的时段在9至15天之间，例如12天。在一个实施方案中，在该时段以下各日的至少一日将基础富集溶液添加至细胞培养基中第4日、第6日、第9日和第11日， 且在该时段的第4日、第7日或第4日和第7日将水解产物富集溶液添加至细胞培养基中。在另一备选实施例中，用于生产抗-TNFa抗体(例如阿达木单抗/D2E7)的分批补料方法可包括根据PH值线性斜坡(包含自约6. 5-8(例如，7. 1至7. 2)的pH值起始且产生最终约6.9的pH值)调节细胞培养基的pH值。在一个实施方案中，在至少约M小时、 48小时或72小时的时段内调节pH值线性斜坡。本发明也涉及生产抗-IL12抗体(例如ABT-874)的分批补料方法，其包含在介于 32至38°C (例如33°C )范围内的培养温度下在细胞培养物中培养包含编码抗-IL12抗体的核酸的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。用于IL-12抗体生产的水解产物富集溶液也可含有葡萄糖。在一个实施方案中，在约6.9的pH值下培养CHO细胞。向CHO细胞补入水解产物富集溶液和基础富集溶液以维持营养缺乏，以使生产率最大化。将水解产物和基础富集溶液添加至细胞培养物中。在一个实施方案中，细胞培养生产培养基包含介于20与65%之间的溶氧，例如约40%溶氧。在一个实施方案中，用于抗-IL12抗体的分批补料方法的水解产物富集溶液基本由下列各物组成约50-280g/L大豆源水解产物(包括其间的范围和数值， 例如，100-225、50-225、255-275和165g/L)、约75_300g/L酵母源水解产物(包括其间的范围和数值，例如，100-250、150-200、145-175禾口 165g/L)和约2. 4g/L葡萄糖。为用于在CHO 细胞中表达抗-IL12抗体(例如ABT-874)的分批补料方法而优化的基础富集溶液具有约 9. 7的pH值及约1480m0sm的渗透压。添加水解产物富集溶液和基础富集溶液的时段在14 至15天之间，例如12天。在一个实施方案中，在该时段的第5日起每隔一天将基础富集溶液添加至细胞培养生产培养基中，且在该时段的第6日起每天将水解产物富集溶液添加至细胞培养生产培养基中。或者，可在该时段的第5日起始每天将基础富集溶液和水解产物富集溶液添加至细胞培养生产培养基中。稳定、高浓度补料溶液本发明一方面涉及与用于改良蛋白生产率的改良、稳定高浓度补料溶液相关的方法和组合物。改良补料溶液可用于在抗体生产中补充细胞培养生产培养基。补料溶液包括葡萄糖(例如100至250g/kg)；基础培养基；除谷氨酰胺以外的氨基酸，例如天冬酰胺(例如1. 0至15. Og/kg ；3-12. 5g/kghuo 3_5g/kg)；以及至少两种不同的非动物源水解产物。此外，补料溶液具有约6. 0至7. 5的pH值。两种不同的非动物源水解产物可包括植物源水解产物，例如大豆源水解产物，和并非动物源或植物源的水解产物，例如酵母源水解产物。本领域中已知的任何基础培养基均可用于改良补料溶液，包括但不限于PF CHO或DMEM/F12 培养基。也可使用经修饰的基础培养基。在一个实施方案中，基础细胞培养基排除以下组份碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂、谷氨酰胺和葡萄糖。改良补料溶液为稳定的，具有小于约15NTU的浊度。本发明也包括通过添加补料溶液维持细胞培养生产培养基的稳定葡萄糖含量。上述范围值的中间数也为本发明的一部分， 例如，3. 0,3. 1,3. 2,3. 3,3. 4,3. 5,3. 6,3. 7,3. 8、4、4· 2,4. 4,4. 6,4. 8 和 5g/kg 天冬酰胺。本发明也包括一种用于制造包含葡萄糖和至少两种不同非动物源水解产物的补料溶液的方法。制造补料溶液的方法包括将葡萄糖与基础细胞培养基组合为组合溶液并将组合溶液的PH值调节至约9. 