一个核酸适配子筛选文库的制作方法

专利名称：一个核酸适配子筛选文库的制作方法
技术领域：
本项发明属生物分析与工程技术领域，具体涉及一个自行设计的用于核酸适配子筛选的随机单链寡核苷酸文库及其配套的引物。
背景技术：
核酸适配子(aptamer)是一种生物分子的人工单链核酸配体，通过SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)技术从随机单链寡核苷酸文库中筛选获得。核酸适配子与抗体的功能相似，可用于靶分子的识别，且敏感性和特异性可优于抗体。在两者的制备过程中，核酸适配子在靶标方面有明显的优势。筛选适配子的靶标可以小到无机分子，大到完整的活细胞，甚至组织，而制备抗体的靶标主要为蛋白质，且必须具有免疫原性，还不能有毒。因而两者所针对的靶分子范围相差甚远。不仅如此，核酸适配子的制备过程本身也较抗体更简单、不需要体内过程、耗时更短、可人工合成。此夕卜，从核酸适配子与抗体之间理化性质的差异也可看到核酸适配子的优势，如性质稳定、无免疫原性、分子量较小。因而核酸适配子的筛选与应用已涉及医学的各个领域，包括基础研究、临床诊断、疾病治疗和药物研发等方面。SELEX技术是一种组合化学新技术，自1990年问世以来受到广泛关注，发展迅速。它利用人工合成的大容量随机单链寡核苷酸文库与靶分子相互作用，从中筛选出能与靶分子特异结合的单链寡核苷酸，并借助PCR扩增技术使之指数富集，最终获得能与靶分子高特异性、高亲和力结合的核酸适配子。核酸适配子的SELEX筛选的基本步骤如下设计并合成随机单链寡核苷酸文库及配套的引物；将靶标与文库共孵育，使文库中能与靶标特异性结合的寡核苷酸与靶标形成复合物，分离后者并洗脱寡核苷酸；以洗脱的寡核苷酸作为模板进行PCR扩增，制备出新的单链随机寡核苷酸文库(亚文库)，开始下一轮筛选；通过重复数轮筛选与扩增，能与靶标高特异性和高亲和力结合的寡核苷酸留在文库中并被指数富集；对最后一轮筛选后制备的文库进行克隆、测序，其中长度及两端固定序列与文库相符的寡核苷酸即为核酸适配子；测定各核酸适配子与靶标结合的特异性和亲和力，选出特异性强、亲和力大的核酸适配子应用于靶标的检测分析。核酸适配子筛选过程中所用文库中的单链寡核苷酸两端为固定序列，中间为随机序列。固定序列为引物提供结合部位，便于SELEX筛选过程中进行PCR扩增，富集特异性序列和制备下一轮筛选用的亚文库。随机序列是文库中核酸序列多样性的基础，随机区越长，多样性越丰富。随机区长度一般为30个核苷酸左右，此时文库容量实际上能达到1014_15(理论上304 = I. 1518)，延长随机区可增加文库序列及其分子构象的多样性，但会明显影响PCR扩增时产物的特异性。另外，固定序列的长度则与文库多样性成反比，在总长度一定的情况下，缩短固定序列长度，则可延长随机序列的长度，有利文库有更好的多样性。单链寡核苷酸的一个独特表现是容易形成各种形状的二级结构和三级结构，如发夹、口袋、假结、凸环、G-四聚体(G-quartet)等，通过分子构象上“锁钥”匹配，加上氢键、范德华力等作用，可与靶分子形成稳定的复合物。1014—15的巨大库容所拥有的丰富的寡核苷酸分子构象，被认为可为自然界存在的几乎所有分子找到构象匹配的单链寡核苷酸配体(核酸适配子)。通过SELEX技术筛选靶标的核酸适配子的原理和技术都不复杂，但要成功筛选到理想的核酸适配子却并不简单，其中随机单链寡核苷酸文库序列的设计是关键因素。在SELEX筛选的每一轮中，都要进行一次PCR扩增，以富集能与靶标相对特异结合的单链寡核苷酸序列。