专利名称：一种用于检测大肠杆菌o157h7的显色培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物检测的培养基，尤其涉及一种用于检测大肠杆菌0157 :H7
的显色培养基。
背景技术：
食品微生物安全是食品安全中的重中之重，肠出血性大肠杆菌(EHEC)0157是能引起人的出血性腹泻和肠炎的一群大肠埃希氏菌，包括了 0157 :H7、0157 匪、026 =HlU 0111 :H8、0125 NM,0121 :H19、045:H2、04 NM,0145:NM、05 NM,091 :H21、0103:H2、0113 H2等血清型的部分菌株。其中以大肠杆菌0157 :H7血清型为代表菌株，是近年来新发现的危害严重的肠道传染性致病菌。大肠杆菌0157 :H7除不发酵或迟缓发酵山梨醇以及编码的β-葡萄糖醛酸苷酶无活性外，其它常见的特征与大肠埃希氏菌基本相似。大肠杆菌0157 :Η7传统的检测方法利用的是常规生化原理，由于与其它肠杆菌如大肠埃希氏菌的生化特征非常相似，在传统山梨醇麦康凯琼脂培养基(SMAC)中选择效果不明显，可疑菌落不易识别，而且当有其它的肠道菌群存在时会影响大肠杆菌0157的检测，给检测技术人员带来极大的工作量与不确定性。随着现代科学技术的不断发展，特别是免疫学、生物化学、分子生物学的不断发展，不少快速、简便、特异、敏感、低耗且适用的大肠杆菌0157 :Η7检测方法，如PCR法、金标试纸法、 免疫法、乳胶凝集试验和DNA探针技术等快速检验方法，已在不断得到扩大应用。然而由于这些方法需要较高的技术且仪器试、剂的成本较高，而且酶联免疫吸附法、乳胶凝集试验等会与大肠杆菌的多种血清型出现交叉反应。相比以显色培养基为基础的特异性显色生化鉴定技术在当前能更好地与传统方法相接轨，这种技术可以把检测、计数和初步鉴别一次完成，大幅度提高检测的速度和准确性，检测成本较低，因此其应用前景广阔。目前国内已有的大肠杆菌0157显色培养基利用的原理为大肠杆菌0157 :Η7不发酵或在2天内不发酵山梨醇以及表达β -半乳糖苷酶，因此在含山梨醇的基础培养基中添加山梨醇及半乳糖苷酶的底物，这种显色培养基中大肠杆菌菌落显示发酵山梨醇的色泽，而大肠杆菌0157 :Η7仍呈现半乳糖苷酶的底物中显色基团的色泽。由于目前发现的大肠杆菌中存在也不发酵山梨醇，β -葡萄糖醛酸苷酶阳性，但0157 :Η7血清也不凝集的菌株，所以存在一定的假阳性。另一方面，肠杆菌中还存在像阪崎肠杆菌这一类的细菌，与大肠杆菌0157 :Η7 一样不发酵山梨醇且半乳糖苷酶阳性，上述原理的显色培养基却不可以把这类菌与大肠杆菌0157 :Η7相区分。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测大肠杆菌0157 :Η7的显色培养基。本发明的所采用的技术方案为
一种用于检测大肠杆菌0157 :Η7的显色培养基，每IOOOmL培养基含有琼脂12 20g、 蛋白胨8 20g、牛肉浸粉3 7g、氯化钠4 7g、山梨醇10 20g、肌醇4 7g、中性
3红0. 005 0. 03g、β -半乳糖苷酶显色底物0. 05 0. 2g、β -葡萄糖醛酸苷酶显色底物 0. 05 0. 3g、异丙基- β -D-硫代吡喃半乳糖苷0. 05 0. 15g、牛胆盐1 5g、亚碲酸钾 1 5mg、头孢克肟0. 01 0. 06mg。优选的，β -半乳糖苷酶显色底物为5-溴-4-氯-3-吲哚- β -半乳糖苷。优选的，β -葡萄糖醛酸苷酶显色底物为5-溴-6-氯-3-吲哚- β -葡萄糖醛酸苷。优选的，用于检测大肠杆菌0157 :Η7的显色培养基，每IOOOmL培养基含有琼脂14g、蛋白胨10g、牛肉浸粉4g、氯化钠5g、山梨醇15g、肌醇5g、中性红O.Olg、 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -半乳糖苷0. lg、5-溴-6-氯-3-吲哚-β -葡萄糖醛酸苷0. 08g、 异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷0. lg、牛胆盐1. 