专利名称：一种苦荞麦叶片的遗传转化方法
技术领域：
本发明涉及一种农杆菌介导的植物遗传转化方法，特别是涉及一种农杆菌介导的苦荞麦叶片的遗传转化方法。
背景技术：
荞麦是一种药食同源的植物，有苦荞和甜荞两种。由于苦荞其籽粒、根、茎、叶及花等多种器官中都含有大量黄酮类物质，因而被誉为“降血糖、降血压、降血脂”的三降食品。 随着其营养价值和药用价值的不断发现，苦荞麦植物资源越来越受到人们的青睐。由于苦荞麦植物自花授粉的特点使其在生产育种上人工杂交难以成功，因此目前苦荞麦在育种方面仍未获得重大突破。目前借助发根农杆菌Ri质粒介导植物进行遗传转化的研究已成为近些年的研究热点。发根农杆菌中含有致使植物产生毛状根的Ri质粒，在Vir区基因产物的协助下，Ri 质粒中的T-DNA片段能转移进植物核基因组中，导致转化成功的植物产生大量的毛状根。 毛状根具有生长速度快，不需要添加外源激素，并能提供大量可药用的次生代谢产物的特征。农杆菌Ri质粒上携带的生根基因不仅能使被感染植物部位产生大量的毛状根，而且由产生的毛状根还可以获得再生的转化植株，这些植株可表现出许多稳定遗传的表现变异。目前已有关于发根农杆菌介导的荞麦植物遗传转化方面研究的报道，如黄萱的博士论文《小麦NBS-LRR抗性基因克隆以及基因枪介导的遗传转化和由发根农杆菌介导的苦荞遗传转化》和金红的论文《关于发根农杆菌A4对荞麦的遗传转化》。从这些报道可发现， 目前在由发根农杆菌介导荞麦植物的遗传转化中所采用的外植体只有子叶、茎尖和下胚轴较幼嫩的植物器官。采用植物幼嫩器官作为外植体，虽然因细胞壁较薄，能促使农杆菌的 T-DNA更易进入被转化的细胞中而使其转化成功；但另一方面，由于植物幼嫩器官的细胞分化程度较低，细胞中所产生的次生代谢产物也较低，所以诱导产生的毛状根中的次生代谢产物的含量也较低。
发明内容
本发明的目的在于一种苦荞麦叶片的遗传转化方法，该方法能产生含有大量次生代谢产物的毛状根。为达到上述目的，本发明采用的解决方案由如下步骤构成菌种的活化培养将农杆菌划线接种于YEB固体培养基上培养1 2天后，用接种环挑取生长良好的单菌接入YEB液体培养基中震荡培养1 2天至菌液0D_ = 0. 2 0. 6，所述农杆菌为发根农杆菌Ri 1601，培养温度为25 30°C ； 无菌苗的获得将苦荞种子的种皮剥去，先用75%的酒精消毒30 60s，再用 0. 升汞消毒3 lOmin，然后用无菌水冲洗2 5次后，接种于不加激素的MS培养基上， 在22 28°C、光照强度1000 20001x，、每天光照8 12h的条件下进行培养；遗传转化培养选取叶龄在2 30天、生长状况良好的苦荞麦无菌苗叶片作为外植体，先将外植体接种于预培养基MS+2，4-D 0. 5 4mg · L^+6-BA 0. 1 1. 5mg · L^+NAA 0 Img · L—1+乙磺酸0 Ig · L—1+蔗糖15 50g · L—1中进行0 4天的预培养，然后将其取出放入上述制得的农杆菌菌液中浸染2 18min，使外植体与农杆菌充分接触，取出外植体，用无菌滤纸吸干外植体表面多余的菌液，再转入不加激素的MS培养基上进行0 4 天的共培养，接着再转入含有头孢噻肟钠200 500mg/L的脱菌水中浸洗2 6min，然后用无菌滤纸吸干脱菌水后，将其转接入除菌培养基MS+头孢噻肟钠300 600mg/L+琼脂6 8g/L+蔗糖15 40g/L中进行除菌培养，每隔5-7天转接一次，直到产生大量毛状根。上述不加激素的MS培养基为MS+琼脂6 8g/L+蔗糖15 50g/L。本发明由于采用分化程度相对较高且黄酮类物质含量最高的苦荞叶片作为外植体，因此大大提高了毛状根中次生代谢产物的含量，为苦荞麦有效组分的快速生产提供了一种新的途径。
具体实施方式
