专利名称：分离的多肽、多核苷酸、载体及宿主细胞的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，尤其涉及了一种分离的多肽、多核苷酸、载体及宿主细胞。
背景技术：
脂肪酶(三脂酰甘油酰基水解酶，EC3. 1. 1. 3)是一类能在油水界面催化酯水解，转酯化和酯合成的酶。其被广泛地应用于化学，食品，制药和日化等工业中。比如利用脂肪酶水解油脂的能力可获得重要的轻化工原料脂肪酸和甘油，并且对皮革加工、造纸工业都有重要的帮助；脂肪酶另一个重要工业应用就是催化油脂改性，新的油脂可通过在甘油的 Sn-I和Sn-3位上酰基交换获得。例如用价格便宜的棕榈油升级为类可可脂。其中来源于真菌米黑霉的脂肪酶RML (.Rhizomucor miehei Lipase)就是一种能够专一性水解甘油三酯1，3位酯键的脂肪酶，得到的二酯和单酯在食品和商品业中都具有更广泛的应用价值。提高脂肪酶的催化活力，是降低脂肪酶生产成本的有效途径之一。而若同时提高脂肪酶的热稳定性，则使其在工业应用中更具有价值。本发明以具有1，3专一选择性的米黑根毛霉脂肪酶0 办ofiwcor miehei Lipase)为研究对象，首先采用易错PCR定向进化技术，利用大肠杆菌表达体系，建立脂肪酶突变库，通过高通量筛选方法，筛选出热稳定性和酶催化比活提高的RML突变脂肪酶，将其相应的突变基因测序后，分析氨基酸突变位点，并针对这些位点进行定点饱和突变，以达到进一步提高脂肪酶催化比活力及耐热性的目的。
发明内容
本发明的目的是提供一种同时具有高热稳定性及对甘油三酯的高水解能力的脂肪酶突变基因，涉及了一种分离的多肽、多核苷酸、载体及宿主细胞。为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决 多肽，所述多肽选自
(1)SEQID N0:4、6、8、10、12、14、16、18、20 或 22 所示氨基酸序列；和
(2)在(1)所述的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，但至少保留以SEQ ID NO :2的氨基酸序列编号记第48位氨基酸残基为Val，67位氨基酸残基为Ala， 以及311位氨基酸残基为kr，且具有脂肪酶活性的由(1)衍生的多肽。作为优选，以SEQ ID NO:2的氨基酸序列编号计，(2)所述的多肽至少还保留一个或多个以下位置上的残基第78位的Thr，第113位的kr，第168位的ft~o，第173位的 Arg, H 190位的Asn，第240位的Ser，和第313位的Asp。作为优选，以SEQ ID NO:2的氨基酸序列编号计，(2)所述的多肽或者至少还保留一个或多个以下位置上的残基第67位的Asp，第240位的Ala(或240位的Val，或240位的His)，第311位的Cys，第313位的His。多核苷酸，所述的多核苷酸选自编码上述技术方案中任一所述的多肽的多核苷酸和与(1)所述的多核苷酸互补的多核苷酸。作为优选，所述的多核苷酸编码如SEQ ID而4、6、8、10、12、14、16、18、20或22所
示的多肽。作为优选，所述的多核苷酸的核苷序列如SEQ ID NO :3、5、7、9、11、13、15、17、19或
21所示。载体，所述的载体含上述技术方案中任一所述的多核苷酸。作为优选，所述的宿主细胞含有上述的载体，或含有上述技术方案中任一所述的多核苷酸。本发明由于采用了以上技术方案，具有显著的技术效果
本发明得到的突变基因所编码的脂肪酶具有更高的水解活性以及对高温的耐受性。
图1是本发明考马斯亮蓝测蛋白浓度标准曲线。图2是PCR扩增RML基因结果。RML基因全长1020bp，如图中箭头指向。图3是RML基因成功克隆于载体pET30a的鉴定。RML基因全长1020bp，如图中箭头指向。图4是SDS-PAGE检测RML的表达;M:蛋白质Marker ;Control 未加诱导剂的样品；1，加入IPTG诱导，取菌体离心后的上清为样品，检验是否有分泌表达；2，根据前述步骤，加入IPTG诱导，超声破碎菌体细胞得到样品。脂肪酶RML克隆于载体pET30a后，蛋白表达大小42kD，为胞内表达，而非分泌表达。如图中箭头指向。图5是SDS-PAGE检测RML纯化结果；蛋白大小42kD，如图中箭头指向。图6是野生型脂肪酶催化油脂反应释放的产物量随时间的变化，30分钟内通过酸碱滴定所释放的脂肪酸的量随时间增长成线性增长。图7是对硝基苯酚标准曲线。图8是易错PCR扩增结果。图9是定向进化提高脂肪酶活性和热稳定性的趋势图。图10是Quick Change法定点饱和突变氨基酸流程图。图11是Quick Change定点饱和突变PCR扩增结果。M:DNA Marker ；脂肪酶RML 全基因克隆于载体pET30a中，重组质粒全长6442bp，如图中箭头所示。图12是定点饱和突变技术持续提高脂肪酶活性和热稳定性趋势图。
具体实施例方式下面结合附图1至附图12与实施例对本发明作进一步详细描述
