专利名称：致泻大肠杆菌四重荧光定量pcr检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及一种四重实时荧光定量PCR在同一个反应管内同时检测胃肠炎腹泻患者的粪便标本中致泻性大肠杆菌0157 :H7、0104 :H4血清型的核酸检测方法，可应用于致泻性大肠杆菌引起暴发疫情的实验室应急检测。
背景技术：
引起腹泻的大肠杆菌称为致泻性大肠杆菌，根据毒力因子、致病机理和流行病学特征，通常将致泻性大肠杆菌分为5类，分别为肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠集聚性大肠杆菌(EAEC)以及肠出血性大肠杆菌 (EHEC)。EHEC感染后，患者往往会出现出血性肠炎，表现为腹泻(血便，鲜血样)、腹痛和溶血性尿毒综合征(HUS)。HUS表现为肾功能衰竭、溶血性贫血、血小板减少、血栓性血小板减少紫癜(TTP)，可因肾衰和多脏器受损而死亡，死亡率达3%-5%，近30%的患者会留下严重的后遗症。0157:H7是EHEC的主要血清型，1999年我国苏皖等地暴发了大肠杆菌0157:H7 感染性腹泻，估计2万人感染。2011年德国暴发的疫情是由EHEC 0104 :H4血清型引起，死亡病例M例，其中女性15例。除德国外，奥地利、捷克、丹麦、法国、荷兰、挪威、西班牙、瑞典、瑞士、英国、卢森堡、美国、加拿大等15个国家也报告了输入性EHEC感染病例，部分发展为溶血性尿毒综合征。鉴于致泻性大肠杆菌在公共卫生中的重要性与日俱增，因而在胃肠炎和食物中毒监测中要进行多种腹泻细菌的检测，不仅费时费力而且浪费临床标本与试剂。常规检测以传统培养方法为主，不仅操作繁琐、耗时长、而且容易污染。因此，建立一种能够快速检测出致泻性大肠杆菌的技术对我国应对潜在的致泻性大肠杆菌疫情具有重要的意义。随着分子生物学技术的飞速发展及其在医学研究中的广泛应用，特别是最近几年兴起的荧光定量PCR技术，该方法具有准确性高、重现性好等特点，已广泛用于基因表达研究、病原体检测、SNP分析及基因分型等诸多领域。该方法采用完全闭管检测，省去了对PCR 产物后处理，避免了交叉污染，结果判断由计算机完成，简化了操作步骤，并加强了结果的可靠性。随着荧光定量技术、仪器以及材料科学的发展，荧光定量技术不仅仅在定量上发挥它的优势，而且运用iTaqMan或I1aqMan — MGB探针的5、末端标记上不同的荧光染料(FAM、 HEX等)技术可以进行基因分型、基因突变检测和SNP分析等方面研究。因此，建立关于 0104 :H4和0157 :H7致泻性大肠杆菌的多重荧光定量PCR的快速、准确、灵敏、特异的基因诊断分子生物学方法与诊断试剂盒尤为重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种针对致泻大肠杆菌0157 :H7、0104 :H4四重荧光定量PCR 检测试剂盒及检测方法。该试剂盒由荧光定量PCR反应液、0157标准品、H7标准品、0104 标准品、H4标准品、对照品组成，其中荧光定量PCR反应液包含有PCR反应缓冲液(含氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物、耐热Taq DNA聚合酶等)、特异性上下游引物和探针，其中特异性上下游引物、特异性探针和基因标准品序列分别如下 0157 上游引物-F: 5，- TGGCATGACGTTATAGGCTACAAT -3， 0157 下游引物-R: 5’ - AGCTTGTTCTAACTGGGCTAATCCT -3， 0157 特异性探针-P: 5’ - FAM-ATAGGATGACAAATATCTGCGCTGCT-BHQ1-3， H7 上游引物-F: 5，-GGCGCAGGCTGCTGATT -3， H7 下游引物-R: 5’ -AGCTTCAAAACGTGATGCGTTAGCTG -3， H7 特异性探针-P: 5，- HEX-CAGATTTACCCACATCAGCATG -BHQ1-3' 0104 上游引物-F: 5，- AGGAGTAAACAATGTCAAAGCAAC -3， 0104 下游引物-R: 5，- AAAATCCTTTAAACTATACGCCC-3，
0104 特异性探针-P 5，- R0X-ACTTGGTTTTTTTGTATTAGCAATAAGTGGTG-BHQ2-3， H4 上游引物-F: 5，- GCTGGGGGTAAACAAGTCAA -3， H4 下游引物-R: 5' - CAGAATCAACGACCGCATATT -3' H4 特异性探针-P 5，- CY5-TGTCTTACACTGACACCGCGTCTAACA-BHQ3 -3， 0157基因标准品
TGGCATGACG TTATAGGCTA CAATTATAGG ATGACAAATA TCTGCGCTGC TATAGGATTA GCCCAGTTAG AACAAGCT H7基因标准品
