专利名称：检测结核分枝杆菌分泌蛋白的免疫层析试纸及其制备方法
技术领域：
本发明属于临床微生物快速检测的免疫层析技术领域，特别是涉及一种利用抗CFP-10蛋白抗体相关的免疫层析显色来早期鉴定培养物中结核分枝杆菌的方法。
背景技术：
据世界卫生组织统计，全球已有近1/3的人口感染了结核分枝杆菌，在某些发展中国家成人中结核分枝杆菌携带率高达80%，其中约5% -10%携带者可发展为活动性结核病。我国结核病人数居全球第二位，每年死于结核病的人是各类传染病死亡人数总和的两倍多。近二十年由于艾滋病的流行，感染了人类免疫缺陷病毒(HIV)的结核分枝杆菌携带者发展为活动性结核病的可能性比未感染HIV者高30-50倍。结核病又成为了威胁人类健康的全球性卫生问题，更是影响我国发展的重大社会和经济问题。结核病的实验室诊断主要依赖细菌学涂片和培养检查。由于方法所限，严重影响了结核病的及时诊断。因此，多年来国内外学者一直在寻找快速、敏感、特异、简便的实验室诊断方法。结核分枝杆菌培养分离是目前结核病诊断的金标准，但使用普通罗氏培养基需要4-8周时间，改良酸性罗-琼氏培养平均也需要25天，无法充分满足临床快速诊断的需要。针对结核分枝杆菌的快速培养，目前出现了各种改良的液体培养基和自动培养系统(马俊，王自立.结核分枝杆菌快速培养的研究进展及其临床意义[J].中国脊柱脊髓杂志，2007，17(5). 388-390)。液体变色培养基最先由德国Heipha/Biotest公司研制，称为MBRedox系统；自动培养系统包括以Bactec MGIT 960为代表的第二代分枝杆菌快速培养、药敏检测系统以及BBL MGIT分枝杆菌快速手工培养、鉴定、药敏检测系统等。不管是液体培养基还是自动培养系统，都还存在污染率高的问题，对于仪器判断为阳性的样品，仍须进行涂片、抗酸染色、显微镜下找到抗酸杆菌后方能判定阳性，费事费力。自动培养系统更由于仪器和试剂价格昂贵，难以得到普及。因此研究开发新一代结核分枝杆菌的快速检测试剂非常必要。结核分枝杆菌培养滤液蛋白10 (CFP-10)是Berthet等鉴定出来的一种低分子量、高度特异性的分泌性蛋白(BehrM A, Wilson M A, Gillff P, et al. Comparative genomicsof BCG vaccines by whole-genome DNA microarray[J]. Science,1999,284 (5419)1520-1523.)，又名MTBblI、MTSA-10,位于结核分枝杆菌6kDa早期分泌性抗原革巴蛋白(ESAT-6)基因的上游，由同一个操纵子和启动子调节转录，属于ESAT-6家族蛋白，两者约40%的同源性，具有相同的免疫学特性。CFP-10存在于MTB的早期培养滤液里，仅分布于各型结核杆菌中，而BCG及其它非致病性分枝杆菌缺失。因此在诊断结核杆菌感染的过程中可以区别是结核分枝杆菌感染还是非致病性结核分支杆菌感染。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种使用简便快捷、灵敏度和特异性高、适合于基层现场快速检测培养物中结核分枝杆菌的免疫层析试纸为了解决上述问题，本发明提供一种快速检测结核分枝杆菌的免疫层析试纸(双抗体夹心法快速检测结核分枝杆菌的免疫层析试纸)，包括上样垫、含有金标记的抗CFP-10单克隆抗体TBCA6的胶体金垫、包被质控线和检测线的硝酸纤维素膜吸样垫以及以及支撑板；检测线为包被在硝酸纤维素膜上的抗CFP-10单克隆抗体TBCD6，质控线为包被在硝酸纤维素膜上的羊抗鼠IgG抗体；在硝酸纤维素膜的上表面分别设置胶体金垫和吸样垫，上样垫位于胶体金垫的上表面，硝酸纤维素膜的下表面与支撑板紧密相连。