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。如本文所用，“分离的多肽”或“分离的脂肪酶”是指脂肪酶基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化脂肪酶。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、丝状真菌、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。在本发明中，术语“脂肪酶”包括具有脂肪酶活性的SEQ ID NO: 4、6、8、10、12、14、 16、18、20或22所示的多肽。该术语还包括具有脂肪酶功能的、SEQ ID NO: 4、6、8、10、12、 14、16、18、20或22的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)一个或多个(例如1_10 个，最佳地1-5个，更佳地，1-3个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N 末端添加或缺失一个或数个(通常为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。优选所述变异形式包括一个或多个(例如1-10个，最佳地1-5个，更佳地，1-3个)保守性取代。“保守性取代”是利用具有相似侧链的一种氨基酸残基替代另一种氨基酸残基。具有相似侧链的家族在本领域已有明确定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、 组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。应理解，对于本发明SEQ ID NO :4、6、8、10、12、14、16、18、20或22的变异形式，优
选的是它们保留了本发明所特别指出的突变位点上的突变。“保留”在本文中指本发明多肽的变异形式除具有本发明所特别指出的突变位点上的突变外，还含有其它变异，例如在其它一个或多个(优选1 5个，更优选1 3个)位点上发生如前文所述的插入、缺失或突变。 例如，本发明多肽的变异形式至少保留第48位残基为Val，第67位残基为Ala，第311位为 Ser0在其它实施例中，所述变异形式至少保留第48位残基为Val，第67位残基为Ala，第 311位为Ser和第168位为ft~o。在其它实施例中，所述变异形式至少保留第48位残基为 Val，第67位残基为Ala，第311位为Ser和第240位为Thr。在其它实施例中，所述变异形式至少保留第48位残基为Val，第67位残基为Ala，第311位为kr，第168位为Pro和第 240位为Thr。在其它实施例中，所述变异形式至少保留第48位残基为Val，第67位残基为 Ala,第311位为Ser，第78位为Thr，第190位为Asp，第313位为Val等。此外，本领域技术人员公知，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点， 这势必在所表达的蛋白末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的蛋白的活性。又如为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸等。本发明的脂肪酶的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是？1^，撤，撤1，(-1^，？017-!^， Poly-Arg, Strep-Tagil, AUl, EE, Τ7，4Α6，ε，B，gE 以及 Tyl0 这些标签可用于对蛋白进行纯化。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO: 3、5、7、9、11、13、15、17或19所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码SEQ ID NO: 4、6、8、10、12、14、16、18、20 或 22 的蛋白质，但与 SEQ ID NO: 3、5、7、9、11、13、15、17、19 或 21所示的编码区序列有差别的核酸序列。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%，较佳地至少70%， 更佳地至少80%相同性的多核苷酸。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO: 4、 6、8、10、12、14、16、18、20或22所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度在 15-50个核苷酸，较好是15-30个核苷酸之间。核算片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码脂肪酶的多聚核苷酸。本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。本发明的脂肪酶核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的 cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当待扩增的序列较长并希望引入突变时时，本发明选择采用Quick-Change法进行PCR扩增，此时需要一对交错部分重叠的引物。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明还涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或脂肪酶编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。优选的，本发明的载体是表达载体。通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的脂肪酶。一般来说有以下步骤
