专利名称：利用青霉菌转化岩白菜素为一种特殊含氮衍生物的方法
技术领域：
本发明涉及利用青霉属中具有特殊酶活力的微生物菌种，将岩白菜素(bergenin) 通过微生物转化的方法进行结构修饰为iB) -7- ((6-acety 1-2- (hydroxyimino) -4_met hyl-1, 2-dihydropyridin-3-yl) methyl)3, 4, 8, 10-tetrahydroxy-2-(hydroxymethy 1)-9-methoxy-2, 3, 4, 4a-tetrahydropyrano[3, 2~c] iso chromen-6 (10b H)-one, 艮口 (￡V7-((6-乙酰基-2-(肟基)-4-甲基-1，2-二氢吡啶-3-烃基)甲基)_3，4，8， 10-四羟基-2-(羟甲基)-9-甲氧基-2，3，4，4a-四氢[3，2~c]异苯并吡喃_6 (10b H)-酮的方法。转化产物为(Z )-7-((6-乙酰基-2-(肟基)-4-甲基-1，2-二氢吡啶-3-烃基)甲基)_3，4，8，10-四羟基-2-(羟甲基)-9-甲氧基-2，3，4，4a_四氢[3，2~c] 异苯并吡喃-6 (10b H)-酮。
背景技术：
岩白菜素(bergenin)是一种天然存在的芳香族碳苷，是吡喃葡萄糖基没食子酸的二氢异香豆素衍生物，分子中含有环内酯结构。已发现存在于30多种植物中，是一种丰产易得的天然有效成分。特别是在虎耳草科的岩白菜属(Zfer^^ia)、紫金牛科的紫金牛属C^i/isia)、大戟科的野桐属(Medlotus)植物中含量丰富。在虎耳草科的厚叶岩白菜 {Bergenia crassifolia) Λ Q ^ {β. purpurascens)中禾口紫金牛禾斗的百两金(Ardisia crispa)等植物中，得率高达4.5%。其它很多植物的岩白菜素含量在1%以上。结构命名为 3, 4，8, 10-tetrahydroxy-2-(hydroxymethyl)-9-methoxy-3, 4，4a, 10b-tetrahydropyrano [3，2-c]isochromen-6(2H)-one。在《中华人民共和国药典》中，已经将其收载为镇咳祛痰药，在临床上用于慢性支气管炎。其优点是仅对咳嗽中枢有选择性的抑制作用，毒副作用小，不良反应少，连续使用不产生耐药性。除了此功能外，还有很多已经报道但尚未用于临床的生物活性和药理作用， 例如抗关节炎、抗溃疡、保肝、抗丙型肝炎病毒、抗HIV病毒、防糖尿病、抗心率失常、抑制蛋白酪氨酸磷酸酶IB(FTPlB)、抗心律失常、促进烧伤创面愈合、促进病变组织恢复、杀锥虫、 抗凝血、抗氧化、增强免疫、降血脂等多种作用。岩白菜素在植物中分布广泛，含量高，容易提取分离，价格低廉。但岩白菜素水溶性差，很多活性不很显著，非常有必要进行结构修饰。通过结构改造，发现新的岩白菜素转化产物，可望解决其口服吸收差、生物利用度低、生物活性不高的问题。同时也丰富了活性筛选的化合物库，拓展新的生物活性和药理功能。因此，岩白菜素是理想的天然产物材料和生物转化底物。到目前为止，对岩白菜素的微生物转化研究相对较少，仅见过1例报道， 2005年，Wang等利用真菌/^etfrotos os treat us将岩白菜素转化为二聚体。
发明内容
本发明目的在于提供一种岩白菜素特殊酶化结构修饰的微生物转化方法筛选获得可催化岩白菜素(bergenin)进行特殊酶化结构修饰成为(幻_7_ ((6-aCetyl-2-(hydroxyimino)-4-methyl-l, 2-dihydropyridin-3-yl) methyl)3, 4,8,10-tetrahydroxy-2-( hydroxymethyl)-9-methoxy-2, 3, 4, 4a-tetrahydropyrano [3,2~c] iso chromen-6 (10b H)-one，S卩依)-7-((6-乙酰基-2-(肟基)-4-甲基-1，2-二氢吡啶-3-烃基)甲基)_3， 4，8，10-四羟基-2-(羟甲基)-9-甲氧基-2，3，4，4a_四氢[3，2~c]异苯并吡喃_6 (10b H)-酮的微生物菌株，以便采用微生物转化的方法，获得岩白菜素的特殊转化产物访 )-7- ((6-acetyl-2- (hydroxyimino)-4-methyl-l,2-dihydropyridin-3-yl) methyl)3， 4，8, 10-tetrahydroxy-2-(hydroxymethyl)-9-methoxy-2, 3, 4，4a-tetrahydropyrano[3, 2 ~c] iso chromen-6 (10b H)_one0岩白菜素(bergenin)及其转化产物的分子结构式见