一般而言，随机单链寡核苷酸文库在进行PCR扩增时有一个非常独特的现象，就是随着循环次数的增加，各种大小不一的非特异性产物迅速增多，而且目的条带不断减少，从而严重干扰亚文库的制备，甚至导致筛选失败。造成这一特殊现象的原因主要是文库的随机序列的存在，因文库的序列多样性达1014_15，单链寡核苷酸之间的部分碱基局部性相互配对难以避免，引物与某些寡核苷酸之间的错配也难以消除。要减少寡核苷酸相互配对和引物错配，理论上可以缩短随机序列的长度。然而，从文库中筛选能与靶分子构象适配的单链寡核苷酸(核酸适配子)，其前提是文库中的寡核苷酸序列分子构象多样性必须足够，也就是说文库的中间随机序列必须足够长，才有可能形成丰富分子构象。因此，在核酸适配子筛选时的首要问题是设计一个随机序列长度足够的文库，在这个前提下，改善文库的PCR 扩增特性，既能有效获得目的产物，又能有效抑制非特异性产物形成，这是成功筛选到理想的核酸适配子的关键。

发明内容
本发明的目的设计一个PCR扩增效率高且非特异性产物少、多样性丰富的核酸适配子筛选文库，能有效应用于核酸适配子的体外筛选。本发明的技术思路为了保证文库的多样性，设计尽可能短的固定序列和较长的随机序列。根据文库在PCR扩增过程中的特殊性，设计独特的固定序列(引物序列)，使文库的PCR扩增效率高且能有效抑制非特异产物形成。本发明采用PCR引物设计软件分析和调整所拟定的文库和引物的序列，消除能影响PCR扩增的引物二聚体及发卡结构，保证合理的能值。将设计好的文库和引物人工合成后观察其不同类型的PCR扩增特性。将文库应用于肝癌细胞核酸适配子的筛选，验证其实际应用效果。本发明所述的核酸适配子筛选文库的创建方法包括以下步骤。I、拟出文库及引物的核苷酸序列自行拟出一个寡核苷酸文库，两端为19个核苷酸(一般为18 30个核苷酸)的固定序列、中间为40个核苷酸(一般为30个核苷酸)的随机序列，上游引物与文库5'端固定序列相同，下游引物与文库3'端固定序列互补。固定区的核苷酸序列拟定时遵循下列原则G+C含量较高，上下游引物的GC含量相差不大，3'端不出现连续GGG或CCC及A。2、分析拟定的序列并进行必要的调整使用PCR引物设计软件分析所拟定的文库和引物序列，并根据下列参数进行序列调整引物的Tm值接近70°C (最邻近法)；不存在具有实质意义的引物二聚体或发夹结构形成(能值不超过4. 5kcal/mol);引物3'端AG值较低(绝对值〈6. 5kcal/mol)，而Y端AG值较高(绝对值>9. 5kcal/mol )。将满足上述严格条件的序列确定为最终的文库和引物序列。3、文库及引物的PCR扩增特性分析根据最终确定的核苷酸序列人工合成文库和引物，并进行PCR扩增，观察文库在PCR扩增中的特性，并进行必要的反应条件优化。4、文库及引物的实际应用效果验证将文库应用于肝癌细胞的核酸适配子筛选，观察是否能筛选出有应用价值的肝癌细胞特异性核酸适配子。其中上述步骤中所述的PCR引物设计软件为Oligo 6. 71，按软件说明书进行序列分析操作。其中上述步骤中所述的PCR扩增包括对称PCR、不对称PCR和实时荧光定量PCR，文库的PCR扩增特性包括扩增效率、非特异性产物情况，反应条件的优化包括最佳的PCR循环次数、退火温度、不对称PCR扩增时的上下游引物比例等。其中上述步骤中所述的肝癌细胞为体外培养的肝癌细胞株H印G2，其核酸适配子的筛选方法采用细胞SELEX技术。通过上述步骤设计出的核酸适配子筛选文库及其PCR扩增引物，具有以下特定的核苷酸序列。