(1)用本发明的编码脂肪酶的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞 (3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。本发明中，编码脂肪酶的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。 表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；丝状真菌细胞、或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属；真菌细胞如酵母、丝状真菌、植物细胞等。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理或者利用专门制备超级感受态的缓冲液处理，所用的步骤在本领域的分子克隆技术操作方面都有详尽的介绍。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。 当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导) 诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。本发明采用的高通量筛选方法是水解pNPP法，反应体系的总体积通常为少于高通量筛选用多孔板每个孔的容积。因此，可根据待加入的酶液体积和孔容积选择适当的反应体系体积。通常，酶液量从5微升到100微升都可用于pNPP法检测酶活。本发明中的高通量筛选反应还包括在某一实施例中，将酶液于70°C处理2小时后再用于反应体系。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等， 《分子克隆实验室指南》(美国纽约州冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，1989)所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。对于试剂的用法和用量，除非另有说明，否则按照常规的用法和用量使用。实施例1
脂肪酶的克隆表达及目标蛋白比活力的测定 1.1.1材料
1.1.1.1目的基因、菌株与质粒
来源于真菌米黑根毛霉(Mizomwor miehei )的脂肪酶基因(包括编码前导肽部分)由上海闪晶分子生物科技有限公司合成；克隆及表达质粒pET30a，pET22b，pET3h和宿主菌 Ε. coli BL21购于Novagen (WI)公司(Wisconsin, USA)。所用菌株均在相应培养基中添加相应的抗生素进行37°C摇床培养。1. 1. 1. 2 工具酶
PrimeSTAR HS DNA Polymerase 购于 Takara 公司，制品包括PrimeSTARTM HS DNA Polymerase, PrimeSTARTM Buffer (包括 Mg2+)以及 dNTP。限制性内切酶 EcoRI、NotI、 HindIIKNcoI以及T4DNA快速连接酶均购于生工生物工程(上海)有限公司。1.1.1.3 试剂
PCR Cleanup试剂盒、质粒提取试剂盒、凝胶纯化试剂盒购于axygen公司，PCR引物由上海英俊生物公司合成，其他试剂均为国产分析纯。LB培养基
1%蛋白胨、0. 5%酵母粉，l%NaCl。用NaOH调pH7. 2，120°C灭菌备用。(固体培养基在 LB培养基中添加1. 5-2%琼脂)。1. 1. 1. 4 主要仪器PCR仪；凝胶成像系统；高速冷冻离心机；水平电泳系列；垂直电泳系列；恒温金属浴； 生化培养箱；恒温摇床；超声破碎仪；生物安全柜 1. 1. 2实验方法 1. 1. 2. 1琼脂糖凝胶电泳所配试剂
10XTBE :108gTris base、55g 硼酸、40ml 0. 5mol/l EDTA (pH8. 0)，定容 IL 6X 上样缓冲液50% 甘油、0· 25% bromophenol blue、。· 25% xylene cyanol FF、 lmmol/L EDTA (pH8. 0)。实验方法
(1)称量0.2g琼脂糖倒入锥形瓶中，加入0.5X TBE buffer 20ml;
(2)微波炉中加热煮沸至琼脂糖完全溶解后，室温放置到50°C左右，加入2μ1DNA Green染色剂，摇勻后倒入两端已封口并且已经放置好梳子的电泳槽中；
(3)带琼脂糖凝固后，取走梳子，将凝胶板放入电泳槽中，根据正、负极放好，将5μ 1 DNA样品与1 μ 1上样缓冲液混勻后加入胶孔中，接通电源，以lOV/cm的电压进行DNA的电泳分析。1. 1. 2. 2质粒的提取与纯化