GGCGCAGGCT GCTGATTCAG CTTCAAAACG TGATGCGTTA GCTGCCACCC TTCATGCTGA TGTGGGTAAA TCTGTT 0104基因标准品
TGTCGCGCAA AGAATTTCAA CTTTACTTGG TTTTTTTGTA TTAGCAATAA GTGGTGTCAT TTCAAGTCAG GTTTCTAGGG CGTATAGTTT AAAGGATTTT H4基因标准品
GCTGGGGGTA AACAAGTCAA TTTACTGTCT TACACTGACA CCGCGTCTAA CAGTACTAAA TATGCGGTCG TTGATTCTG
标准品分阴性对照品和阳性对照品，阴性对照品为高压灭菌的DEPC (焦碳酸二乙酯)处理水，阳性对照品为0157、H7、0104和H4的阳性质粒样品。本发明提供的定量试剂盒保存于_20°C，尽量减少反复冻融。本发明试剂盒使用方法如下
1.待测样品核酸提取可按常规方法进行，如采用德国QIAGEN公司的DNA Mini Kit或其它试剂盒，按照试剂盒说明书进行提取；
2.核酸的检测以待测样品DNA为模板，PCR缓冲液为HR Qpcr Master Mix缓冲液，其终浓度为IX，是指缓冲液各组分在反应体系中的终浓度与IXHR Qpcr Master Mix 缓冲液中各组分的浓度相同。通常采用反应体系1/2体积的2XHR Qpcr Master Mix缓冲液。IXHR Qpcr Master Mix缓冲液的组成参见上海辉睿生物科技有限公司的HR Qpcr Master Mix, Code :HR-RT01-50o反应总体积为50μ ,其中 2X qPCR Master Mix25 μ 四种弓丨物(20 μ mol/L)各 1 μ 四种探针 QO μ mol/L) 1 μ ,模板DNA 2-3 μ DEPC水补足50 μ 。在四色荧光定量PCR仪上进行检测，反应参数为95°C5min热启动，然后95°C 10s,55°C 45s，在55°C进行四重荧光检测，共进行40个循环。3.荧光定量结果报告
①致泻大肠杆菌0157、H7、0104和H4探针各自CT值(threshold cycle,每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数)均等于40. 0的标本为阴性，②致泻大肠杆菌0157、H7、0104和H4各探针CT值彡35的标本，检测结果为相应细菌阳性，则待测样品含有致泻大肠杆菌0157、H7、0104和H4型，如其中一个出现荧光检测结果呈阳性，则待检样本中含有阳性荧光对应的靶细菌。③CT值在35 40之间为灰值区域，重做后大于37值为阴性。根据所获得的标准曲线，计算待测标本中细菌量值(拷贝数/ml)。本发明的创新之处是运用实时荧光定量PCR技术，采用细菌特异引物和特异荧光探针，开发研制用于致泻大肠杆菌0157 :H7、0104 :H4群细菌四重荧光定量检测试剂盒。 该发明是通过一个PCR反应，可以从标本中检测出致泻大肠杆菌0157 :H7、和0104 :H4型细菌的存在，比传统的普通PCR和单重荧光定量PCR方法更简便、快速和准确，而且对检测的细菌进行实时准确定量，为临床上疑似该菌感染的患者早期明确诊断，以便及时制定治疗方案，减少死亡率。
图1、荧光PCR法检测致泻大肠杆菌0157的灵敏度；从1至5依次为1000000、 100000、10000、1000、IOOcopy。图2、致泻大肠杆菌0157标准品荧光定量PCR标准曲线。图3、荧光PCR法检测致泻大肠杆菌H7的灵敏度；从1至5依次为1000000、 100000、10000、1000、IOOcopy。图4、致泻大肠杆菌H7标准品荧光定量PCR标准曲线。图5、荧光PCR法检测致泻大肠杆菌0104的灵敏度；从1至5依次为1000000、 100000、10000、1000、lOOcopy。图6、致泻大肠杆菌0104标准品荧光定量PCR标准曲线。图7、荧光PCR法检测致泻大肠杆菌H4的灵敏度；从1至5依次为1000000、 100000、10000、1000、lOOcopy。图8、致泻大肠杆菌H4标准品荧光定量PCR标准曲线。
具体实施例方式下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。实施例一
1材料与方法 1. 1菌株与临床标本
致泻大肠杆菌0157:H7、0104:H4型细菌(菌株经全自动生化仪鉴定及日本生研、丹麦血清凝集)购于中国疾病预防控制中心。临床样本来源于近期患者的粪便标本，样本采集后低温保存并及时运送到实验室。1.2 引物与探针
5从美国的NCBI基因库上下载了世界各地的致泻大肠杆菌0157:H7、0104:H4型细菌基因序列。对其进行了同源性比较，在对应基因组的保守基因区设计特异性引物与Taqman探针，序列如下
