专利名称：一种基于m基因的尼帕病毒荧光rt-pcr检测方法
技术领域：
本发明涉及一种尼帕病毒的荧光RT-PCR检测方法，特别涉及一种尼帕病毒 TaqMan-MGB探针荧光RT-PCR检测方法，属于检验检疫技术领域。
背景技术：
1998年，尼帕病首次暴发于马来西亚，引起猪和人的发病和死亡。病原生态学和流行病学调查发现，狐蝠科的食果蝙蝠是本病的病原-尼帕病毒(Nipah Virus, NiV)的自然宿主，在向动物和人传播疫病过程中起到决定性作用。NiV对蝙蝠不致病，对猪有一定的致病性，而对人的致病力很强，人感染NiV后病死率达40% 70%。因此，NiV被列为最危险的生物安全4级病原微生物。NiV与亨德拉病毒一起同属于副粘病毒科亨尼帕病毒属成员，其基因组全长约 18. 21Λ，含有6个转录单位，依次编码核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、 受体结合蛋白(G)和大蛋白(L)等6个结构蛋白，F和G蛋白是病毒的两个表面糖蛋白。病毒分离是鉴定NiV最重要、最基本的诊断方法，但需在生物安全4级(P4)实验室进行病毒培养。中和试验是MV血清学检测的主要方法，同样MV病毒中和试验也需要P4 级的生物安全实验室。美国CDC使用捕获ELISA来检测特异性抗MV的IgM抗体，澳大利亚动物卫生实验室分别用NiV感染Vero细胞的灭活提取物作为间接EI ISA的抗原来检测血清抗体的效价。目前检测NiV的PCR方法主要有两种，一种是澳大利亚AAHL的RT-PCR， 采用巢式引物扩增病毒基质蛋白的M基因，可用于检测固定组织、新鲜组织、脑脊液中的病毒序列；另一种是美国CDC的RT-PCR，用于扩增NiV的N基因。荧光定量PCR技术是一种新型扩增待检基因的方法，采用“闭管”操作，具有操作简便、结果直观、敏感性高、特异性强、 重复性好、耗时短等优点，还可避免常规PCR操作时EB染色所造成的危害及PCR后处理可能带来的假阳性。法国与马来西亚合作，于2005年报道了针对NiV N基因的荧光RT-PCR 检测技术，该技术中的阳性标准品是用NiV的RNA制备的，也需要在P4级的实验室培养病近年来在柬埔寨和泰国所进行的病原生态学研究显示，两国境内的蝙蝠群均存在一定比例的NiV抗体阳性率。虽然尼帕病在我国尚未出现，但是由于来自周边国家的疫情威胁以及我国东南沿海地区有与NiV原发地相似的生态环境和动物分布，所以尼帕病对我国造成了明显的威胁。本病目前尚无有效的方法进行治疗和预防，相关疫苗尚在研究之中。我国是一个养猪大国，一旦发生猪尼帕病毒病疫情并且没有被及时发现而扩散开来，对我国将产生严重的不良后果。我国目前无本病发生，应加强对进口猪的检疫，防止该病传人我国。因此， 建立MV的监测与诊断技术对于构建预警与应急技术平台防范尼帕病进入我国具有十分重要的现实意义
发明内容
本发明人经过大量研究实验，建立了一种基于M基因的尼帕病毒荧光RT-PCR检测方法，本发明方法准确、快速。本发明通过以下技术方案实现1.合成引物及iTaqMan-MGB探针比对GenBank中公布的12株尼帕病毒基因组M基因序列，选择尼帕病毒基因组M 基因的保守区序列作为PCR扩增的靶序列，通过筛选确定引物对和Taqman-MGB探针的序列为引物 1 5，-GATGGACATCAATCCTTG-3，，引物 2 5，-CTCTCTTGGAACAGAAGG-3，，探针5，-Fam-CTGCTACTCGGCTGATCTCACA-NFQ-MGB-3，；或者为上述引物序列的互补序列；再或者为上述序列同源性大于75%的序列。探针序列的5’端标记荧光发光基团，3’端标记末端连接MGB的非荧光淬灭基团。 标记探针的荧光发光基团可以为FAM、ΤΕΤ、JOE、HEX、NED荧光报告基团的中的任意一种。2.构建阳性对照假病毒采用常规方法人工合成一段包含适合引物及探针序列的尼帕病毒基因组M基因片段，然后通过双酶切、连接，构建插入该基因序列的慢病毒表达载体，再将慢病毒表达载体和包装质粒同时转入包装细胞中，从而瞬时表达慢病毒表达载体的转录子以及包装所需的蛋白，最终获得用于制备标准品或对照品的假病毒。3.建立优化的一步法荧光RT-PCR反应体系RT-PCR反应组份包括1)2X Master Mixwithout UN2)40X MultiScribe3)RNase Inhibitor Mix4)引物5)探针6) RNA 模板7) ddH20反应参数为48°C30min,95°C 10min,95°C 15s,60°C 30s，40 个循环；60°C退火条件下采集荧光信号。