5至10. 5。接着，将至少两种不同的非动物源水解产物添加至溶液中并再次调节PH值，使得所得补料溶液具有约6. 5至7. 5的pH值。上述范围值的中间数也为本发明的一部分，例如，6. 6,6. 7,6. 8,6. 9,7. 0,7. 1,7. 2,7. 3,7. 4,7. 5 的 pH。本发明的补料溶液可用以完成自哺乳动物细胞培养物生产高含量重组蛋白，例如生产抗体。在一个实施方案中，本发明涉及由哺乳动物细胞培养物生产至少约4g/L抗体的方法，其包含在细胞培养生产培养基中培养包含编码抗体的核酸的哺乳动物细胞。接着，将 PH值约6. 7至7. 0的补料溶液添加至细胞培养生产培养基中。补料溶液包括葡萄糖(例如约100至200g/kg)；基础细胞培养基；除谷氨酰胺以外的氨基酸；及至少两种不同的非动物源水解产物。在一个实施方案中，该方法可生产至少约4g/L抗体，至少约5g/L抗体；至少约6g/L抗体。上述范围值的中间数也为本发明的一部分，例如，1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、 2. 0,2. 1,2. 2,2. 3,2. 4,2. 55g/L 抗体。通过使用pH值约6. 7至7. 0并包括下列组份的补料溶液葡萄糖；基础细胞培养基；约除谷氨酰胺以外的氨基酸；及至少两种不同的非动物源水解产物，可增加自哺乳动物细胞培养物生产的抗体滴度。在一个实施方案中，将补料溶液添加至包含编码抗体的核酸的哺乳动物细胞的细胞培养生产培养基中，致使比不添加补料溶液培养的对照哺乳动物细胞培养物增加至少50%。在一个实施方案中，添加补料溶液会生产比对照物增加至少100%的滴度。在一个实施方案中，添加补料溶液会产生比对照物增加至少150%的滴度。可将补充补料溶液在特定细胞浓度下添加至细胞培养物中，例如当细胞密度达到每毫升2. OX IO6个细胞或当细胞密度达到每毫升约3. 5X IO6个细胞时。以上范围的中间数以及本文中所引用的所有其他数均为本发明的一部分。使用上述值的任何组合作为上限和/ 或下限的数值范围包括于本发明范畴内。由于本发明的分批补料方法用以处理(例如解决或校正)生产蛋白(例如抗体) 的特定细胞培养物的营养要求，因此监控特定成份是有利的。可监控的成份包括任何代谢指示剂，即细胞代谢指示剂。在一个实施方案中，本发明的分批补料方法包含监控细胞培养基中的葡萄糖水平，包括监控葡萄糖水平以使其维持于0. 25-20g/L之间。在一个实施方案中，葡萄糖水平维持在0. 5至5. 5g/L之间，或4. 0-5. 5g/L。通过监控葡萄糖水平，可间接监控细胞代谢。如以下实例3中所述，可将葡萄糖用作代谢指示剂。在一个实施方案中，可基于葡萄糖水平以营养组份(例如水解产物)补充细胞培养物。监控葡萄糖含量的方法为本领域已知并可包括使用自动取样装置进行监控。可使用的代谢指示剂的另一实例为谷氨酰胺。以上范围的中间数以及本文中所引用的所有其他数均为本发明的一部分。使用上述值的任何组合作为上限和/或下限的数值范围包括于本发明范畴内。反馈控制系统可用以监控细胞培养生产培养基中的代谢指示剂水平。在一个实施方案中，为了满足所需参数设定点(例如预定葡萄糖水平)，如反馈控制系统所测定将组合补料溶液添加至细胞培养生产培养基中。反馈控制系统也可用以测定给定哺乳动物细胞培养物和所关注蛋白生产的补入曲线。在一个实施方案中，确定用于在哺乳动物细胞培养物中生产蛋白的补入曲线的方法包含在细胞培养生产培养基中培养包含编码蛋白的核酸的哺乳动物细胞；使用反馈控制系统监控细胞培养生产培养基中的代谢指示剂，藉此将补料溶液(例如组合补料溶液)添加至细胞培养生产培养基中。将补料溶液添加至细胞培养生产培养基中以达到目标代谢指示剂设定点，例如葡萄糖水平。根据细胞培养结论，测定每天添加至细胞培养生产培养基中的补料溶液的量并提供应于何时将补料溶液添加至细胞培养物中的补入曲线。