文库序列5'-ACC GAC CGT GCT GGA CTC T (N40) ACT ATG AGC GAG CCT GGCG-3/。上游引物序列5'-ACC GAC CGT GCT GGA CTC T-3/。下游引物序列5'-CGC CAG GCT CGC TCA TAG Τ-3/。根据上述核酸适配子筛选文库的序列，可通过人工合成或其他生物学技术，制备 端含19个特定核苷酸组成的固定序列ACC GAC CGT GCT GGA CTC T、中间含40个核
苷酸组成的随机序列、3 ^端含19个特定核苷酸组成的固定序列ACT ATG AGC GAG CCTGGC G的随机单链寡核苷酸文库(包括ssDNA和RNA文库)，用于任何靶标的核酸适配子的筛选。根据上述核酸适配子筛选文库的引物序列，可通过人工合成或其他生物学技术，制备序列为 5' -ACC GAC CGT GCT GGA CTC T-3'和5' -CGC CAG GCT CGC TCA TAG T-3'的引物对，采用PCR技术或其他生物技术扩增文库序列，应用于核酸适配子的筛选以及核酸适配子的检测、分析及应用。以上述核酸适配子筛选文库为基础，可对文库两端的固定序列的个别核苷酸进行替换、颠倒、移位，或对其长度进行小幅延长或缩短，或对文库中间的随机序列进行延长或缩短，或对扩增文库的引物作相应的简单改造，然后制备简单改造后的文库和引物进行核酸适配子的筛选、PCR扩增和分析与应用。以上述核酸适配子筛选文库为基础，可随机改变文库中间的随机序列区的核苷酸组成，通过计算机软件模拟寡核苷酸序列的二级结构或三级结构，设计出核酸适配子或改造从本文库筛选出的核酸适配子。可利用上述任何一个原始或简单改造后的文库进行核酸适配子的筛选、分析、改造和应用。本发明的有益效果本发明设计出了一个性能优秀的随机单链寡核苷酸文库。文库具有接近长度下限的短固定序列和较长的随机序列，充分保证了文库中单链寡核苷酸的多样性。文库固定序列(引物序列)的独特设计能使用高退火温度进行PCR扩增，既能有效获得目的产物，又能有效抑制非特异性产物，在对称PCR扩增、不对称PCR扩增和实时荧光定量PCR扩增中均得到证实。本文库及引物应用于肝癌细胞株H印G2的核酸适配子筛选获得成功，进一验证了文库的应用价值。本发明设计出的随机单链寡核苷酸文库，性能优秀，为成功筛选生物靶标的核酸适配子提供了保证。


图I为本文库的对称PCR扩增产物进行12% (W/V)中性聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染色的结果图。退火温度60°C，第广8泳道的循环次数依次为4、6、8、10、12、14、14、14，第7泳道为不加引物的阴性对照，第8泳道为不加文库的阴性对照，M为20bp DNA Ladder。图2为本文库的对称PCR扩增产物进行12% (W/V)中性聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染色的结果图。退火温度72°C，第广8泳道的循环次数分别为4、6、8、10、12、14、16、16，第8泳道为不加文库的阴性对照，M为20bp DNA Ladder。图3为本文库的不对称PCR扩增产物进行12% (W/V)中性聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染色的结果图。第I、泳道的上、下游引物比分别为I : 1、20 1,30 1,40 I、50 1、60 1、70 1、80 UlOO 1，第10泳道为阴性对照，循环次数均为20次，M为20bp DNA Ladder0 图4为本文库的不对称PCR扩增产物进行12% (W/V)中性聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染色的结果图。