图1。本发明采用具有岩白菜素结构修饰特殊酶活力的微生物菌种接种到培养液中，进行摇瓶发酵培养；发酵中期，向发酵液中加入含有岩白菜素(bergenin)的底物转化液，使岩白菜素(bergenin)通过微生物转化的方法进行特殊的酶化结构修饰成为(幻-7-((6_ acetyl-2- (hydroxyimino)-4-methyl-l, 2-dihydropyridin-3-yl) methyl)3, 4, 8, 10_t etrahydroxy-2-(hydroxymethyl)_9_methoxy_2，3, 4, 4a-tetrahydropyrano[3, 2~c] iso chromen-6 (10b H)-one，即依)-7-((6-乙酰基-2-(肟基)-4-甲基-1，2-二氢吡啶-3-烃基)甲基)_3，4，8，10-四羟基-2-(羟甲基)-9-甲氧基-2，3，4，4a_四氢[3，2~c] 异苯并吡喃-6 (10b H)-酮的方法；转化结束后，去除菌丝体，上清液用有机溶剂萃取，萃取液经浓缩、硅胶层析分离、Sephadex纯化或再经HPLC制备，可得到含有该转化产物的溶液，再将该溶液经浓缩、或低温干燥处理后，可得到的转化产物晶体或粉末。利用青霉属 {Penicillium spp.)菌株转化岩白菜素为转化产物示意图见图1。上述具有岩白菜素结构修饰特殊酶活力的青霉属(Penicilliim spp.)菌种， 购自中国普通微生物保藏管理中心，为皮壳青霉(/^fliciBiws crustosum, CGMCC编号 3. 7142)。上述用于发酵培养的培养液的营养物质没有特别的限制，可以是任何一种适合于该微生物生长的营养介质，如真菌发酵培养液。上述具有岩白菜素结构修饰特殊酶活力的微生物发酵培养条件是J8°C，180r/ min摇瓶振荡或通气、或搅拌通气或管道通气供氧，培养48小时。上述的用于岩白菜素特殊酶化结构修饰的微生物转化的底物溶液，可在有机相中配制，可选有机溶剂为二甲基亚砜，或其他对细胞毒性较小、溶解度较大的有机溶剂。上述的转化发酵液与菌丝体分离，采用过滤分离或离心分离的方法。上述的岩白菜素特殊酶化结构修饰的微生物转化条件转化温度为^°C，180r/ min摇瓶振荡通气、或搅拌通气或管道通气供氧，反应时间96 120小时，转化结束后，将转化液与菌丝体过滤或离心分开，可获得含有转化产物的转化液。在上述含有该岩白菜素转化产物的溶液中加入乙酸乙酯或任何其他可萃取产物的有机溶剂，振荡、萃取，静置或离心分层后，萃取液经浓缩后，经过重结晶，可得到的转化产物晶体；或者萃取液经浓缩后，经硅胶层析分离、Sephadex纯化或再经HPLC制备，可得到含岩白菜素转化产物的溶液，再将含转化产物的溶液经浓缩、或重结晶、或低温干燥处理后，可得到的转化产物的粉末或晶体(纯度> 90%)。岩白菜素的HPLC图、不添加底物岩白菜素的空白对照发酵液的HPLC图、添加岩白菜素的发酵液HPLC图，分别见图2、图3和图4。制得的岩白菜素转化产物各项图谱解析结果如下
ESI MS给出岩白菜素转化产物的准分子正负离子峰分别为 /^ 507 ([M + H]+)和 505 ([M - ΗΓ)，可知其分子量为506。HRESI MS给出的准分子离子峰为507.1398 [Μ + Y^Wm/z 529.1432 [Μ + Na]+和1035. 3194 [2Μ + Na]+，岩白菜素转化产物的 ESI MS谱图和HRESI MS谱图分别见图5和图6。在岩白菜素转化产物的1H NMR谱中，δΗ 3. 70 (3Η, s)处的谱线可认为是OCH3 上的H-12 ；在低场区出现两个质子信号δ H 5. 39 (1Η, d, /=6. 0Hz)和δΗ 5.68(1 d, /=5. 4Hz)可分别认为 3-0H 和 4-0H 上氢质子信号。δΗ 4. 88 (1Η，t，/=4. 8 Hz) ,4. 