所配试剂均有质粒提取试剂盒自带
实验方法按千分之一的接种量将含有目标质粒的宿主菌接入到5mlLB培养液中(含有相对应的抗生素，比例为千分之一)，37°C，200r/min培养12-16小时，然后参照Plasmid extraction kit说明书处理菌液，进行质粒的提取及纯化。1. 1. 2. 3扩增目的基因的引物设计
(1)带有前导肽及去掉前导肽的目的基因的PCR引物设计
由于合成得到的基因是由前导肽(70个氨基酸)和蛋白的成熟区(270个氨基酸)构成的，因此首先要研究前导肽对目标蛋白的表达的影响，据此，设计扩增目标基因的引物时， 应分为带有前导肽的扩增引物以及去掉前导肽的扩增引物。引物设计见表1。(2)克隆载体的选择与引物设计和合成
该实施案例中，选用常用的大肠杆菌表达载体pET30a为克隆载体，通过ft~imer软件， 对目标基因进行引物设计(包括酶切位点和保护碱基)，见表1。表1用于扩增目的基因的PCR引物设计
载体上引物下引物酶切位点pET30a5 iGcGGAATTcGGTGCCAATCAAGAGACAATCS 5，GCGAAGCTTTTAATGGTGGTGATGATGGT3 EcoRI+Hindlll
1. 1. 2. 4 PCR反应体系及程序设置 PCR反应体系
5 X DNA polymerase buffer 10 μ 1 (含有 Mg2+) dNTPs (10mmol/L) 4μ 1 Forward primer (50 μ mol/L) 1 μ 1 Reverse primer (50 μ mol/L) 1 μ 1 含有目的基因的重组载体模板 μ (iopg/μ )PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2. 5 U/μ 1) 0. 5 μ 1
加ddH20至总体积为50 μ 1 PCR反应程序(3 Step法，共35个循环)
Step one :98°C预变性 10 sec Step two :55°C退火 5sec_15sec Step three :72°C延伸 Imin 循环全部结束后于4°C保温 1. 1. 2. 5脂肪酶基因的纯化、酶切以及与载体的连接纯化
所配试剂均由Cleanup纯化试剂盒和凝胶回收试剂盒自带
方法由PCR扩增得到的基因通过PCR-Cleanup kit直接进行纯化或者选用DNA extraction kit试剂盒进行割胶回收纯化(方法步骤根据试剂盒自带的protocol进行操作)。酶切
根据所设计的PCR引物的酶切位点进行双酶切反应，同时，将需要连接的质粒也采用同样的内切酶进行双酶切反应。酶切体系(40μ 1) PCR产物或质粒DNA :29μ 1 IOXTango buffer 缓冲液8 μ 1 内切酶1 :1. 5μ 1
内切酶2 :1. 5μ 1
在37°C条件下，酶切体系保温3-4小时。酶切产物纯化
所配试剂均由凝胶纯化试剂盒自带
方法将酶切产物与4. 4 μ IOXloading buffer上样缓冲液进行混合后，进行凝胶电泳，通过割胶回收的方法，分别纯化回收PCR酶切产物与质粒酶切产物。割胶回收纯化方法根据凝胶回收试剂盒自带说明进行。连接
将割胶回收的酶切产物进行电泳后，大致计算浓度，以PCR产物质粒为1:5的浓度进行连接，其中加入0. 5μ 1的T4DNA快速连接酶(5υ/μ 1)以及1 μ 1连接酶缓冲液，最后加 ddH20补足至10μ 1，22°C下连接1小时，以用于下一步的转化。1. 1. 2. 6大肠杆菌BL21普通感受态的制备以及转化所配试剂
CaCl2 溶液60mmol/l CaCl2、15% 甘油(pH7. 2)，121。C 灭菌后 4。C 保存。方法
感受态细胞的制备
(1)挑取细菌单菌落接种到5mlLB培养基中，37°C震荡培养12-16小时；
(2)取2ml培养物接种到200mlLB培养基/500ml三角瓶中，37°C震荡培养基至0D_ 为 0. 3-0. 4 ；(3)将培养物转移到50ml离心管中，冰上放置20min;
(4)4°C、3000rpm离心5min，收集菌体，弃去上清液；
(5)用IOml预冷的CaCl2溶液重悬菌体，4°C、3000rpm离心5min；
(6)用IOml预冷的CaCl2溶液重悬菌体，冰浴30min;
(7)分装100μ 1到印pendorf管中，立即投入液氮中，再于_80°C保存，备用。感受态细胞的转化
(1)准备PCR连接产物以及质粒自连的对照连接产物(该体系中，用ddH20代替PCR产
物)；
(2)取两管100μ 1的感受态细胞，在冰上融化；
(3)将10μ 1的PCR连接产物与质粒自连产物分别加入到感受态细胞中，轻轻用枪混
勻；
(4)冰浴20-40min;
(5)42 °C热击90s，迅速放入冰中，冰浴5min ；
(6)添加ImlLB 培养基，37。C，200rpm 震荡培养 40-50min ；
(7)取200-300μ 1培养液涂布于含有相应抗生素的LB培养基平板上，于37°C培养箱培养30min后，倒置培养过夜。1. 1. 2. 6重组子的鉴定
(1)从转化平板上挑取单菌落接种于5mlLB培养基中，37°C振荡培养6_8小时，进行质粒提取；
(2)根据PCR引物的设计，以相同的内切酶进行酶切(反应体系见上)3小时，将酶切产物进行凝胶电泳，检测目的基因的存在。( 3 )保存阳性克隆，用于今后使用。1. 1. 2. 7目标蛋白的诱导表达所配试剂