第广4泳道的上、下游引物比为20 1，循环次数依次为15、20、25、30，第5泳道为阴性对照，M为20bp DNA Ladder。图5 图7为本文库实时荧光定量PCR的扩增结果及其分析图。其中，图5为以倍比稀释的梯度量文库溶液为模板的实时扩增曲线；图6为以倍比稀释的梯度量文库溶液为模板的扩增结果绘制的模板定量标准曲线；图7为以倍比稀释的梯度量文库溶液为模板的扩增产物的熔解度曲线。 图8 图17为以HepG2肝癌细胞为靶标从本文库中筛选出的10个核酸适配子的二级结构模拟图。10个核酸适配子依次命名为API、AP2、AP3、AP4、AP5、AP6、AP7、AP8、AP9、AP10。其中，图8为API的二级结构模拟图；图9为AP2的二级结构模拟图；图10为AP3的二级结构模拟图；图11为AP4的二级结构模拟图；图12为AP5的二级结构模拟图；图13为AP6的二级结构模拟图；图14为AP7的二级结构模拟图；图15为AP8的二级结构模拟图；图16为AP9的二级结构模拟图；图17为APlO的二级结构模拟图。图18 图25为荧光标记的图11 图17命名的核酸适配子与H印G2肝癌细胞孵育后流式细胞仪分析图。其中，图18为HepG2肝癌细胞对照的流式细胞仪分析图；图19为Ap4与H印G2肝癌细胞孵育后流式细胞仪分析图；图20为Ap5与H印G2肝癌细胞孵育后流式细胞仪分析图；图21为Ap6与HepG2肝癌细胞孵育后流式细胞仪分析图；图22为Ap7与HepG2肝癌细胞孵育后流式细胞仪分析图；图23为Ap8与HepG2肝癌细胞孵育后流式细胞仪分析图；图24为Ap9与HepG2肝癌细胞孵育后流式细胞仪分析图；图25为AplO与H印G2肝癌细胞孵育后流式细胞仪分析图。图26 图33为荧光标记的图11 图17命名的核酸适配子与淋巴细胞孵育后流式细胞仪分析图。其中，图26为淋巴细胞对照的流式细胞仪分析图；图27为Ap4与淋巴细胞孵育后流式细胞仪分析图；图28为Ap5与淋巴细胞孵育后流式细胞仪分析图；图29为Ap6与淋巴细胞孵育后流式细胞仪分析图；图30为Ap7与淋巴细胞孵育后流式细胞仪分析图；图31为Ap8与淋巴细胞孵育后流式细胞仪分析图；图32为Ap9与淋巴细胞孵育后流式细胞仪分析图；图33为AplO与淋巴细胞孵育后流式细胞仪分析图。
具体实施例方式以下通过本文库及配套引物的设计、分析和应用的具体过程，对本发明作进一步说明。文库的5'端序列与上游引物相同，3'端序列与下游引物互补。因此，文库的设计可先确定好两端固定序列和随机序列的长度，然后根据两端固定序列的长度拟定上、下游引物的序列，引物序列确定后文库序列也就确定了。文库两端固定序列长些，有利于提闻引物的特异性，但不利于文库的多样性，因此本文库以引物设计的最低要求为前提进行设计，设定两端文库为19个核苷酸。文库中间的随机序列理论上30个核 苷酸即可达到1014_15，但为了获得更好的多样性，本文库设定随机序列为40个核苷酸，通过独特的固定序列设计来降低因更长的随机序列增加引物错配和寡核苷酸之间杂交的可能性。I、上游引物最终确定的序列为 5' -ACC GAC CGT GCT GGA CTC T-3'。Oligo6. 71分析的主要数据如下长度为19-mer, GC%为63. 2%，Tm值为67. (TC ;5' Λ G较高，达-9.5 kcal/mol 以上，3' AG 较低，为-6.1 kcal/mol，总 AG(25°C )为-38. 