专利名称：一种水稻干旱诱导表达蛋白、其编码基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及水稻中一种能够准确应答干旱胁迫的蛋白及其编码基因，以及这种基因的调控元件在水稻抗旱中的应用。
背景技术：
干旱等非生物逆境一直是限制作物生长和产量的重要因素，并且随着全球环境恶化、气候异常等变化将日益危害着我国的粮食生产安全。通过超量表达逆境应答过程中的重要基因可以显著提高作物的抗逆性。传统基因工程中超量表达通常利用的是组成型启动子，其缺点是对植物可能产生一定的毒害作用和资源浪费；而诱导型启动子却不同，它可以驱动目标基因只有在植株受到诱导信号刺激后才上升表达，不仅节约了植株细胞内有限的资源，也减轻了目标蛋白对植株可能产生的负面效应，其目标性和专一性更强。通过干旱条件下的水稻转录谱分析，我们获得了一个干旱胁迫后诱导表达的基^LOC_ 0s01g0849000。LOC— 0s01g0849000 ^ Plant lipid transfer/seed storage/trypsin-alpha amylase inhibitor结构域。该结构域多与脂肪转运，种子贮存以及酶蛋白活性抑制相关。植物在处于干旱逆境时，这些蛋白通常表达量上升，减少了脂肪以及蛋白质的消耗，从而帮助植株在逆境中存活更长的时间。对基因0s01g0849000i—劳分析后发现彻似冰拟湘浙基因的启动子属于干旱诱导型启动子，专门在植物体受到干旱胁迫时启动该基因的表达，以抵御干旱逆境。根据这一特性，我们在该启动子3’端连接一个报告基因GUS，在植物受到干旱逆境胁迫时，报告基因便开始表达，经过一种便捷有效的染色方法就可以估量植物水分的缺失，以便及时补救，有效减少甚至避免损失。L0C_ 0s01g0849000受干旱诱导表达的特性，可以应用于水稻抗旱育种，这对于深入研究植物抗旱机制有重大意义。L0C_彻似冰拟^^^的调控元件启动子驱动报告基因的方法更是提供了一种检测植物遭受干旱胁迫程度的手段，具有较高的实际应用价值，应用前景广阔。
发明内容
本发明的目的是提供一个来源于水稻的可应答干旱的基因及改造该基因后的可以报告干旱程度的基因。本发明的另一个目的是提供一种检测植物遭受干旱胁迫程度的方法。本发明所提供的可应答干旱的基因，名称为0s01g0849000，来源于水稻iOryza sativa Lssp. japonica)；是下述氨基酸残基序列之一
1)序列表中的SEQID No:l ；
2)将序列SEQID No :1的氨基酸残基序列经过一至二十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且对植物的生长发育具有调控作用的蛋白质。序列表中的SEQ ID No: 1由118个氨基酸残基组成。编码本发明彻似冰拟湘洲，是下述核苷酸序列之一1)序列SEQID No:2的核苷酸序列；
2)编码序列SEQID No: 1蛋白质序列的DNA ；
3)与序列SEQID No:2限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；
4)在高严谨条件下可与序列SEQID No:2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。上述高严谨条件为用0.1XSSPE(或0.1XSSC)，0.1%SDS的溶液，在65° C下杂
交并洗膜。序列表中的SEQ ID No:2由702个碱基组成，其编码框为自5’端第76位碱基到第432位碱基，编码具有序列表中的SEQ ID No: 1的氨基酸残基序列的蛋白质。本发明所提供的可应答干旱的基因彻似冰拟湘洲的调控元件为该基因的启动子区域，是下述核苷酸序列之一
1)序列SEQID No:3的核苷酸序列；
2)与序列SEQID No:3限定的核苷酸序列具有90%以上同源性的核苷酸序列；
3)在高严谨条件下可与序列SEQID No:3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。上述高严谨条件为用0.1XSSPE(或0.1XSSC)，0.1%SDS的溶液，在65° C下杂交并洗膜。含有本发明基因的重组表达载体、转基因细胞系和工程菌以及扩增该基因中任一片段的引物对均属于本发明的保护范围。本发明还提供一种检测植物遭受干旱胁迫程度的方法。在实际应用中，将的启动子与报告基因Gtt 融合，将该构建LOC_ 0s01g0849000-promoter~gus转化水稻，可以估量植物水分的缺失。上述重组表达载体均可按照常规方法构建。本发明的LOC_ 0s01g0849000是一个抗旱基因，可以在水稻受到干旱胁迫时大量表达，以抵御干旱逆境。而l—的转基因植株可以报告水稻干旱程度。本发明不但提供了一种抗旱基因，更提供了一种检测植物遭受干旱胁迫程度的方法，同时也对深入研究植物抗旱机制及功能有重大意义。本发明的蛋白质及其编码基因具有较高的实际应用价值，应用前景广阔。