本发明还同时提供了上述免疫层析试纸的制备方法，包括以下步骤A、抗CFP-10单克隆抗体TBCD6和TBCA6的制备用于包被检测线的抗CFP-10单克隆抗体TB⑶6，能特异性识别CFP-10的aa 23-36⑶LKTQIDQVESTA抗原肽序列，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNO C201082 ；用于胶体金垫中金标记的抗CFP-10单克隆抗体TBCA6，能特异性识别CFP-10的aa53-66AAVVRFQEAANKQK抗原肽序列，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNO C201083 ；制备方法如下I)单抗腹水的诱导在接种杂交瘤细胞前一周，给BALB/C小鼠腹腔注射降植烷每只O. 5ml，然后每只接种5X IO6TB⑶6或TBCA6的阳性杂交瘤细胞，10天后收集腹水离心，测定抗体效价。2) TB⑶6或TBCA6单克隆抗体的纯化利用Protein G亲和纯化法分别纯化腹水中的TB⑶6或TBCA6单克隆抗体；B、制作包被检测线和质控线的硝酸纤维素膜(即将TBCD6单克隆抗体溶液以及羊抗鼠IgG溶液分别喷到硝酸纤维素膜上)，晾干后将其(即，包被检测线和质控线的硝酸纤维素膜)粘贴在支撑板上；包被检测线和质控线的硝酸纤维素膜制作如下I)用O. 01mol/L PH7. 4磷酸盐PBS缓冲液将抗CFP-10单克隆抗体TB⑶6配制成浓度为O. 3mg/ml的溶液，用喷膜仪在硝酸纤维素膜的下表面以O. 8 I. 2ul/cm的参数划线，包被成检测线；2)用O. 01mol/L PH7. 4磷酸盐PBS缓冲液将羊抗鼠IgG抗体配制成2. 4mg/ml的溶液，用喷膜仪在硝酸纤维素膜的上表面以0. 8 I. 2ul/cm的参数划线，包被成质控线；3)将划线后的硝酸纤维素膜于36. 5 37. 5°C (最佳37°C )的温度和小于30%的湿度(相对湿度，例如为20 29% )的条件下干燥8 10小时，得包被检测线和质控线的硝酸纤维素膜；C、制备含有金标记的抗CFP-10单克隆抗体TBCA6的胶体金垫将TBCA6单克隆抗体胶体金探针溶液加入至玻璃纤维膜或聚脂膜，干燥后，得胶体金垫；将胶体金垫粘贴在步骤B得到的硝酸纤维素膜的上表面的左侧；TBCA6单克隆抗体胶体金探针溶液的制备方法如下I)、将质量浓度0. 01 % HAuCL4水溶液加热煮沸，每50ml HAuCL4溶液在磁力加热(于100-110°c )搅拌下迅速一次性加入I. 7 I. 8ml (最佳为I. 75ml)的质量浓度1%柠檬酸三钠水溶液，继续加热(于100-110°C )搅拌8 12分钟(最佳为10分钟)，得胶体金溶液；2)、调节胶体金溶液至ρΗ5· 5，将抗体TBCA6按O. 7 O. 75 (最佳O. 72) mg每IOOml胶体金溶液的比例偶联，混匀后为TBCA6的免疫胶体金探针溶液；3)、将上述TBCA6的免疫胶体金探针溶液4°C 15000r/min离心30min后弃去上清，以重悬液重悬沉淀物，得TBCA6单克隆抗体胶体金探针溶液；所述重悬液是步骤2)的胶体金溶液体积的0. 9 1. 2倍；重悬液的制备方法如下在浓度为O. 01mol/L，PH7. 4的PB缓冲液一升中加入9 Ilg 的 BSA,33 37g 的蔗糖和 O. 28 O. 32g 的 PEG20000 ；D、在步骤C所得的胶体金垫的上表面粘贴上样垫；在硝酸纤维素膜的上表面的右侧搭接吸样垫(4)，得快速检测结核分枝杆菌的免疫层析试纸(S卩，得到检测CFP-10的免疫层析试纸。)。作为本发明的快速检测结核分枝杆菌的免疫层析试纸的制备方法的改进步骤C中将TBCA6单克隆抗体胶体金探针溶液按Iml溶液铺23 27cm2的比例均匀地铺在玻璃纤维膜或聚酯纤维膜上。在本发明的免疫层析试纸的制备方法中，确定了所述单个试纸最终材料宽度控制在2. 5-5mm ;所述胶体金垫的材料为亲水玻璃纤维膜或相对亲水聚脂纤维膜(厚度约为O. 25-0. 8mm);所述上样垫为亲水玻璃纤维膜(厚度约为O. 25-0. 8mm);所述吸样垫的材料为吸水滤纸(厚度约为O. 45-1. 9mm);检测结果的最佳判定时间为5_30min以内。