2 kcal/mol ;没有大于2bp的茎环发夹结构形成；3'端没有二聚体形成。2、下游引物最终确定的序列为 5' -CGC CAG GCT CGC TCA TAG T-3'。Oligo6. 71分析的主要数据如下长度为19-mer，GC%S 63. 2%，与上游引物相同，Tm值为68. 2V;5' AG 较高，达-11. 5 kcal/mol 以上，3' AG 较低，为-5. 8kcal/mol，总 AG(25 °C )为-39. 9 kcal/mol ;没有大于2bp的莖环发夹结构形成；3'端没有二聚体形成。3、上下游引物联合分析01igo 6. 71分析显示，上下游引物之间存在2个能导致延伸的3 '端2bp或3bp匹配的引物二聚体，但能值低，分别-I. 6kcal/mol和-2. 9kcal/mol，对PCR反应无实质性影响，另一个引物二聚体不能引发延伸反应。4、文库序列最终确定的文库序列为5' -ACC GAC CGT GCT GGA CTC T (N40) AGTATG AGC GAG CGT TGC G-3'。Oligo 6. 71分析显示，文库序列所形成的3个二聚体中，2个为3'端只有2bp匹配的二聚体,能值低，分别为-I. 3kcal/mol和-3. 6kcal/mol,另一个二聚体有3bp匹配，但离3'端较远，能值为-4.7kcal/mol，也不能引发延伸反应。有3个连续碱基匹配的发卡结构有4个，但最可能影响PCR反应者其能值只有O. 5 kcal/mol, Tm值只有16°C，对文库的PCR扩增无实质性影响。5、文库的对称PCR扩增特性及条件优化反应总体积20 μ 1，含KPCR缓冲液，
I.25mM MgCl2,0. 145 mM dNTP，Taq DNA 聚合酶 O. 5U，上下游引物各 O. 625 μ M，文库液 2 μ I(拷贝数109)，用灭菌注射用水定容至20 μ I。阴性对照以灭菌注射用水代替文库液。PCR反应条件94°C预变性3min，94°C变性40s，68°C退火延伸90s。退火温度及循环次数依实验目的而定。最后72°C延伸7min。结果显示，文库在较低退火温度时(60°C )，随着循环次数增加，杂带不断增多(图I )，而在高退火温度时(72°C )，杂带不随循环次数增加而增多(图2)。文库具有良好的扩增效率，在循环次数为4时目的条带就很浓，目测达到最大量，引物被耗尽(图1、2)，当循环次数增加，低退火温度条件下目的条带不断减少(图I )，而高退火条件下目的条带不减少但也不增加(图2)。本文库固定序列设计中有意将GC的百分比提闻到63%左右,籍此可以大幅度提闻退火温度，既使对称PCR扩增中的非特异性产物能很好地被抑制，又能保持高扩增效率，可以很好满足SELEX筛选过程中制备文库的双链产物。6、文库不对称PCR扩增特性及条件优化反应总体积20μ 1，含rPCR缓冲液，I. 25mM MgCl2,0. 145mM dNTP，Taq DNA 聚合酶 O. 5U，文库液 2μ I (拷贝数 109)，上游引物浓度O. 625 μ Μ，下游引物根据实验目的调整，灭菌注射用水定容至20 μ I。阴性对照以灭菌注射用水代替文库液。