实施例1(1)菌种的活化培养将发根农杆菌Ril601划线接种于YEB固体培养基上培养1 天后，用接种环挑取生长良好的单菌接入YEB液体培养基中，于28°C振荡培养1天左右至菌液 OD600 = 0 . 5 ；(2)无菌苗的获得将苦荞种子的种皮剥去，放在超净工作台上，先用75%的酒精消毒40s，再用0. 升汞消毒5min，然后用无菌水冲洗4次后，接种于MS固体培养基上，在 25°C、光照强度12001x，、每天光照IOh的条件下进行培养，获得苦荞麦无菌苗；(3)遗传转化培养选取叶龄在12天左右、生长状况良好的苦荞麦无菌苗叶片作为外植体，先将外植体接种于预培养基MSiZd-DZmg^L-1+6-BA 0. 3mg'L^+NAA 0. Img ·Γ1+ 乙磺酸0. 5g · Γ1+蔗糖30g · Γ1中，在25°C预培养3天，然后将其取出放入上述制得的农杆菌菌液中浸染12分钟，使外植体与农杆菌充分接触，取出外植体，用无菌滤纸吸干外植体表面多余的菌液，再转入培养基MS+琼脂6. 8g/L+蔗糖30g/L上进行2天的共培养，接着再转入含有头孢噻肟钠400mg/L的脱菌水中浸洗5min，然后用无菌滤纸吸干脱菌水后，将其转接入除菌培养基MS+头孢噻肟钠500mg/L+琼脂6. 8g/L+蔗糖30g/L钠中进行除菌培养，每隔5-7天转接一次，培养25天后产生大量毛状根。实施例2将实施例1步骤(3)中所选取的外植体改为叶龄为30天、生长状况良好的苦荞麦叶片，其它步骤同实施例1 ；培养25天后统计毛状根转化率低于实施例1。说明处于不同生长阶段的外植体，在用农杆菌进行遗传转化的过程中，组成器官的细胞所处于的感受态是不同的；通常生长期越长的器官，其细胞的分化程度也就越高，细胞也就越不容易调整到农杆菌T-DNA易于进入的感受状态，因而会使毛状根的转化率较低。实施例3本实施例省去了实施例1步骤(3)中所述的预培养步骤，将从苦荞麦无菌苗上选取的叶片直接浸染到农杆菌液中进行毛状根诱导处理，其它步骤同实施例1，培养25天后统计毛状根转化率明显低于实施例1。说明在农杆菌介导的遗传转化过程中，经过预培养处理可以有效地减轻农杆菌在转化过程中对外植体产生的伤害，并能使外植体细胞调整到适宜农杆菌诱导转化的状态。实施例4
本实施例省去了实施例1步骤(3)中所述的共培养步骤，其它步骤同实施例1，培养25天后统计毛状根转化率明显低于实施例1。说明取消共培养步骤虽然也能产生毛状根，但毛状根转化率较低。
权利要求
1. 一种苦荞麦叶片的遗传转化方法，其特征在于包括如下步骤 菌种的活化培养将农杆菌划线接种于YEB固体培养基上培养1 2天后，用接种环挑取生长良好的单菌接入YEB液体培养基中震荡培养1 2天至菌液OD6tltl = 0. 2 0. 6，所述农杆菌为发根农杆菌Ril601，培养温度为25 30°C ；无菌苗的获得将苦荞种子的种皮剥去，先用75%的酒精消毒30 60s，再用0. 升汞消毒3 lOmin，然后用无菌水冲洗2 5次后，接种于不加激素的MS培养基上，在22 28°C、光照强度1000 20001x，、每天光照8 12h的条件下进行培养；遗传转化培养选取叶龄在2 30天、生长状况良好的苦荞麦无菌苗叶片作为外植体， 先将外植体接种于预培养基MS+2，4-D 0. 5 4mg · L_1+6-BA 0· 1 1. 5mg · I^+NAA O Img -L"1+乙磺酸O Ig 蔗糖15 50g -L"1中进行O 4天的预培养，然后将其取出放入上述制得的农杆菌菌液中浸染2 18min，使外植体与农杆菌充分接触，取出外植体， 用无菌滤纸吸干外植体表面多余的菌液，再转入不加激素的MS培养基上进行O 4天的共培养，接着再转入含有头孢噻肟钠200 500mg/L的脱菌水中浸洗2 6min，然后用无菌滤纸吸干脱菌水后，将其转接入除菌培养基MS+头孢噻肟钠300 600mg/L+琼脂6 8g/L+ 蔗糖15 40g/L中进行除菌培养，每隔5-7天转接一次，直到产生大量毛状根。
全文摘要
本发明公开了一种苦荞麦叶片的遗传转化方法，该方法包括如下步骤(1)将发根农杆菌接入YEB培养基中，制备所需的菌液；(2)将苦荞种子接种于不加激素的MS培养基中获得无菌苗；(3)取无菌苗叶片作为外植体，将外植体通过预培养后，浸入已活化的农杆菌菌液中，使外植体与农杆菌充分接触后，取出外植体转入不加激素的MS培养基上进行共培养，最后转接入含有头孢噻肟钠的除菌培养基中进行除菌培养，直到产生大量毛状根。本发明可大大提高毛状根中次生代谢产物的含量。
文档编号C12N15/84GK102352378SQ20111032438
公开日2012年2月15日 申请日期2011年10月23日 优先权日2011年10月23日
发明者孙雁霞, 张红玉, 彭镰心, 汤有举, 王跃华, 胡一冰, 赵钢, 邬晓勇, 邹亮, 陈燕 申请人:成都大学