5g、亚碲酸钾ang、头孢克肟0. 04mgo本发明在培养基中添加了山梨醇和中性红，除大肠杆菌0157 :H7外的大肠菌群发酵山梨醇产酸，在PH指示剂中性红作用下显示出红色色泽，而大肠杆菌0157 :H7不利用山梨醇而呈现无色菌落。本发明在培养基中添加了 β-半乳糖苷酶显色底物，大肠菌群在β-半乳糖苷酶作用下分解底物，游离出显色剂，使菌落呈现出显色剂的色泽。本发明在培养基中添加了葡萄糖醛酸苷酶显色底物，可以区分某些不发酵山梨醇的非0157 :Η7的大肠杆菌。非0157 :Η7大肠杆菌在β -葡萄糖醛酸苷酶作用下分解出显色剂，呈现出显色剂的色泽菌落，从而与大肠杆菌0157 :Η7相区分。本发明中β -半乳糖苷酶显色底物和β -葡萄糖醛酸苷酶显色底物是由糖苷类特定结合物和显色基团合成的，显色底物包括ONPG、PNPG, Salmon - Gal, X-Gal或BN-GAL、 8HQ - GalXHE - GaUAliz - Gal和荧光底物MUGal等，由于本发明使用的是固体培养基， 而在固体培养基中ONPG、PNPG或MUGal断裂后的显色终产物会产生大面积扩散，所以这类底物仅适用于液体培养基。本发明采用了 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷(X-Gal)和 5-溴-6-氯-3-吲哚-β -葡萄糖醛酸苷(Magenta- GlcA)，这两种底物在固体培养基中检测半乳糖苷酶及葡萄糖醛酸苷酶的活性比其它显色或荧光底物更有效。本发明在培养基中添加了山梨醇以外的碳水化合物，可以区分样品中的其它与大肠杆菌0157 :Η7相似的不发酵山梨醇，能分解半乳糖苷酶显色底物的肠道菌如阪崎肠杆菌，故可添加阪崎肠杆菌发酵而大肠杆菌0157 :Η7不发酵的碳水化合物——肌醇，鼠李糖，水杨素和纤维二糖，本发明优选肌醇。本发明在培养基中添加了胆盐，可抑制样品中大部分的革兰氏阳性球菌。胆盐包括牛胆盐、猪胆盐、三号胆盐、去氧胆酸钠和混合胆盐，本发明优选牛胆盐。本发明在培养基中添加了抗生素亚碲酸钾和头孢克肟，可抑制样品中部分的革兰氏阴性杆菌如大肠菌群以及容易扩散生长的变型杆菌。本发明的有益效果是
本发明的显色培养基用于检测大肠杆菌0157 :Η7，检测灵敏度高，特异性好，直接根据菌落颜色就可对菌株作出鉴别，检测周期短、可操作性强、适用于处理大通量的样本、易于产业化生产，可对食品和环境中大肠杆菌0157 :Η7进行全面、系统、准确的检测和初步鉴定，为微生物快速检测提供了新的途径。本发明的显色培养基能准确快速地从大肠菌群中鉴别出大肠杆菌0157 :Η7，本发明的显色培养基中添加了山梨醇和肌醇，特点为大肠杆菌0157 :H7不利用而其它肠道菌利用的糖类，添加了 β -半乳糖苷酶显色底物、β -葡萄糖醛酸苷酶显色底物以显色反应来区分目标菌株，观察方便，还添加了胆盐和抗生素，能抑制部分的革兰氏阳性球菌和阴性杆菌及容易扩散生长的变型杆菌。
具体实施例方式一种用于检测大肠杆菌0157 :Η7的显色培养基，每IOOOmL培养基含有琼脂12 20g、蛋白胨8 20g、牛肉浸粉3 7g、氯化钠4 7g、山梨醇10 20g、肌醇4 7g、中性红0. 005 0. 03g、β -半乳糖苷酶显色底物0. 05 0. 2g、β -葡萄糖醛酸苷酶显色底物0. 05 0. 3g、异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷0. 05 0. 15g、牛胆盐1 5g、亚碲酸钾 1 5mg、头孢克肟0. 01 0. 06mg。优选的，β -半乳糖苷酶显色底物为5-溴-4-氯-3-吲哚- β -半乳糖苷。优选的，β -葡萄糖醛酸苷酶显色底物为5-溴-6-氯-3-吲哚- β -葡萄糖醛酸苷。优选的，一种用于检测大肠杆菌0157 :Η7的显色培养基，每IOOOmL培养基含有琼脂14g、蛋白胨10g、牛肉浸粉4g、氯化钠5g、山梨醇15g、肌醇5g、中性红O.Olg、 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -半乳糖苷0. lg、5-溴-6-氯-3-吲哚-β -葡萄糖醛酸苷0. 08g、 异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷0. lg、牛胆盐1. 5g、亚碲酸钾ang、头孢克肟0. 04mgo本发明的显色培养基用于检测大肠杆菌0157 :H7的方法，包括如下步骤