0157 上游引物-F: 5，- TGGCATGACGTTATAGGCTACAAT -3，
0157 下游引物-R: 5’ - AGCTTGTTCTAACTGGGCTAATCCT -3，
0157 特异性探针-P: 5’ - FAM-ATAGGATGACAAATATCTGCGCTGCT-BHQ1-3，
H7 上游引物-F: 5，-GGCGCAGGCTGCTGATT -3，
H7 下游引物-R: 5’ -AGCTTCAAAACGTGATGCGTTAGCTG -3，
H7 特异性探针-P: 5，- HEX-CAGATTTACCCACATCAGCATG -BHQ1-3'
0104 上游引物-F: 5，- AGGAGTAAACAATGTCAAAGCAAC -3，
0104 下游引物-R: 5，- AAAATCCTTTAAACTATACGCCC-3，
0104 特异性探针-P 5，- R0X-ACTTGGTTTTTTTGTATTAGCAATAAGTGGTG-BHQ2-3，
H4 上游引物-F: 5，- GCTGGGGGTAAACAAGTCAA -3，
H4 下游引物-R: 5' - CAGAATCAACGACCGCATATT -3'
H4 特异性探针-P 5，- CY5-TGTCTTACACTGACACCGCGTCTAACABHQ3 -3，
弓丨物和探针委托上海辉睿生物科技有限公司合成。1.3细菌定量标准与细菌DNA的提取
细菌DNA的提取采用德国QIAGEN公司的QIAamp DNA Mini Kit，按试剂盒说明书提取， 得到细菌DNA，利用NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer 在^Onm测量细菌DNA的浓度， 从而确定DNA的拷贝数以备用。1. 4荧光RT-PCR反应体系和条件的优化
试剂盒选用上海辉睿生物科技有限公司的HR Qpcr Master Mix, Code =HR-RTO 1-50, 按说明书操作，反应体系为50 μ ，其中2XHR Qpcr Master Mix 25ul，上游与下游引物 (20ymol/L)各 1 μ ，探针(20ymol/L) 1 μ ，模板 DNA 2-3 μ ，DEPC 水补足 50 μ 。反应条件为95°C 5min，然后95°C 10s,55°C 40s，在55°C进行四重荧光检测，共进行40个循环。结果判断选择荧光检测模式FAM、HEX、ROX、CY5，荧光基线调整取3_15个循环的荧光信号平均值，阈值设定以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点，样本呈典型的扩增曲线，判断为阳性。无典型的扩增曲线，判断为阴性。体系的优化试验，在以相同浓度阳性核酸为模板的反应体系中，引物浓度从0. 10 1.00 μ M，探针浓度从0. 10 0. 50 μ Μ，采用矩阵法优选引物和探针的最佳浓度，根据最低Ct值和最高荧光强度增加值(ΔΙ^η)选择最佳引物和探针浓度。1.5荧光PCR特异性、敏感性和重复性试验
选择致泻大肠杆菌0157: Η7和0104: Η4型细菌，提取核酸，用0157、Η7、0104和Η4多重荧光PCR方法进行检测，验证方法的特异性；对已标定拷贝数的0157:H7(2X IO7Copies/ ml)和0104:H4型(2X 107Copies/ml)大肠杆菌梯度稀释后，平行进行荧光PCR反应，比较其灵敏度。此外，对每一个浓度的细菌DNA稀释液作4次重复检测，得到的Ct值计算标准差，验证方法的重复性。2 结果
2. 1荧光PCR反应体系及条件选用上海辉睿生物科技有限公司的HR Qpcr Master Mix, Code :HR-RT01-50，按说明书操作，反应体系为50 μ ，其中2XHR Qpcr Master Mix 25 ul，四种引物(20ymol/L)各 μ ，四种探针(20ymol/L) 1 μ ,模板DNA 2-3 μ ，DEPC水补足50 μ 。在四色荧光定量 PCR仪上进行检测，反应参数为95°C 5min热启动，然后95°C 10s,55°C 45s，在55°C进行四重荧光检测，共进行40个循环。2. 2特异性试验
本发明建立的多重荧光PCR方法对致泻性大肠杆菌0157 H7和0104 H4型具有较好的特异性，近期采集的腹泻患者的粪便标本也检测出阳性反应。而与其他肠道细菌如其它血清型大肠杆菌、阴沟肠杆菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、嗜水气单胞菌、类志贺邻单胞菌、副溶血弧菌、河流弧菌等均无交叉反应。2.3敏感性试验
对已标定拷贝数的致泻性大肠杆菌0157:H7 (lX107Copies/ml)和0104:H4 (1 X 107Copies/ml)核酸分别稀释10、100、1000、10000、100000倍，用荧光PCR方法进行检测，结果荧光PCR方法检测敏感性分别达到1 X 100、1 X 100、1 X 100和1 X 100 Copies/ml。 结果参见图1-8。2. 4 重复性试验