PCR反应条件94°C预变性3min，94°C变性40s，68°C退火及延伸90s，最后72°C延伸7min。循环次数据实验目的而定。结果显示，不对称PCR扩增文库随上下游引物比增大，单、双链产物不断减少，20 I时产物量最多(图3);不对称PCR扩增的效率低于对称PCR扩增，2(Γ25个循环时，单链产物才接近饱和状态(图4)。另外，本文库不对称PCR扩增有良好的特异性，只有在高循环次数时才有非特异性产物形成，低于20个循环时无明显杂带。通过条件优化，本文库很容易通过不对称PCR扩增出单链产物，便于SELEX筛选过程中制备出满意的亚文库。7、文库实时荧光定量PCR扩增特性以梯度稀释的文库液为模板，观察实时荧光定量PCR能否准确定量文库溶液。反应总体积50 μ 1，其中含 2XEvaGreen qPCR Master Mix 25 μ 1，上、下游引物各lOpmol，文库溶液5μ I (含倍比稀释的单链寡核苷酸ΙΟ9、108、IO7UO6个拷贝)，加无菌去离子水定容至50 μ 1，无菌石蜡油20 μ I封闭反应管。PCR反应条件94°C预变性3min，94°C 40s、68°C 90s、20 次热循环。结果显示，以倍比稀释的文库液为模板进行实时荧光定量PCR，其CT值与模板浓度有良好的一致性(图5)，能绘制出符合要求的标准曲线，相关系数r=0. 9913 (图6)，熔解度曲线显示扩增产物均一性好，无副产物形成(图7)。表明以退火温度68°C进行实时荧光定量PCR，能稳定、可靠地进行模板定量，可用于SELEX筛选过程中所涉及的文库定量。8、文库的实际应用效果通过筛选肝癌细胞株HepG2核酸适配子对文库的实际应用效果进行考察。人工合成上述文库和相应的引物各2 0D，用杜氏磷酸盐缓冲液(D-PBS)将文库和引物配制成浓度为lOpmol/μ I的溶液备用。常规体外培养H印G2肝癌细胞，取I X IO6个肝癌细胞与文库溶液4°C孵育lh，常规离心沉淀细胞，收集上清液备测。用D-PBS洗涤细胞沉淀2次后重悬细胞，95°C加热IOmin洗脱与细胞结合的寡核苷酸并进行不对称PCR扩增，将扩增产物进行含7M尿素的8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，GelRed染色，切胶回收并纯化单链DNA产物作为下一轮筛选的亚文库。采用实时荧光定量PCR测定上清液和亚文库的单链寡核苷核酸浓度。计算每轮筛选的结合率(结合率=上清液中核酸的测定量/投入反应的文库量X 100%)。重复进行上述孵育、分离、洗脱、扩增、纯化过程，当结合率连续两轮不再升高时停止筛选。同时，随筛选轮数增加，文库与细胞的量比不断增大，以增加筛选的严谨性。当肝癌细胞筛选结束后，再以健康人外周血淋巴细胞为靶标进行2轮反向筛选(其过程与用肝癌细胞筛选相同，但回收纯化并扩增上清液中的核酸，弃去与淋巴细胞结合的核酸)。取反向筛选结束后所制备的亚文库进行对称PCR扩增，将扩增产物送生物公司进行克隆及测序。将测序结果与文库的核酸序列进行比对，其中长度和两端固定序列与文库相同、中间的随机序列各异者确定为核酸适配子。以RNA Structure 4. 6软件对各核酸适配子的二级结构进行模拟分析。选取二级结构各异的核酸适配子进行人工合成，并5'端标记异硫氰酸荧光素(FITC)，并分别与H印G2肝癌细胞及淋巴细胞进行孵育，流式细胞仪测定阳性细胞率。结果显示，经过10轮筛选，文库与!fepG2细胞的结合率由3. 46%上升为49. 13%，表明能与HepG2细胞结合的单链寡核苷酸得到较大程度的富集。对最后一轮筛选后所制备的亚文库进行克隆及测序，分离出10个核酸适配子，分别命名为Apf 10。二级结构分析显示Apf3、Ap7呈高度相似的大环状结构，其余核酸适配子呈各不相同的二级结构(图8 图17)。4个大环状结构的核酸适 配子中选取Ap7为代表与其他核酸适配子一起进行后续分析。流式细胞仪分析结果显示，核酸适配子ΑρΓ Ο与HepG2肝癌细胞作用后阳性细胞率分别为 52. 21%,61. 90%,40. 01%,63. 19%,38. 60%,61. 64% 和 47. 19%(图 18 图 25)，是淋巴细胞阳性率的4. 15,4. 82,4. 05,15. 08,10. 00,13. 70和2. 22倍(图26 图33)。上述结果显示，使用本文库成功筛选出肝癌细胞的核酸适配子。
