专利名称：一种抗玉米矮花叶病RNAi载体的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，具体地说，本发明涉及一种RNA干扰(RNAi)载体，特别涉及一种抗甘蔗花叶病毒引起的玉米矮花叶病的RNAi载体。
背景技术：
甘蔗花叶病毒、Sugarcane mosaic virus, SCMV)属于马铃薯Y病毒属 (/^ij^irm)，在自然界中主要通过蚜虫和种子传播，是国内外甘蔗和玉米等禾本科作物上的重要病毒。SCMV的基因组由一条正单链RNA分子组成，有一个大的开放阅读框(0RF)， 可表达产生一个多肽，然后经翻译切割成10个成熟蛋白。SCMV感染所致的玉米矮花叶病 (Maize dwarf m0Saic，MDM)在我国北方大面积发生，是玉米生产上面临的突出问题。引起我国玉米矮花叶病的SCMV大多属于MDB株系。但近年在山东、河北等地还出现了一个国内外未见报道的新株系，可以侵染我国大多数主栽玉米品种。种植抗病品种是防治玉米矮花叶病最有效的措施。但在培育抗病品种时面临选育周期长、抗病基因匮乏及病毒变异导致的抗病性丧失等问题。利用RNA干扰技术，通过基因工程手段可以在较短时间内获得抗病毒材料。RNA干扰(RNA interference，RNAi ；也称RNA沉默，在植物中也可称为转录后基因沉默)是真核生物体内发生的、基于核酸序列同源性的一种基因表达调控机制。双链RNA (double-stranded RNA，dsRNA)是RNAi起始的关键因子。它首先被Dicer酶降解为3‘-端具有2 nt突出的2H6 nt的小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)，后者整合入 RNA 诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex, RISC),并指导 RISC 对同源 RNA 进行识别和切割，最终导致RISC降解靶标mRNA。dsRNA形成的有效途径之一是将体外构建的反向重复结构(inverted repeats, 顶)转入植株。转入植物的反向重复载体在植物体内转录形成dsRNA后，启动RNAi，有效控制与转基因有同源性的入侵病毒。反向重复结构由一段间隔序列(spacer)连接两段反向互补序列构成，转录后会形成发夹状RNA (hairpin RNA, hpRNA)。hpRNA由茎(stem，是反向互补序列转录的RNA配对形成的双链)和环(loop，是由spacer转录的RNA单链结构)组成。hpRNA中的茎是诱发序列特异性基因沉默的关键部份，茎的长短影响RNA沉默的效率和稳定性，植物中50-1000 bp的dsRNA同源片段均能高效诱发转录后基因沉默，沉默效率接近100%。转化顶获得的抗病植株比例和抗病程度高于转正义或反义基因。RNAi的效率还取决于顶的茎与入侵病毒核酸一致率的高低。转基因与入侵病毒基因组核苷酸一致率越高，则抗病效果越好。植物RNA病毒在自然界中是以准种形式存在， 同一种病毒的基因组可能有一定程度的变异。在构建RNAi载体时，需要针对不同病毒找到最保守的基因，筛选最有效的片断作为靶标。因此如何应用RNA干扰技术来获得抗玉米矮花叶病的植株，就成为了现在亟待解决的问题之一。
发明内容
基于上述的原因，发明人利用在鉴定引起我国玉米矮花叶病的病毒种类和分析其基因组群体变异以及已知SCMV的全基因序列的基础上，筛选出了 SCMV最保守的基因，并在其中找到了诱导RNA干扰最有效的3个片段(CI、OTb和CP)。本发明通过分子生物学技术构建了新的抗玉米矮花叶病RNAi载体(p3301-SCMVCINIblCPRi)。利用该载体可以培育出对我国玉米矮花叶病具有广谱、高效、持久抗性的转基因植株；通过RNAi获得的转基因植株抗病程度高，特异性强。转入植物的反向重复不需要完整病毒基因，避免了翻译成蛋白质可能带来的潜在风险，而且产生的RNA干扰高效持久并能在后代稳定遗传，对于采用RNA干扰技术来获得抗病毒植株的研究，提供了良好的参考借鉴作用。本发明所提供的RNAi载体，发明人将其命名为p3301-SCMVCINIblCPRi，其序列如kq ID No:l所示。其中发明人筛选出了 SCMV最保守的基因，发现了诱导RNA干扰最有效的3个片段Cl、NIb 和 CP，其序列分别如 kq ID No:2, Seq IDID No:4 所示，其中 CI 位于SCMV全序列中的4878-5430 bp, NIb位于全序列的7652-7892 bp, CP位于全序列的 9008-9303 bp，具体如下表
权利要求
1.一种抗玉米矮花叶病RNAi载体，其基因序列如kq ID No: 1所示。
2.—种将权利要求1所述RNAi载体p3301-SCMVCINIblCPRi转化到大肠杆菌中获得的大肠杆菌，其保藏编号为CGMCC NO 43560
3.如权利要求1所述的抗玉米矮花叶病RNAi载体，在转化玉米或水稻或小麦或其他禾本科作物上的应用。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，发明人在鉴定引起我国玉米矮花叶病的病毒种类和分析其基因组群体变异的基础上，筛选出了SCMV最保守的基因，找到了诱导RNA干扰最有效的3个片段(CI、NIb和CP)。本发明通过分子生物学技术构建了新的抗玉米矮花叶病RNAi载体(p3301-SCMVCINIb1CPRi)并转化大肠杆菌，对其进行生物保藏，其保藏编号为CGMCCNO4356。利用该载体可以培育出对我国玉米矮花叶病具有广谱、高效、持久抗性的转基因植株；通过RNAi获得的转基因植株抗病程度高，特异性强。而且转入植物的反向重复不需要完整病毒基因，避免了翻译成蛋白质可能带来的潜在风险，具有重要的应用价值。
文档编号C12R1/19GK102363787SQ20111032611
公开日2012年2月29日 申请日期2011年10月25日 优先权日2011年10月25日
发明者张春庆, 李向东, 贾金磊 申请人:山东农业大学