一旦确立补入曲线，则不再需要监控生产所关注蛋白的给定哺乳动物细胞培养物的代谢指示剂。N-乙酰半胱氨酸和丁酸钠方法及组合物如上所述，本发明的细胞培养方法可有利达到增加抗体滴度。用于达到在哺乳动物细胞培养物中的蛋白生产率的本发明另一方面为通过向细胞培养基中添加丁酸钠、N-乙酰半胱氨酸或其组合。在一个实施方案中，本发明涉及通过向细胞培养基中添加丁酸钠 (例如0. ImM至IOmM)、N_乙酰半胱氨酸(例如ImM至80mM)或其组合而生产抗体的方法。 在一个实施方案中，抗体滴度至少约100mg/L ；至少约150mg/L ；或至少约200mg/L ；至少约 250mg/L ；至少约 300mg/L ；至少约 350mg/L ；或至少约 400mg/L。本发明也涉及通过向细胞培养基中添加丁酸钠(例如终浓度0. ImM至IOmM)、 N-乙酰半胱氨酸(例如终浓度ImM至80mM)或其组合(对照物相应地缺乏丁酸钠、N-乙酰半胱氨酸或其组合)而在哺乳动物细胞培养物中生产抗体，从而使得抗体滴度比对照哺乳动细胞培养物改良至少10%的方法。在一个实施方案中，哺乳动物细胞培养物的抗体滴度比对照哺乳动物细胞培养物改良至少四％ ；比对照哺乳动物细胞培养物改良至少40% ；比对照哺乳动物细胞培养物改良至少70%;或比对照哺乳动物细胞培养物高至少90%。可在哺乳动物细胞培养物的生长期中向哺乳动物细胞培养物中添加丁酸钠、N-乙酰半胱氨酸或其组合。在一个实施方案中，在培养时间的第4日与第7日之间向哺乳动物细胞培养物中添加丁酸钠、N-乙酰半胱氨酸或其组合。在一个实施方案中，以介于5mM至SOmM的终浓度 (例如20-60mM或约IOmM)单独添加N-乙酰半胱氨酸或与丁酸钠组合。本发明也涉及通过向细胞培养基中添加约0. ImM至IOmM N-乙酰半胱氨酸(对照物缺少此添加)使得哺乳动物细胞培养物的寿命与对照哺乳动物细胞培养物相比延长至少约45%的方法。在一个实施方案中，哺乳动物细胞培养物的寿命与对照哺乳动物细胞培养物相比延长至少约35% ；或与对照哺乳动物细胞培养物相比延长至少约55%。应注意，本文所描述的细胞培养基和改良培养方法可独立或彼此组合使用。在使用本发明方法和组合物进行培养后，接着可回收或收集所得表达蛋白。此外， 可使用已知方法将自该培养物或组份(例如自培养基或细胞萃取物或体液)纯化或部分纯化蛋白。分级分离程序包括但不限于过滤、离心、沉淀、相分离、亲和纯化、凝胶过滤、离子交换层析、疏水相互作用层析(HIC，使用例如苯基醚、丁醚或丙醚的树脂)、HPLC或上述步骤的一些组合。举例而言，多肽纯化可包括含有将结合至多肽的试剂的亲柱；在该类亲和树脂(例如刀豆球蛋白A琼脂糖、HEPARIN-T0Y0PEARL(层析介质)或Cikicrom blue 3GA SEPHAR0SE (琼脂糖颗粒))上进行的一个或多个柱层析步骤；包括洗脱的一个或多个步骤； 和/或免疫亲和层析。可以促进纯化的形式表达多肽。举例而言，其可表达为融合多肽， 例如麦芽糖结合多肽(MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或硫氧还蛋白(TRX)的融合多肽。 表达且纯化该类融合多肽的试剂盒可分别购自New England BioLab (Beverly, Mass.)、 Pharmacia (Piscataway, N. J.)和hVitrogen。可用表位标记多肽且随后使用针对该表位的特定抗体纯化。一种该表位FLAG (表位标记)购自Kodak (New Haven, Conn.)。也可能将包含多肽结合多肽(例如结合至重组蛋白的单克隆抗体)的亲和柱用于亲和力纯化所表达多肽。其他类型的亲和纯化步骤可为蛋白A或蛋白G柱，其中亲和试剂结合至含有Fc结构域的蛋白。