1)制备显色平板每IOOOmL去离子水中加入上述显色培养基除亚碲酸钾、头孢克肟外的原料，搅拌，加热煮沸至完全溶解，待冷至约50°C，加入过滤除菌的亚碲酸钾、头孢克肟，混勻，倒平板，备用；
2)接种培养将样品或含样品的增菌液接种到显色平板上，37°C培养22 ；
3)结果分析若显色平板上出现光滑、略突起、直径1 3_、边缘整齐的蓝绿色或深蓝绿色的菌落，说明该样品存在大肠杆菌0157 :H7，其它肠道菌或被抑制或为显示红色或显示紫红色的菌落。下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限如此。5-溴-4-氯-3-吲哚- β -半乳糖苷、5-溴_6_氯_3_吲哚- β -葡萄糖醛酸苷、 异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷均购自Sigma公司。实施例1
一种用于检测大肠杆菌0157 :H7的显色培养基，每IOOOmL培养基含有琼脂14g、蛋白胨10g、牛肉浸粉4g、氯化钠5g、山梨醇15g、肌醇5g、中性红0.01g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β -半乳糖苷0. lg、5-溴-6-氯-3-吲哚-β -葡萄糖醛酸苷0. 08g、异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG) 0. lg、牛胆盐1. 5g、亚碲酸钾ang、头孢克肟0. 04mgo实施例2
一种用于检测大肠杆菌0157 :H7的显色培养基，每IOOOmL培养基含有琼脂12g、蛋白胨12g、牛肉浸粉3g、氯化钠7g、山梨醇15g、肌醇4g、中性红0. 005g、5-溴-4-氯-3-吲哚- β -半乳糖苷0. 05g、5-溴-6-氯-3- 口引哚- β -葡萄糖醛酸苷0. 3g、IPTG 0. 05g、牛胆盐lg、亚碲酸钾:3mg、头孢克肟0. Olmg0
实施例3
一种用于检测大肠杆菌0157 :H7的显色培养基，每IOOOmL培养基含有琼脂15g、蛋白胨20g、牛肉浸粉7g、氯化钠6g、山梨醇20g、肌醇7g、中性红0. 03g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β -半乳糖苷0. 2g、5-溴-6-氯-3-吲哚-β -葡萄糖醛酸苷0. 05g、IPTG 0. 2g、牛胆盐5g、亚碲酸钾5mg、头孢克肟0. 06mg。实施例4
一种用于检测大肠杆菌0157 :H7的显色培养基，每IOOOmL培养基含有琼脂20g、蛋白胨Sg、牛肉浸粉5g、氯化钠4g、山梨醇10g、肌醇6g、中性红0. 02g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷0. lg、5-溴-6-氯-3-吲哚-β-葡萄糖醛酸苷0. lg、IPTG 0. 15g、牛胆盐3g、亚碲酸钾lmg、头孢克肟0. 03mg。特异性试验
