专利名称：双歧杆菌原生质体的制备和转化方法
技术领域：
本发明涉及双歧杆菌原生质体制备及再生的优化条件，利用PEG融合转化外源基因或载体，尤其涉及双歧杆菌在基因工程中的应用。
背景技术：
双歧杆菌(Pifidobacteria)是人体重要的肠道益生菌之一，对人体健康起重要作用，可制备成治疗性药物和功能食品。近年来，国内含双 歧杆菌活菌的制剂及食品发展迅速，双歧杆菌产品已投入市场。在国外，含双歧杆菌的食品也十分流行，特别是在日本、欧洲和北美。然而，由于双歧杆菌的细胞壁较厚，导致了双歧杆菌的基因操作非常困难，并限制了其在功能食品和药物中的应用。制备双歧杆菌的原生质体可以解除遗传物质交流的最大屏障细胞壁，它可直接接受外源DNA、质粒、病毒后表达外源基因，提高转化效率。1990，Ishii等人首次用蛋白酶K，α-淀粉酶，溶菌酶等制备了双歧杆菌的原生质体，其回复率达到了 10%。1992，Kot用溶菌酶和蛋白酶联合酶解得到嗜热双岐杆菌原生质体，但是未成功回复。2004年张莉滟等人利用变溶菌素对双歧杆菌原生质体的制备进行了研究，虽然其生成率达到90 %，然而并未研究其回复及转化。原生质体技术的关键是细胞壁的消化，以形成大量原生质体,并使原生质体能高频率的再生细胞壁，恢复到正常细胞状态。双歧杆菌是严格厌氧的细菌，如果处理时间过长，即使其原生质体的生成率再高，也会因为长时间处于有氧的条件下而死亡，导致不能再生。迄今为止，还没有双歧杆菌原生质体的回复率和转化率方面的研究。由于双歧杆菌的特殊细胞壁结构，目前双歧杆菌的转化研究很少。1994，Missich等人首次构建了大肠杆菌-双歧杆菌的穿梭载体，实现了长双歧杆菌的电击转化。之后Argnani, Rossi和kim等人分别尝试改进了双歧杆菌的电击转化条件,但是其电击转化的效率依然非常低，最高 7· 5X 102CFU/Pg DNA0 聚こニ醇(polyethylene glycol, PEG)有不同聚合度产物，相对分子质量为100(Γ6000的PEG均可用作促融剂。PEG可以使原生质体的膜电位降低，原生质通过钙离子交联促进凝聚。另外，由于PEG的脱水作用，扰乱了分散在原生质膜表面的蛋白质和脂质的排列，提高了脂质颗粒的流动性，使DNA分子容易在细胞表面吸附，提高细胞对DNA分子的摄入。目前，还没有应用PEG转化双歧杆菌的研究。
发明内容
本发明的目的之ー是提供ー种双歧杆菌原生质体的制备方法，该方法步骤简单，具有较高的生成率，并且，通过该方法制备的原生质体通过进一歩的操作，可具有较高的再生率。实现上述目的的技术方案如下
ー种双歧杆菌原生质体的制备方法，包括以下步骤(1)将双歧杆菌接种到MRS琼脂培养基上，厌氧培养；
(2)从MRS琼脂培养基上挑单菌落，接种于MRS液体培养基中，厌氧培养；
(3)将上述培养后的MRS液体培养基以2.5-3. 5% (v/v)的接种量转接于新鲜的MRS液体培养基中，36— 38で，厌氧培养18-20 h;离心收集菌体，用SMM溶液重悬；
(4)加变溶菌素至终浓度为4.5—5. 5 mg/L，36-38°C酶解，酶解时间为25 — 35分钟；酶解结束后重悬于SMM溶液中，得到双歧杆菌原生质体。优选地，所述SMM溶液为含有O. 015 — O. 25 M/L4-羟こ基哌嗪こ磺酸、O. 9 — I. ImM/L氯化镁、O. 45 一 O. 55 M/L棉子糖的水溶液。优选地，步骤(I)和步骤(2)中厌氧培养的温度分别为36_38°C，时间分别为22_26h0
优选地，步骤(3)中将上述培养后的MRS液体培养基以3% (v/v)的接种量转接于新鲜的MRS液体培养基中，37で，厌氧培养19 h;离心收集菌体，用SMM溶液重悬；步骤(4)中加变溶菌素至终浓度为5 mg/L，37°C酶解，酶解时间为30分钟；酶解结束后重悬于SMM溶液中，得到双歧杆菌原生质体。本发明的另ー目的是提供ー种双歧杆菌原生质体的再生方法。实现上述目的的技术方案如下
ー种双歧杆菌原生质体的再生方法，包括以下步骤，
(O用预冷的SMM将上述制备的双歧杆菌原生质体充分重悬,将原生质体悬液涂布于双层再生培养基上，36-38で培养23 — 25 h。本发明的另ー目的是提供ー种双歧杆菌原生质体的转化方法。实现上述目的的技术方案如下
ー种双歧杆菌原生质体的转化方法，包括以下步骤
(1)构建穿梭表达载体；
(2)在上述制备到的双歧杆菌的原生质体中加入冰预冷的穿梭表达载体；