可使用常规技术将多肽自亲和柱移除，例如在高盐洗脱缓冲剂中并接着在低盐缓冲剂中透析以供使用或根据所使用的亲和基质改变PH值或其他组份；或可使用亲和部分的天然底物竞争性移除。在一个实施方案中，根据US申请案第11/73四18号(以参考形式并于本文)所述方法纯化使用本发明方法和组合物生产的抗体。所需的最终纯度取决于多肽的预期用途。本发明方法和组合物适用于所关注蛋白的治疗用途。因此，当预期在活体内给予多肽时，需要相对较高的纯度。在该情况下，将多肽纯化，使得在通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析时不能检测到对应于其他多肽的多肽条带。相关领域技术人员应理解，由于差异糖基化、差异翻译后加工及其类似技术，通过SDS-PAGE可观测到多个对应于多肽的条带。最优选地，将本发明多肽纯化至大体均质，如通过SDS-PAGE进行分析时的单一多肽条带所指示。可通过银染、考马斯蓝染色或(如果多肽经放射性标记)通过放射自显影目测多肽条带。本发明也任选涵盖进一步配制蛋白。术语"配制"意指蛋白可经缓冲液交换、杀菌、大体积包装和/或包装以用于最后使用者。该类组合物可包含与其他组份(例如生理学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂)组合的有效量蛋白。术语"生理学上可接受"意指不干扰活性成份的生物活性有效性的无毒材料。应注意，关于本文所引用的数值，以上范围的中间数以及本文所引用的所有其他数值为本发明的一部分。使用上述数值的任何组合作为上限和/或下限的数值范围包括于本发明范畴内。实施例以下实施例举例说明用于培养哺乳动物细胞的改良方法和组合物，包括用于在哺乳动物细胞中表达生物制品的改良方法和组合物。下文揭示用以培养中国仓鼠卵巢(CHO) 细胞以表达各种重组生物制品的改良生化成分确定的培养基。此外，也举例说明在以各种形式和规模运作的生物反应器中，含有相同组份但具有不同组份平衡且经富集以使更多细胞生长和产物表达增加的大规模培养细胞的培养基。实施例1 培养哺乳动物细胞的改良培养基通常，哺乳动物(例如中国仓鼠卵巢(CHO))细胞培养基基于市售培养基配方，例如DMEM、Ham氏F12或这些类型培养基的组合。为了在哺乳动物细胞中生产蛋白，细胞培养基必须充分富集以支持细胞生长和生物制品产品表达的增加。以下实施例描述用于培养哺乳动物细胞(即中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)以表达包括抗体的各种重组生物制品的改良生化成分确定的培养基。缺乏二氢叶酸还原酶[dhfr(-)]的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞适合在不存在血清或任何其他衍生自动物来源的材料下以悬浮状态生长。细胞在不存在次黄嘌呤和胸苷下，在从商业来源JRH PF-CHO(目录号67147)获得的成分确定细胞培养基中生长。尽管细胞系并不缺乏谷氨酰胺合酶，但仍向培养基中添加额外的谷氨酰胺。使用本领域熟知的分子生物技术生成表达生物制品(例如给定标靶的抗体)的 CHO细胞系。简而言之，使用本领域熟知的方法将能够表达所关注抗体并能够表达dhfr酶基因的表达载体导入CHO细胞中。通过在次黄嘌呤和胸苷存在下筛选细胞获得所关注的经转染细胞。在浓度不断增加的甲氨喋呤中进一步培养所筛选的转化子以扩增经转染基因并增加所表达蛋白的产率。下文描述用以培养CHO细胞的改良细胞培养基。