、觀Escherichia coli 0157:H7 NCTC12900, Ε. coli 0157:H7 882364, Ε. co7i0157:H7 ATCC 43895, Ε. co7i0157:H7 ATCC 43888, Ε. co7iATCC8739, Ε. co7i'CMCC (B) 44102, Ε. coliCMCC (B) 44103, Ε. co7i ATCC352 18 , Ε. co7i8099, Ε. coli ATCC25922, Ε. coliCMCC(B) 44113, Klebsiella pneumoniae 丨1备 ^ -57, Enterobacter sakazakii ATCC51329, Citrobacter freundii ATCC8090, Ε. aerogenes CMCC (B) 45103, Ε. cloacae CMCC(B)45301, Salmonella arizona CMCC(B) 47001, Proteus vulgaris CMCC(B)49027 等 18种标准菌株分别制成适当浓度的标准菌悬液(浓度为IO8 109CfU/ml)，分别划线接种到用实施例1显色培养基制成的平板上，37°C培养18 Mh。特异性试验结果见表1，注划线法生长情况用划线生长几个区代表生长的好坏 生长良好——4区，菌落大小正常；生长受抑制——1 3区，菌落偏小或生长少于4区。由表1可知，4株万.co/i 0157:H7均显蓝绿色，为阳性菌，除万.co/i 0157:H7 ATCC 43895受到部分抑制外，其余3株菌均生长良好；对于非目标菌，E. co7iATCC35218, Ε. co7i8099, K. pneumoniae 广临检-57 和 Ε. sakazakii ATCC51329 受抑制较小，但颜色可以与目标菌i .cWi0157:H7相区分，其余杂菌均受抑制。表明本发明的用于检测大肠杆菌 0157:H7的显色培养基具有较高的特异性。
权利要求
1.一种用于检测大肠杆菌0157 :H7的显色培养基，每IOOOmL培养基含有琼脂12 20g、蛋白胨8 20g、牛肉浸粉3 7g、氯化钠4 7g、山梨醇10 20g、肌醇4 7g、中性红0. 005 0. 03g、β -半乳糖苷酶显色底物0. 05 0. 2g、β -葡萄糖醛酸苷酶显色底物0. 05 0. 3g、异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷0. 05 0. 15g、牛胆盐1 5g、亚碲酸钾 1 5mg、头孢克肟0. 01 0. 06mg。
2.根据权利要求1所述的用于检测大肠杆菌0157:H7的显色培养基，其特征在于 β -半乳糖苷酶显色底物为5-溴-4-氯-3-吲哚-β -半乳糖苷。
3.根据权利要求1所述的用于检测大肠杆菌0157:Η7的显色培养基，其特征在于 β -葡萄糖醛酸苷酶显色底物为5-溴-6-氯-3-吲哚-β -葡萄糖醛酸苷。
4.根据权利要求1 3任一项所述的用于检测大肠杆菌0157:Η7的显色培养基，其特征在于每IOOOmL培养基含有琼脂14g、蛋白胨10g、牛肉浸粉4g、氯化钠5g、山梨醇 15g、肌醇5g、中性红0. 01g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β -半乳糖苷0. lg、5_溴-6-氯-3-吲哚-β -葡萄糖醛酸苷0. 08g、异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷0. lg、牛胆盐1. 5g、亚碲酸钾ang、头孢克肟0. 04mgo
全文摘要
本发明公开了一种用于检测大肠杆菌O157H7的显色培养基，培养基含有琼脂、蛋白胨、牛肉浸粉、氯化钠、山梨醇、肌醇、中性红、β-半乳糖苷酶显色底物、β-葡萄糖醛酸苷酶显色底物、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷、牛胆盐、亚碲酸钾、头孢克肟。本发明的显色培养基用于检测大肠杆菌O157H7，检测灵敏度高，特异性好，直接根据菌落颜色就可对菌株作出鉴别，检测周期短、可操作性强、适用于处理大通量的样本，可对食品生产和环境中大肠杆菌O157H7进行全面、系统、准确的检测和初步鉴定，为微生物快速检测提供了新的途径。
文档编号C12R1/19GK102424832SQ201110375648
公开日2012年4月25日 申请日期2011年11月23日 优先权日2011年11月23日
发明者刘云林, 卢勉飞, 吴清平, 容艳芬, 蔡芷荷, 陈佐威 申请人:广东环凯微生物科技有限公司