(3)加入40 - 45 °C预热的 38 — 42% 的 PEG6000 溶液，40 — 45°C融合 8 — 12 min ；立即加入SMMP溶液洗涤2遍，所述SMMP溶液为液体再生培养基与SMM溶液体积比为2 —4:1的混合溶液；
(4)再加入SMMP复苏O.8 — I. 2小时；复苏之后将菌液涂布在氨苄青霉素抗性的固体再生培养基上培养2-3天，得到转化后平板上的双歧杆菌菌落。优选地，该转化方法中所述SMMP溶液为液体再生培养基与SMM溶液体积比为3:1的混合溶液。步骤(4)中，所述固体再生培养基中的氨苄青霉素的浓度为24 — 26Pg/mL。步骤(3)加入42で预热的浓度为40%的PEG6000溶液，42°C融合10 min ;立即加入SMMP溶液洗涤2遍。本发明提供了ー种双歧杆菌原生质体的制备、再生和转化的方法，利用变溶菌素处理双歧杆菌，并优化了双歧杆菌原生质体的制备和再生的条件，在此基础上，利用PEG促融的作用原理，优化出转化效率较高的双歧杆菌原生质体的转化方法。本发明所述的双歧杆菌原生质体的制备、再生和转化,具有原生质体的生成率高(达到81 %以上)，再生率高(48%以上)、可成功导入外源基因的等特点。本发明所述的双歧杆菌原生质体的制备和转化系统的建立，实现了穿梭表达载体的融合转化，提高了双歧杆菌转化的成功率，转化效率为2. 3 X IO3CFU^g DNA。本发明的优点是本发明制备的双歧杆菌原生质体，可高频率的再生细胞壁，即较高的生成率和再生率,并提高了外源DNA导入的成功率，从而建立了双歧杆菌原生质体的转化系统。本发明为双歧杆菌基因操作奠定了基础。
图I为不冋培养时期制备双歧杆囷原生质体结果；
图2为酶解温度对原生质体形成的影响结果；
图3为变溶菌素酶浓度对原生质体形成的影响结果；
图4为酶作用时间对原生质体形成的影响结果；
图5为渗透压稳定剂对制备原生质体的影响结果；
图6为原生质体形成的过程 图7为pBEX转化后平板上的双歧杆菌；
图8为PCR筛选pBEX阳性转化子，其中，I :双歧杆菌空对照组；2 :双歧杆菌阳性转化子，目的条带为IOOObp左右的复制子片段；3 :阴性空白对照；M :wide range marker500-15000 bp ；
图9为pBEX阳性转化子质粒提取及酶切验证；
图10为pDG-Hup转化后平板上的双歧杆菌；
图11为菌落PCR筛选pDG-Hup阳性转化子，其中，1，2，3 :双歧杆菌阳性转化子，目的条带为340bp左右的启动子片段；M DL2000 ；
图12为pDG-Hup阳性转化子质粒提取及酶切验证；其中，I: λ HindIII，2:pDG7双酶切(BamHI Sal I)，3 :pDG_Hup 双酶切(BamHI Sal I)，4:DL2000.
图13合成的启动子序列(共283 bp) (SEQ ID. NO. 5)
具体实施例方式实施例I :双歧杆菌原生质体的制备和再生
I.原生质体的制备
将长双杆菌NCC2705从-70 °C保藏的甘油管转接到常规的MRS琼脂培养基上(MRS琼脂培养基蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，Tween-80 I g，K2HPO4 2 g，CH3COONa · 3H20 5 g,枸櫞酸三铵 2 g, MgSO4. 7H20 0. 2 g, MnSO4.H2O 0. 05 g，琼脂 15 g,葡萄糖20 g,加蒸懼水至1000 mL,调pH 6.2- 6.4,121 °C高压灭菌15 min),37°C厌氧培养24 h。从平板上挑ー单菌落，接种于5 mL MRS液体培养基(MRS液体培养基成分同上不加琼脂)中，37で厌氧培养24 h;以3% (v/v)(原培养菌悬液体积新鲜培养基体积)的接种量转接于新鲜的25 mL MRS液体培养基中，37で，厌氧培养19 h;离心收集菌体，用10mL SMM (Hepes (4-羟こ基哌嗪こ磺酸)O. 02 M/L、氯化镁I mM/L、棉子糖O. 5 M/L)重悬；加变溶菌素至终浓度为5mg/L，37°C酶解，每隔5 min取一次样，镜检观察原生质体形成情况，酶解时间为30分钟；酶解结束，加入10 mL SMM洗涤一次后重悬于SMM中备用。2.原生质体的再生