本发明的另一个目的是提供一种羊痘病毒通用型TaqMan-MGB探针实时荧光PCR 检测试剂盒，试剂盒包括(1) 一步法荧光RT-PCR反应混合液I(2)荧光PCR反应混合液11(3)阳性对照假病毒(4)阴性对照(5)使用说明书所述一步法荧光PCR反应混合液I为市售的荧光PCR反应混合液；所述荧光PCR反应混合液II为本发明引物和探针的混合物，通过如下方法制备得到使用DNA合成装置合成寡核苷酸引物，用分子筛和快速蛋白质液相层析法(FPLC)纯化后进行氨解处理；合成探针序列并氨解处理后分别在在其5'端标记荧光发生基团(报告基团)&6-FAM amidite, 并在其3'端标记非荧光淬灭基团MGB，以FPLC层析法纯化荧光标记探针，然后用双蒸水溶解纯化的引物和探针，浓度为lOOnmol/L，混勻即成。本发明的优点及特点1本发明方法敏感性、特异性高。经生猪样本检测结果显示，本方法具有较好的特异性和敏感性，对于猪的其他RNA病毒，如猪繁殖障碍与呼吸道病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒和猪脑心肌炎病毒，不产生PCR扩增反应。2.采用一步法荧光RT-PCR方法检测猪样本中的尼帕病毒，快速，整个检测过程在 &内完成，操作简便；3.基于尼帕病毒基因组的M基因，通过序列比对及引物、探针筛选可覆盖已知的尼帕病毒。4.阳性对照样本采用没有感染性的假病毒，性质稳定，无需培养活病毒，具有良好的实验室生物安全性，可模拟真实样本进行质量控制。5.本发明采用新一代Taqman-MGB探针，增强了方法的特异性。
具体实施例方式为了理解本发明，下面结合实施例进一步说明本发明，但不限制本发明。实施例1.样本处理及RNA的提取取生猪产品组织lOOmg，研磨后供提取RNA用。取假病毒200 μ L加入到无RNase的含750 μ L Trizol试剂的EP管中，充分振摇 15s，室温静置5min。加无RNase的氯仿200 μ L，振荡15 30s，室温静置2 3min，4°C、 12000r/min离心15min ；小心吸取上层水相，移至新的EP管中；加未用过无RNase的异丙醇500 μ L，充分混勻，室温静置IOmin ；4°C、12000r/min离心IOmin ；弃上清，加用DEPC水配制的体积分数75%乙醇lmL，振摇，充分洗涤沉淀，4°C、12000r/min离心5min ；弃上清，真空干燥，加5 10 μ L无RNase三蒸水熔解沉淀，备用。取研磨的IOOmg组织做上述相同的处理，备用。2.荧光 RT-PCR 反应按以下要素依次加入反应试剂，建立50 μ L反应体系。
权利要求
1.一种基于M基因的尼帕病毒荧光RT-PCR检测方法，其特征在于选取尼帕病毒基因组M基因的保守区序列作为PCR扩增的靶序列，合成特异性的引物和Taqman-MGB探针对尼帕病毒进行定性检测，其特征在于所述引物对和Taqman-MGB探针序列为NIPHAMP 1 :5’ -GATGGACATCAATCCTTG-3’，NIPHAMP2 :5’ -CTCTCTTGGAACAGAAGG—3，，NIPHAMProbe :5’ -CTGCTACTCGGCTGATCTCACA-3’ ；探针序列的5’端标记荧光发光基团，3’端标记末端连接MGB的非荧光淬灭基团。
2.一种如权利要求1所述的基于M基因的尼帕病毒荧光RT-PCR检测方法，其特征在于弓I物对和Taqman-MGB探针是所述弓|物序列的互补序列。
3.—种如权利要求1所述的基于M基因的尼帕病毒荧光RT-PCR检测方法，其特征在于引物对和Taqman-MGB探针是所述引物序列同源性大于75%的序列。
4.根据权利要求1、2或3所述的一种基于M基因的尼帕病毒荧光RT-PCR检测方法，其特征在于标记探针的荧光发光基团是FAM、ΤΕΤ、JOE、HEX、NED荧光报告基团的其中任意一种。
5.一种尼帕病毒Taqman-MGB探针实时荧光RT-PCR检测试剂盒，其特征在于包含采用权利要求1、2、3或4所述引物和探针制备的部件。
全文摘要
本发明公开了一种基于M基因的尼帕病毒荧光RT-PCR检测方法及其试剂盒，本方法采用一步法荧光RT-PCR方法检测猪样本中的尼帕病毒，操作简便、快速且具有较高的特异性和敏感性；本方法阳性对照样本采用没有感染性的假病毒，性质稳定，无需培养活病毒，具有良好的实验室生物安全性。
文档编号C12R1/93GK102559935SQ20121004302
公开日2012年7月11日 申请日期2012年2月23日 优先权日2012年2月23日
发明者吴绍强, 王乃福, 王建华, 王玉玲, 赵祥平, 陈本龙 申请人:天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心