70 (1H, d, /=15. 0 Hz)、3· 92(1H, d, /=15. 0 Hz)、3· 59 (1H, m)、3.21(lH，m)、3.65(lH，m)、3.85(lH， t, /=9.6 Hz)、4. 91(1H, d, /=10.2 Hz)、3. 40(1H, m)和 3. 83(1H, d, /=9. 6Hz)为岩白菜素碳苷上的特殊信号或是新增片段上的氢信号。δΗ2.08(3Η，s)和2.48(3H，s)为新增片段上的013的信号。δΗ8.45(1Η，s)和7.4(1H，s)可能是连接在苯环上的活泼氢。从岩白菜素转化产物的13C NMR谱，DEPT 90°和DEPT 135°谱确认化合物中有碳苷上的五个 CH 峰(δ c 70. 4，72. 5，73. 6，79. 6，81. 4)和一个 CH2 峰(δ c 61. 9)，一个 OCH3 ( δ。59. 9)，一个 CH 峰(δ。130. 4)，一个 CH2 峰(δ。19. 3)，两个 CH3 ( δ。16. 7， 26. 6) ο 12 个季碳峰(δ。111. 6，113.7，114.9，116.3，118.6，122.3，138.8，145.0， 149.7，161.3，164. 1,202.3)，其中 δ。202. 3 为羰基上的碳峰。结合岩白菜素转化产物的1H NMR和13C NMR中氢和碳的数据，初步确定转化产物为岩白菜素的衍生物，其元素组成和分子式为C23H26O1凡。岩白菜素转化产物的屮NMR、13C NMR和DEPT 90°、DEPT 135°图谱分别见图7、图8和图9、图10。岩白菜素转化产物的1H-1H COSY谱显示δ H 5. 39 — δΗ3. 21，δ Η 5. 68 — δ η3· 65处耦合关系，δ η3· 21和3. 65处的谱线分别为Η-3和Η_4 ；由δ Η 3. 21 — δ Η3· 65 —δ Η3. 85耦合关系，5113.85处的谱线为!1-乜；由δ Η 3. 65 — δ Η3. 85 — δΗ4.91耦合关系，δΗ3. 85处的谱线为H-10b。由δΗ 3. 65 — δ Η 3. 21 — δΗ 3. 59耦合关系，可知 Sh 3. 59 处的谱线为 Η-2 ；由 δ Η 3.42 — δ Η 3. 59和 δ Η 3. 85 — δ Η 3. 59 耦合关系，δ Η 3. 42和3. 85处的谱线为H-11。转化产物1H-1H COSY图谱见图11。在岩白菜素转化产物的HSQC谱中，H-2，H_3，H_4，H-4a, H-IOb, H-Il的相关的碳峰为 δ c81. 4,70. 4,73. 6,79. 6,72. 5,61. 9，可确定为 C_2，C_3，C_4，C_4a，ClOb, C-Il0 转化产物HSQC图谱见图12。结合1H NMR, 13C NMR, DEPT 90，DEPT 135 谱的特征以及 1H-1H COSY 和 HSQC 中的相关关系可以确定 δΗ 3. 59(δε81.4), δΗ 3. 21 ( δ JO. 4)，δΗ 3· 65 ( δ c73. 6)，δΗ 3. 85 ( δ c 79. 6), δΗ4·91(δ。72·5)，δ Η3· 92，4· 70 ( δ c19. 3)，δ Η 3· 70 ( δ。59. 9)分别为 C_2，C-3， C-4, C-4a, ClOb, C-11, C-12 位所连的 H。在HMBC 谱中，季碳峰 δ。138. 8 与 Η-12 相关，归属 δ。138. 8 为 C-9 ； δ H 8. 45 与 C-9，季碳峰 δ c 145. 1,114.9 相关，可归属 δΗ 8. 45 为 10-0Η 上的 H，δ c 145. 1 为 C-10， δ c 114. 9 为 C-IOa ；与 H-IOb 相关的碳峰有 C_2，C_4，C_4a，C-9, C-10, C-IOa, δ c 118. 6， 122. 3，149. 7，164. 1，可归属季碳峰 δ c 118. 6 为 C_6，δ c 122. 3 为 C_7，δ c 149. 7 为 C_8。 转化产物部分HMBC图谱A和B分别见图13、图14和图15。