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实施例1. 1 :中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养的培养基一般而言，用于培养CHO细胞的培养基配方由命名为A部分、B部分及C部分的三个部分组成。A部分为基础培养基并包含水、氨基酸、维生素、无机金属盐、微量元素、乙醇胺、腐胺、表面活性剂、丙酮酸钠、谷胱甘肽和2-巯基乙醇。B部分包含无机铁来源；且C部分包含重组生长因子、缓冲剂、渗透压调节剂、能量来源、各种非铁金属离子、表面活性剂和水解产物。培养基组份大部分为无机的或来自重组来源并且经高度纯化。培养基不含有来自动物来源的蛋白、脂质和碳水化合物。复合水解产物从经高度加工的酵母和植物来源获得。培养基的A部分包括不含蛋白的CHO (PF CH0)培养基(JRH-SAFC Biosciences ； JRH目录号67147-也称作原始A部分)。因此，A部分包括基础培养基，该基础培养基包括水、氨基酸和维生素。选择基础培养基(PF CH0)将其修饰并再调配以支持细胞生长和所表达蛋白生产率的进一步增加。修饰PF CHO以去除特定组份，包括碳酸氢钠、HEPES缓冲剂、 磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂和单糖葡萄糖(经修饰PF CHO在本文中称作经修饰A部分(也称作JRH目录号67411))。也进行这些修饰以促进大规模生物反应器中细胞培养过程条件的改良。B部分组份(JRH)由独立添加的浓缩柠檬酸铁溶液组成。B部分组份的浓度在所有CHO细胞培养方案中均保持恒定。C部分组份包括生长因子(例如胰岛素)、氨基酸谷氨酰胺、TC酵母粉和大豆水解产物植物蛋白胨、保持选择压力必需的甲氨喋呤及在制备期间用于在培养基水合后调节PH 值的碱NaOH和酸HCl。改良细胞培养基配方由如下制成。首先，最初使CHO细胞在从JRH获得的PF-CHO 培养基(SAFC-JRH目录号67147)中生长。如下所述，将PF-CHO培养基(目录号67147)进一步修饰以与CHO细胞株一起使用。该经修饰培养基由JRH以新目录号67411命名。修饰的目标是使细胞培养基的A部分浓度增加，以致渗透压和pH值不受影响。制造商(JRH)也声明原始A部分(目录号67147)不具有碳酸氢钠、谷氨酰胺并不含蛋白质(不添加胰岛素或其他蛋白或肽生长因子)。当证明有效时，将这些省略的组份独立添加至67147和6741IA 部分配方中，特别用于CHO细胞系。这些成为下文如C部分更详细描述的组份中的一些。表1 原始细胞培养基配方(A部分67147)和经修饰细胞培养基配方(经修饰的A 部分67411)的比较
权利要求
1.包含A部分、B部分和C部分的无血清细胞培养基，其中a)A部分基本由排除下列组份的经修饰基础培养基组成碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂及单糖葡萄糖；b)B部分基本由无机铁来源组成；及c)C部分包含重组生长因子；缓冲剂；渗透压调节剂；能量来源；及至少两种不同的非动物源水解产物。
2.一种用于生产蛋白的方法，其包含在权利要求1的细胞培养基中培养哺乳动物细胞。
3.—种无血清细胞培养基，其包含a)基础培养基；b)约8-12ml/kg 或 116-126mg/L 柠檬酸铁；c)约2-6mg/kg重组人胰岛素；d)约2-5g/kg无水葡萄糖；e)约0. 1-0. 5g/kg L-谷氨酰胺；f)约l"3g/kg碳酸氢钠；g)约0. 01-0. 05g/kg NaH2PO4 · H2O ；h)约0. 4-0. 5g/kg Na2HPO4 · 7H20 ；及i)约1.0-3. Og/kg酵母源水解产物。
4.一种用于产生蛋白的方法，其包含a)在权利要求3的培养基中培养包含编码该蛋白的核酸的哺乳动物细胞；及b)将(a)的培养物转移至细胞培养生产培养基中， 以生产所述蛋白。