lOOmmol/LIPTG (溶于 DMSO 中)；
PBS =NaCl 8g/l, KCl 0. 2g/l, Na2HPO4* 12H20 3. 63g/l, KH2PO4 0. 24g/l, pH7. 4。Tris-HCl 缓冲液50mmol/L Tris-HCl (pH8. 0) 实验方法
(1)将阳性克隆挑取到5ml含抗生素的LB培养基的试管中，培养12-16小时，后以m 的接种量转接于含50ml含抗生素的LB培养基的250ml摇瓶中于37°C进行培养；
(2)待菌液OD600值达到0.5左右时，加入0. lmmol/L的IPTG于16°C条件下诱导16-20 个小时；
(3)次日，离心收集菌体，并用PBS(pH7. 4)进行洗涤，离心后收集菌体，溶于細1的 50mmol/L Tris-HCl (pH8. 0)溶液中，进行超声破碎；
(4)破碎后进行离心(4000rpm，IOmin)，目的蛋白则溶于上清液中，取其中得的10μ 1 与30μ1 4Χ的蛋白质上样缓冲液进行混勻后，进行SDS-PAGE蛋白质电泳。电泳结束后用考马斯亮蓝R-250染色，进行凝胶成像系统查看结果。1. 1. 2. 8 SDS-PAGE 蛋白电泳所配试剂10%APS ； 10%SDS
4X 蛋白质电泳上样缓冲液200mmol/L Tris-HCl (pH6. 8)、8%SDS、0. 04% 溴酚蓝、40% 甘油、400mmol/L DDT, 4°C 保存；
IOX 蛋白质电泳电极缓冲液Tris 6g、Glycine 28. 8g、SDSlOg、pH8. 3，定容 IL ； 30% 胶母液30% Acrylamide.O. 8%bis ； 分离胶缓冲液(pH8. 8) :3. Ommo 1/L Tris ； 浓缩胶缓冲液(pH6. 8) :1. Omo 1/L Tris ；
考马斯亮蓝染色液考马斯亮蓝R-250 1. Og、甲醇500ml、冰醋酸100ml，定容IL ； 脱色液甲醇50ml，醋酸75ml，定容IL ； 分离胶与浓缩胶配方见表1 表1 :SDS-PAGE蛋白电泳中分离胶和浓缩胶的配方
权利要求
1. 一种分离的多肽，其特征在于，所述多肽选自(1)SEQID N0:4、6、8、10、12、14、16、18、20 或 22 所示氨基酸序列；和(2)在(1)所述的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，但至少保留以SEQ ID NO :2的氨基酸序列编号记第48位氨基酸残基为Val，67位氨基酸残基为Ala， 以及311位氨基酸残基为kr，且具有脂肪酶活性的由(1)衍生的多肽。
2.2.根据权利要求1所述的分离的多肽，其特征在于以SEQ ID N0:2的氨基酸序列编号计，(2)所述的多肽至少还保留一个或多个以下位置上的残基第78位的Thr，第113 位的kr，第168位的ftx)，第173位的Arg，第190位的Asn，第240位的kr，和第313位的 Asp0
3.根据权利要求1所述的分离的多肽，其特征在于以SEQID N0:2的氨基酸序列编号计，(2)所述的多肽或者至少还保留一个或多个以下位置上的残基第67位的Asp，第240 位的Ala (或240位的Val，或240位的His)，第311位的Cys, H 313位的His。
4.多核苷酸，其特征在于所述的多核苷酸选自编码权利要求1-3中任一项所述的多肽的多核苷酸和与(1)所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
5.根据权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于所述的多核苷酸编码如SEQID NO 4、6、8、10、12、14、16、18、20 或 22 所示的多肽。
6.根据权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸的核苷序列如SEQ ID NO :3、5、7、9、11、13、15、17、19 或 21 所示。
7.载体，其特征在于所述的载体含有权利要求4-6中任一项所述的多核苷酸。
8.宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求7所述的载体，或含有权利要求4-5中任一项所述的多核苷酸。
全文摘要
本发明涉及生物工程领域，公开了一种分离的多肽、多核苷酸、载体及宿主细胞。多肽选自(1)SEQIDNO:4、6、8、10、12、14、16、18、20或22所示氨基酸序列；和(2)在(1)所述的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，但至少保留以SEQIDNO2的氨基酸序列编号记第48位氨基酸残基为Val，67位氨基酸残基为Ala，以及311位氨基酸残基为Ser，且具有脂肪酶活性的由(1)衍生的多肽。本发明得到的突变基因所编码的脂肪酶具有更高的水解活性以及对高温的耐受性。
文档编号C12N5/10GK102337253SQ20111030918
公开日2012年2月1日 申请日期2011年10月13日 优先权日2011年10月13日
发明者于洪巍, 刘敏, 王丹, 王博, 王珏 申请人:浙江大学