致泻性大肠杆菌 0157:H7 (终浓度为 lXl(fCopies/ml)和 0104:H4 (1 X 107Copies/ml) 混合后按10倍梯度稀释成5个不同的浓度，对每一个浓度的样本作4个重复检测，结果不同核酸浓度各自的检测Ct值标准差在0. 10 0. 35之间，具有较好的重复性(参见表1)。
权利要求
1.一种致泻大肠杆菌四重荧光定量PCR检测试剂盒，由荧光定量PCR反应液、0157标准品、H7标准品、0104标准品、H4标准品、对照品组成，其中荧光定量PCR反应液包含PCR 反应缓冲液、特异性上下游引物和特异性探针，其中PCR反应缓冲液含氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物、耐热Taq DNA聚合酶，特异性上下游引物、特异性探针和标准品的序列分别如下0157 上游引物-F: 5，- TGGCATGACGTTATAGGCTACAAT -3，0157 下游引物-R: 5’ - AGCTTGTTCTAACTGGGCTAATCCT -3，0157 特异性探针-P: 5’- FAM-ATAGGATGACAAATATCTGCGCTGCT-BHQ1-3，H7 上游引物-F: 5，-GGCGCAGGCTGCTGATT -3，H7 下游引物-R: 5’-AGCTTCAAAACGTGATGCGTTAGCTG -3，H7 特异性探针-P: 5，- HEX-CAGATTTACCCACATCAGCATG -BHQ1-3'0104 上游引物-F: 5，- AGGAGTAAACAATGTCAAAGCAAC -3，0104 下游引物-R: 5，- AAAATCCTTTAAACTATACGCCC-3，0104 特异性探针-P 5，- R0X-ACTTGGTTTTTTTGTATTAGCAATAAGTGGTG-BHQ2-3， H4 上游引物-F: 5，- GCTGGGGGTAAACAAGTCAA -3， H4 下游引物-R: 5' - CAGAATCAACGACCGCATATT -3' H4 特异性探针-P 5，- CY5-TGTCTTACACTGACACCGCGTCTAACA-BHQ3 -3， 0157基因标准品TGGCATGACG TTATAGGCTA CAATTATAGG ATGACAAATA TCTGCGCTGC TATAGGATTA GCCCAGTTAG AACAAGCT H7基因标准品GGCGCAGGCT GCTGATTCAG CTTCAAAACG TGATGCGTTA GCTGCCACCC TTCATGCTGA TGTGGGTAAA TCTGTT 0104基因标准品TGTCGCGCAA AGAATTTCAA CTTTACTTGG TTTTTTTGTA TTAGCAATAA GTGGTGTCAT TTCAAGTCAG GTTTCTAGGG CGTATAGTTT AAAGGATTTT H4基因标准品GCTGGGGGTA AACAAGTCAA TTTACTGTCT TACACTGACA CCGCGTCTAA CAGTACTAAA TATGCGGTCG TTGATTCTG。
2.根据权利要求1所述的一种致泻大肠杆菌四重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，对照品分阴性对照和阳性对照，阴性对照为高压灭菌的焦碳酸二乙酯处理水，阳性对照为0157、H7、0104和H4的阳性质粒样品。
3.根据权利要求1所述的一种致泻大肠杆菌四重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒保存于-20°C，尽量减少反复冻融。
全文摘要
本发明提供一种致泻大肠杆菌四重荧光定量PCR检测试剂盒，由荧光定量PCR反应液、O157标准品、H7标准品、O104标准品、H4标准品、对照品组成，其中荧光定量PCR反应液包含PCR反应缓冲液(含氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物、耐热TaqDNA聚合酶等)、特异性上下游引物和探针。本发明通过一个PCR反应，可以从标本中检测出致泻大肠杆菌O157H7、和O104H4型细菌的存在，比传统的普通PCR和单重荧光定量PCR方法更简便、快速和准确，而且对检测的细菌进行实时准确定量，为临床上疑似该菌感染的患者早期明确诊断，以便及时制定治疗方案，减少死亡率。
文档编号C12Q1/06GK102399884SQ201110376158
公开日2012年4月4日 申请日期2011年11月23日 优先权日2011年11月23日
发明者孔海深, 郑书发, 陈晓, 陈瑜 申请人:浙江大学