图1为野生型水稻在干旱处理和未处理条件下，LOC_ 0s01g0849000基因荧光定量PCR检测结果。图2为野生型水稻和Zi^ 0s01g0849000~vromoter-g\xs转基因水稻在干旱和未处理条件下的GUS染色图。
具体实施例方式下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。所用引物由英骏生物技术有限公司完成，测序工作由上海桑尼生物科技有限公司完成。实施例1.水稻抗旱基因Zi^ 0s01g0849000饱筛1。对水稻进行正常培养，至二级枝梗形成时，停止浇水直至土壤水分含量达到20%_30%，并保持该湿度约一周(5-7天)利用基因芯片比较分析对照植物与被胁迫植物的基因表达谱，根据水稻基因芯片的结果，并与拟南芥中已取得的在类似胁迫条件下生殖器官中基因表达的变化情况比较，初步筛选到一些候选基因。0s01g0849000就是其中之一。以水稻未受干旱胁迫的花期、受到干旱胁迫的花期的总RNA为模板，用AMV反转录酶(TaKaRa)合成cDNA (依据Plant RT — PCR Kit 2. 01 (TaKaRa)的用户手册进行)，用荧光定量PCR试剂盒STOR Premix Ex Taq (TaKaRa)检测对照植物与被胁迫植物中0s01g0849000的表达情况(依据TaKaRa的用户手册进行)。所用5’和3’引物分别为5，-GCCGTGGCCATGACCAT-3， (SEQ ID No:4)和 5，-CACGTGACAAAGGTAACATCAGTTT-3’ (SEQID No:5)。反应按照下列程序进行预变性95°C 3分钟，1个循环；变性95°C 10秒，退火与延伸60°C 30秒，40个循环。对比该基因在未受干旱胁迫的花期和受到干旱胁迫的花期的表达量，我们发现彻似冰拟^^^在受到干旱胁迫的花序中诱导表达(图1)。实施例2. LOC_彻似冰拟湘㈨启动子的克隆。在 Rice Genome Annotation Project 网站(http://rapdb. lab. nig. ac. jp/)查找彻似冰拟湘洲序列，分析该序列，并得到其启动子部分序列。提取水稻总DNA，以水稻总DNA为模板，PCR扩增彻似冰拟湘洲的启动子部分。引物序列分别为5' _GGATCCttcgcatctgtacccaataa_3' (SEQ ID No:6)和 5' _CCATGGgtcgtctgcaactctgag_3'(SEQ ID No:7)。50ul PCR反应体系包含水稻基因组DNAlul，高保真酶KOD plus(TOYOBO) lul，10X 缓冲液 5ul，2. 5uM dNTP 4ul，25mMMg2+2ul, 20uM 的 5，和 3，引物各lul，50%甘油5ul，水30ul。反应条件为94° C预变性2分钟；94° C变性30秒，55° C退火30秒钟，68° C延伸4分30秒，共35个循环。反应结束后，将PCR产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化约3500bp的扩增片段。然后将该片段连至PMD19-T (TAKARA)，经桑尼公司测序正确再经召a H I和AfcoI酶切，克隆到载体pl301中(在L0C_ 0s01g0849000启动子之后下游连接GUS报告基因)，测序验证其正确后得到质粒pl301- L0C— As似冰■■-promoterο实施例3.重组质粒pl301-Zi^ flsiV^^^^^^-promoter转化水稻植株。将重组质粒pl301- L0C_ flsiV^^^^^^-promoter 转化到水稻中。参照 Hiei等(Plant Mol Biol, 1997,35 205 - 218)的方法转化水稻。将质粒 pl301- L0C_0s01g08490000~x>romoter通过电激法转入根瘤农杆菌EHA105中，经筛选获得阳性克隆。