用冰预冷的SMM将原生质体充分重悬，取200 μ L原生质体悬液涂布于双歧杆菌常用的双层再生培养基平板(常规的再生固体培养基胰胨5.0 g，酵母提取物5.0 g，半胱胺酸盐酸盐 O. 4 g,葡萄糖 5. O g, KH2PO4 2. 5 g, CH3COONa 10. O g, CaCl2 · 2H20 5. O g,MgCl2 · 6H20 5. O g，agar 15. 0 g，棉子糖 0.2 -0.3M/L，调 pH 6.5，115 °C 高压灭菌 20 min。再生半固体培养基配制方法同再生固体培养基，但琼脂成分仅含0.6%。液体再生培养基配制方法同再生固体培养基，但不含琼脂成份。双层再生培养基先将再生固体培养基倾入平皿作为底层，再将再生半固体培养基成分倾入底层上即可)，37で培养24 h后计数。同时取等量蒸馏水稀释原生质体作对照，以消除因菌体残片形成菌落所产生的误差。再生率计算公式为原生质体的再生率(％) =(C-B)/(A-B) X 100% C :再生菌落数，即酶解混合液经高渗溶液稀释后涂布双层再生培养基上生长的菌落数。本发明双歧杆菌原生质体在制备过程中，按照上述制备方法，考察了菌体生长期、变溶菌素浓度、酶解时长、酶解温度、滲透压稳定剂对原生质体形成及再生的影响(即其它參数不变，然后分别变动菌体生长期、变溶菌素浓度、酶解时长、酶解温度、滲透压稳定剂參数)。原生质体形成率的測定将酶处理前的细胞和酶处理后的原生质体分别用无菌蒸馏水作适当稀释，然后分别涂布在固体MRS平板上。于37で培养48 h，计算各自的菌落数，再计算原生质体形成率原生质体形成率(％) = (A-B)/AX 100%其中A :总菌落数，即未经变溶菌素处理的菌悬液涂布于MRS固体平板上生长的菌落数；B :未原生质体化的细胞数，即酶解混合液经蒸馏水稀释后涂布于MRS固体平板上生长的菌落数。3.图I表明了菌体生长状态对双歧杆菌原生质体制备的影响分别取对数前、中、后、稳定期各时间段的菌体制备原生质体，研究菌体生长状态对原生质体形成的影响，结果如图I所示。对数后期即传代培养19 h的菌体处理后可使原生质体生成率达到80%，再生率达到46%。因此以下实验中，均选择在此条件下培养19 h的长双歧杆菌NCC2705菌液进行原生质体制备。4.图2表明原生质体化时温度对反应有极大影响。分别以35°C、37°C、40°C、42°C四个温度梯度，5 Pg/mL酶解30 min进行实验，结果见图2。在35 40で温度范围内，原生质体生成量随温度升高而升高，在37 °C下酶解30 min，原生质体生成率达到87 %，再生率49 %。因此本发明确定37で为长双歧杆菌制备原生质体的最佳酶解温度。5.图3表明变溶菌素酶浓度对原生质体形成的影响。收集培养至对数前期19 h的菌体，用 SMM 重悬,分别以 I Pg/mL、2. 5 Pg/mL、5 Pg/mL、7. 5 Pg/mL、10 Kg/mL 五个不同浓度酶在37で下酶解30 min。结果如图3所示，当变溶菌素的浓度为5 Pg/mL时，原生质体生成率达到84%，再生率达到46%。6.图4表明酶解时间对原生质体形成的影响。收集培养至对数前期19 h的菌体，用SMM重悬，在5 Pg/mL变溶菌素酶37°C酶解，原生质体形成率如图4所示。原生质体形成率随着酶解时间的延长而升高，酶解30 min时，原生质体形成率达到81 %，再生率达到49% ;延长酶解时间，原生质体形成率增加不大，再生率大大降低。继续延长酶解时间，原生质体形成率未继续增加，再生率继续降低。主要原因可能是酶继续作用于膜系统使膜破裂所致，导致菌体死亡所致。7.图5表明滲透压稳定剂对原生质体形成的影响。收集培养至对数前期19 h的菌体，分别用原生质体稳定液SMM，0. 5M/L的山梨醇，O. 5M/L蔗糖，O. 5M/L甘露醇重悬，在5 Pg/mL变溶菌素酶37で酶解30 min，原生质体形成情况如图5所示。图5可以看出，渗透压稳定剂对于原生质体的生成率没有明显的影响，然而SMM作为缓冲液时再生率最高，可达48 %。
8.图6表明原生质体的形成过程。按照优化条件制备长双歧杆菌的原生质体，并在100倍光学显微镜下，观察。(图A)长双歧杆菌在酶解初始阶段，部分菌体缩短，部分菌体的细胞壁分离剥离，释放出少量由细胞膜包住的类似球状的细胞，即为原生质体(图B)。最终酶解结束时，视野中只剩下很少的杆状菌体，大量原生质体形成(图C)。
实施例2 :双歧杆菌原生质体的转化与验证
I、双歧杆菌原生质体的转化
O穿梭表达载体PBEX由本实验室构建，具体构建方法參照马永平的专利(
发明者万翠香, 魏华, 夏慧玲, 章昭琳, 熊勇华, 许恒毅, 徐锋, 赖卫华, 王报贵 申请人:南昌大学