在进行全面的1H NMR禾口 13C匪R检测的基础上，通过DEPlVH-1H COSY、HSQC和HMBC 等2D NMR技术对该化合物所有的屮和13C NMR信号进行详细的归属(见表1)。表1 转化产物的NMR数据及谱峰归属(DMS0-d6，600 MHz)
权利要求
1.利用青霉菌转化岩白菜素为一种特殊含氮衍生物的方法，所述的方法是将具有岩白菜素结构修饰特殊酶活力的微生物菌种接种到培养液中，进行摇瓶发酵培养；发酵中期，向发酵液中加入含有岩白菜素的底物转化液，使岩白菜素通过微生物转化的方法进行特殊的酶化结构修饰成为依)-7-((6-乙酰基-2-(肟基)-4-甲基-1，2-二氢吡啶-3-烃基)甲基)_3，4，8，10-四羟基-2-(羟甲基)-9-甲氧基-2，3，4，4a_四氢 [3，2-c]异苯并吡喃-6 (10b H)-酮；转化结束后，去除菌丝体，上清液用有机溶剂萃取， 萃取液经浓缩后，经过重结晶，可得到的转化产物晶体；或者萃取液经浓缩后，经硅胶层析分离、Sephadex纯化或再经HPLC制备，可得到含有该转化产物的溶液，再将该溶液经浓缩、 或结晶、或低温干燥处理后，可得到的转化产物晶体或粉末。
2.根据权利要求1所述的利用青霉菌转化岩白菜素为一种特殊含氮衍生物的方法，其特征在于所述的具有岩白菜素结构修饰特殊酶活力的微生物菌种是青霉属 (Mcillium spp.)真菌，或者是任何可使岩白菜素进行特殊酶化结构修饰的微生物或混合微生物。
3.根据权利要求2所述利用青霉菌转化岩白菜素为一种特殊含氮衍生物的方法， 其特征在于所述的青霉属iPenicilliwn spp.)真菌，为菌株皮壳青霉iPenicillium crustosum, ) CGMCC 编号 3. 7142。
4.根据权利要求1所述利用青霉菌转化岩白菜素为一种特殊含氮衍生物的方法，其特征在于所述的用于发酵培养的培养液，是真菌发酵培养液或其他任何适合青霉属真菌或其他能使岩白菜素进行特殊酶化结构修饰的微生物的营养介质。
5.根据权利要求1所述的利用青霉菌转化岩白菜素为一种特殊含氮衍生物的方法， 其特征在于所述的向发酵液中加入含有岩白菜素的转化液，用于岩白菜素特殊酶化结构修饰的微生物转化的底物溶液，是在有机相中配制；有机相为二甲基亚砜，或其他对细胞毒性较小、溶解度较大的有机溶剂。
6.根据权利要求1所述的利用青霉菌转化岩白菜素为一种特殊含氮衍生物的方法， 其特征在于所述转化发酵反应条件为转化温度范围在观 301，160 180 r/min摇瓶振荡通气、或搅拌通气或管道通气供氧，反应时间96 120小时，转化结束后，将转化液与菌丝体过滤或离心分开，可获得含有岩白菜素转化产物的转化液。
7.根据权利要求6所述的利用青霉菌转化岩白菜素为一种特殊含氮衍生物的方法， 其特征在于所述发酵转化液与菌丝体分离，采用过滤分离或离心分离的方法；上清液用有机溶剂萃取。
8.根据权利要求7所述的利用青霉菌转化岩白菜素为一种特殊含氮衍生物的方法， 其特征在于所述的萃取含有岩白菜素转化产物的转化液的有机溶剂为乙酸乙酯，或任何其他可萃取产物的有机溶剂。
9.根据权利要求8所述的利用青霉菌转化岩白菜素为一种特殊含氮衍生物的方法， 其特征在于所述的萃取液，经浓缩后，经过重结晶，可得到的转化产物晶体；或者萃取液经浓缩后，经硅胶层析分离，S^hadex纯化，或再经HPLC制备，可得到含岩白菜素转化产物的溶液，再将该溶液经浓缩、或结晶、或低温干燥处理后，可得到转化产物的粉末或晶体。
全文摘要
本发明涉及利用青霉菌转化岩白菜素为一种特殊含氮衍生物的方法，该项法是将具有岩白菜素结构修饰特殊酶活力的微生物菌种接种到培养液中，进行摇瓶发酵培养；发酵中期，向发酵液中加入含有岩白菜素的底物转化液；转化结束后，去除菌丝体，上清液用有机溶剂萃取，萃取液经浓缩后，经过重结晶，可得到的转化产物晶体；或者萃取液经浓缩后，经硅胶层析分离、Sephadex纯化或再经HPLC制备，可得到含有该转化产物的溶液，再将该溶液经浓缩、或结晶、或低温干燥处理后，可得到的转化产物晶体或粉末。本发明的产物具有比岩白菜素更强的清除DPPH·的能力、抗氧化能力以及对脂质过氧化的抑制效果。
文档编号C12P17/18GK102337308SQ201110308478
公开日2012年2月1日 申请日期2011年10月12日 优先权日2011年10月12日
发明者冉昇, 崔桂友, 朱志雄, 陆广念 申请人:扬州大学