将携带质粒 pl301- L0C_ 0s01g0S49000~promoter 的农杆菌EHA105 接种到 5ml 含 100mg/L 卡那霉素的YEB液体培养基中摇菌培养至对数生长期晚期，再1 :100扩大培养到0D600为0.1左右。收集农杆菌菌体并重悬于转染培养基中。按照常规方法浸染水稻日本晴的愈伤组织，经共培养感染、抗性培养基筛选及分化培养基上分化得到潮霉素抗性的阳性苗。待小苗长至IOcm左右时，将小苗移至室外网室种植，收种即得Tl代种子。实施例4.质粒pl301-Zi^ flsiV^^^^^^-promoter转基因水稻植株报告干旱胁迫效果的检测。将得到的转基因水稻Tl代种子正常种植，在水稻二级枝梗形成时，停止灌溉，监测土壤含水量，使之保持在20-30%，持续一周。取下花序浸于gus染液中，于37°C放置Mh，70%乙醇浸泡24h以洗脱杂色，观察经过干旱处理与对照组的花器染色程度。图2即为转基因水稻植株和野生型水稻花序的gus染色结果。未受干旱处理的转基因水稻植株，其花序里报告基因gus的表达水平非常之低，而受过干旱处理的转基因水稻植株，其报告基因却呈现了高度表达，因而证明了 0s01g0849000的启动子为一种干旱诱导型的启动子，在植物受到干旱胁迫后在花器官中诱导表达。同时我们的结果还提供了一种检测植株水分缺亏的方法，即通过便捷有效的染色就可以较为地准确估量植物水分缺失的程度，以便及时补救，有效减少甚至避免损失。
权利要求
1.一种水稻干旱胁迫应答蛋白，其特征在于为下述氨基酸残基序列之一的蛋白质(1)序列SEQ ID No 1 ；(2)将序列SEQID No: 1的氨基酸残基序列经过一至二十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且对植物的生长发育具有调控作用的蛋白质。
2.编码权利要求1所述的干旱胁迫应答蛋白的基因，其特征在于为下述核苷酸序列之(1)序列SEQID No:2的核苷酸序列；(2)编码序列SEQID No: 1蛋白质序列的DNA ；(3)与序列SEQID No:2限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；(4)在高严谨条件下与序列SEQID No:2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的干旱胁迫应答蛋白的基因的调控元件，即该基因的启动子，其特征在于为下述核苷酸序列之一(1)序列SEQID No:3的核苷酸序列；(2)与序列SEQID No:3限定的核苷酸序列具有90%以上同源性的核苷酸序列；(3)在高严谨条件下可与序列SEQID No:3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
4.含有权利要求2或3所述的水稻干旱胁迫应答基因及其调控元件的表达载体。
5.含有权利要求2或3所述的水稻干旱胁迫应答基因及其调控元件的转基因细胞系。
6.含有权利要求2或3所述的水稻干旱胁迫应答基因及其调控元件的工程菌。
7.权利要求2或3所述的水稻花期干旱胁迫应答基因及其调控元件在植物生长发育中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于将所述水稻花期干旱胁迫应答基因的调控元件启动子区域与报告基因Gtt？融合后转化水稻，在受过干旱处理的转基因水稻植株里，其报告基因呈现诱导表达。
全文摘要
本发明属于植物基因工程技术领域，具体为一种水稻干旱诱导表达蛋白、其编码基因和应用。该蛋白是下述氨基酸残基序列之一1)序列表中的SEQIDNo1；2)将序列表中的SEQIDNo:1的氨基酸残基序列经过一至二十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且对植物的生长发育具有调控作用的蛋白质。本发明还提供水稻抗旱基因及建立于此基因调控元件基础上的有效检测植物所受干旱胁迫程度的方法。经检测，该方法具有快速、准确估量水稻植株所受干旱影响程度的特点。本发明为植物缺水检测提供了一种快速、便捷、有效的方法，并为植物抗旱研究及干旱育种提供了一个优质基因，具有较高的实际应用价值，应用前景广阔。
文档编号C12N1/21GK102558323SQ201210000730
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月4日 优先权日2012年1月4日
发明者石金磊, 董爱武, 金菁, 隋鹏飞 申请人:复旦大学