权利要求
1.一个核酸适配子筛选文库，其特征在于文库及其PCR扩增引物具有特定的核苷酸序列 文库序列:5' -ACC GAC CGT GCT GGA CTC T(MO)ACT ATG AGC GAG CCT GGC G-3' 上游引物序列:5' -ACC GAC CGT GCT GGA CTC T-3' 下游引物序列5' -CGC CAG GCT CGC TCA TAG T-3'。
2.根据权利要求I所述的核酸适配子筛选文库，其特征在于通过人工合成或其他生物学技术，制备5'端含19个特定核苷酸组成的固定序列ACC GAC CGT GCT GGA CTC T、中间含40个核苷酸组成的随机序列、3'端含19个特定核苷酸组成的固定序列ACT ATGAGC GAG CCT GGC G的随机单链寡核苷酸文库，用于任何靶标的核酸适配子的筛选。
3.根据权利要求I所述的核酸适配子筛选文库，其特征在于通过人工合成或其他生 物学技术，制备序列为 5' -ACC GAC CGT GCT GGA CTC T-3'和 5' -CGC CAG GCT CGC TCATAG T-3'的引物对，使用PCR技术或其他生物技术扩增文库序列，应用于核酸适配子的筛选以及适配子的检测、分析及应用。
4.根据权利要求I所述的核酸适配子筛选文库，其特征在于对文库两端的固定序列的个别核苷酸进行替换、颠倒、移位，或对其长度进行小幅延长或缩短，或对文库中间的随机序列进行延长或缩短，或对扩增文库的引物作相应的简单改造，然后制备简单改造后的文库和引物进行适配子筛选、PCR扩增和适配子分析与应用。
5.根据权利要求I所述的核酸适配子筛选文库，其特征在于随机改变文库中间的随机序列区，通过计算机软件模拟寡核苷酸序列的二级结构或三级结构，设计出适配子或改造从本文库筛选出的适配子。
6.根据权利要求1、2、3、4或5所述的核酸适配子筛选文库，其特征在所述的核酸适配子筛选文库为ssDNA文库或RNA文库。
7.利用权利要求f5项中所述的任何一项进行适配子的筛选、分析、改造和应用。
全文摘要
一个核酸适配子筛选文库，属生物分析与生物工程技术领域。具有以下特定的核苷酸序列文库为5′-ACCGACCGTGCTGGACTCT(N40)ACTATGAGCGAGCCTGGCG-3′；上游引物为5′-ACCGACCGTGCTGGACTCT-3′；下游引物为5′-CGCCAGGCTCGCTCATAGT-3′。本文库具有接近长度下限的短固定序列和较长的随机序列，充分保证了文库中单链寡核苷酸的多样性；文库固定序列(引物序列)的独特设计能使用高退火温度进行PCR扩增，既能有效抑制非特异性产物，又不影响扩增目的产物，在对称PCR扩增、不对称PCR扩增和实时荧光定量PCR扩增中均得到证实。本发明设计出的随机单链寡核苷酸文库，性能优秀，为成功筛选生物靶标的核酸适配子提供了保证。
文档编号C12N15/10GK102732972SQ201210045270
公开日2012年10月17日 申请日期2012年2月27日 优先权日2012年2月27日
发明者吕农华, 张吉翔, 张慧卿, 张焜和, 张贝, 方念, 谭新颖, 邬芳玉 申请人:南昌大学