5.一种无血清细胞培养生产培养基，其包含a)排除下列组份的经修饰基础培养基碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、 渗透压调节剂、表面活性剂和单糖葡萄糖；b)约8至12ml/kg或122.45mg/L柠檬酸铁；c)约4至8mL/kg或10至Hmg/kg重组人胰岛素；d)约5至9g/kg无水葡萄糖；e)约0.5至0. 7g/kg L-谷氨酰胺；f)约1至2g/kg碳酸氢钠；g)约1 至 2g/kg HEPES ；h)约2 至 3g/kg NaCl ；i)约0.5 至 2g/kg Pluronic F-68 ； j)约 0. 01 至 0. lg/kg NaH2PO4 · H2O ； k)约 0. 4 至 0. 5g/kg Na2HPO4 · 7H20 ； 1)约8至12g/kg酵母源水解产物；及 m)约60至70g/kg植物源水解产物。
6.一种无血清细胞培养基，其包含a)排除下列组份的经修饰基础培养基碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂和单糖葡萄糖；b)约8至12ml/kg或122.45mg/L柠檬酸铁；c)约3至5mL/kg或6至8mg/kg重组人胰岛素；d)约5至9g/kg无水葡萄糖；e)约0.1至2g/kg L-谷氨酰胺；f)约1至2g/kg碳酸氢钠；g)约1 至 2g/kg HEPES ；h)约2 至 3g/kg NaCl ；i)^ 0.1 M 2g/kg Pluronic F-68 ； j)约 0. 01 至 0. lg/kg NaH2PO4 · H2O ； k)约 0. 4 至 0. 5g/kg Na2HPO4 · 7H20 ；1)约0. 4至0. 5g/kg L-天冬酰胺一水合物； m)约2至6g/kg酵母源水解产物；及 η)约2至4g/kg植物源水解产物。
7.一种用于生产蛋白的方法，其包含在权利要求6的细胞培养基中培养包含编码该抗体的核酸的哺乳动物细胞。
8.—种无血清细胞培养基，其包含a)排除下列组份的经修饰基础培养基碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、 渗透压调节剂、表面活性剂及单糖葡萄糖；b)约8至10ml/kg或120至130mg/L柠檬酸铁；c)约3至5mL/kg或7.8mg/kg重组人胰岛素；d)约5至9g/kg无水葡萄糖；e)约0.8至0. 9g/kg L-谷氨酰胺；f)约0.3至0. 5g/kg L-天冬酰胺一水合物；g)约1至2g/kg碳酸氢钠；h)约1 至 2g/kg HEPES ；i)约2 至 3g/kg NaCl ；j)约 0.5 至 2g/kg Pluronic F-68 ； k)约 0. 01 至 0. lg/kg NaH2PO4 · H2O ； 1)约 0. 1 至 1. Og/kg Na2HPO4 · 7H20 ； m)约2至6g/kg酵母源水解产物；及 η)约2至4g/kg植物源水解产物。
9.一种无血清细胞培养基，其包含 a)基础细胞生长培养基；b)约8至ianl/kg或120至130mg/L柠檬酸铁；c)约2至6mg/kg重组人胰岛素；d)约150至250g/kg无水葡萄糖；e)约0.1至0. 5g/kg L-谷氨酰胺；f)约1至2g/kg碳酸氢钠；及g)约5至15g/kg酵母源水解产物。
10. 一种用于产生蛋白的方法，其包含在权利要求8-9中任一项的细胞培养基中培养包含编码所述蛋白的核酸的哺乳动物细胞。
全文摘要
本发明描述在哺乳动物细胞培养物中生产重组蛋白例如抗体的改进方法和组合物。此外，本发明提供改良细胞培养基，包括改良生产培养基、补料溶液和组合补料，其可用于提高哺乳动物细胞培养物中的蛋白生产率。
文档编号C12N5/10GK102337243SQ20111029427
公开日2012年2月1日 申请日期2007年9月13日 优先权日2006年9月13日
发明者C·史丘兹, D·F·布鲁顿, I·A·布拉, J·C·范, J·C·马杜克, J·麦因泰尔, N·A·洛依, T·希沃斯特, 张幼翔 申请人:雅培制药有限公司