本发明的有益效果是利用抗CFP-10单克隆抗体TB⑶6和TBCA6来制备胶体金免疫层析试纸，可快速检测液体培养基中的结核分枝杆菌分泌性抗原靶蛋白CFP-10从而鉴定是否为人的致病结核分枝杆菌，即使非专业人员也能按照说明书即可操作，5-30分钟内观察结果，最少可检出CFP-10蛋白I. 2ng/ml。该CFP-10免疫检测试纸具有简便性、敏感性、特异性和快速性的优点，而且价格便宜适于基层现场使用。本发明用到胶体金免疫层析技术出现于20世纪80年代初期，因其具有敏感性高、特异性强、操作简单、快速等优点，在医学检验中得到广泛应用。其基本原理为将与待检物CFP-10配对的抗体包被在膜上用于捕捉，然后用另一配对的免疫胶体金探针检测，阳性样品2-5分钟后出现肉眼可见的沉淀线。该技术与其他方法比较，优势在于样品处理简单，不需要专门仪器和人员培训，非专业人员按照说明书即可操作，并迅速观察结果，适合基层使用。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。图1是透射电镜下的胶体金颗粒(X 100000)；图2是本发明的免疫层析试纸的主视结构的爆破示意图；图3是图2的俯视示意图。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本 发明的范围。实施例I、图2、图3给出了一种快速检测结核分枝杆菌分泌蛋白CFP-10免疫层析试纸的制备，选用如下主要材料氯金酸(HAuCL4· 4H20),分析纯，Sigma 公司；柠檬酸三钠(Na3C6H5O7 · 2H20)，分析纯，中国医药集团上海化学试剂总公司；羊抗鼠IgG抗体，上海金标公司；聚乙二醇(PEG)20000,分析纯，Sigma 公司；蔗糖(C12H19C1308)，分析纯，Sigma公司；牛血清白蛋白(BSA)，上海生工生物工程公司；硝酸纤维素(NC)膜，Millipore公司；其他常用试剂均为分析纯。步骤I、制备并纯化抗CFP-10小鼠单克隆抗体TB⑶6和TBCA6I)、单抗腹水的诱导在接种杂交瘤细胞前一周，给BALB/C小鼠腹腔注射降植烷每只O. 5ml，然后每只接种5X IO6能产生TB⑶6或TBCA6的阳性杂交瘤细胞，10天后收集腹水离心，测定抗体效价。上述能产生小鼠单克隆抗体TBCD6或TBCA6的阳性杂交瘤细胞来源于中国典型培养物保藏中心；保藏编号分别为CCTCC NO C201082 ；CCTCC NO :C201083。2)单克隆抗体的纯化利用Protein G亲和纯化法纯化腹水中的TB⑶6或TBCA6
单克隆抗体。2、制作包被检测线6和质控线3的硝酸纤维素膜5 ;S卩，将TBCD6单克隆抗体溶液以及羊抗鼠IgG溶液分别喷到硝酸纤维素膜5上，晾干后将其(包被检测线6和质控线3的硝酸纤维素膜5)粘贴在支撑板7上；包被检测线6和质控线3的硝酸纤维素膜5的制作方法如下I)、用O. 01mol/L PH7. 4磷酸盐PBS缓冲液将抗CFP-10单克隆抗体TB⑶6配制成浓度为O. 3mg/ml的溶液，用喷膜仪在硝酸纤维素膜5的下表面以O. 8 I. 2ul/cm(最佳为lul/cm)的参数划线，包被成检测线6;2)、用O. 01mol/LPH7. 4磷酸盐PBS缓冲液将羊抗鼠IgG抗体配制成2. 4mg/ml的溶液，用喷膜仪在硝酸纤维素膜5的上表面以O. 8 I. 2ul/cm(最佳为lul/cm)的参数划线，包被成质控线3 ；3)将划线后的硝酸纤维素膜5于37°C的温度和小于30% (例如为20% 29% )的相对湿度的条件下干燥8 10小时，得包被了检测线6和质控线3的硝酸纤维素膜5。3、制备抗CFP-10免疫胶体金探针和相应的TBCA6抗体金标垫I)将O. 01 % (质量浓度)HAuCL4水溶液加热煮沸，每50ml HAuCL4水溶液在磁力加热(于100-110°C )搅拌下迅速一次性加入I. 75ml的1% (质量浓度)柠檬酸三钠水溶液，继续加热(于100°C )搅拌10分钟，得胶体金溶液。2)胶体金颗粒的电镜观察透射电镜下可见胶体金溶液中的胶体金颗粒呈圆形或椭圆形，大小均匀一致，计数100个金颗粒，颗粒直径约为19. 5nm。结果表明，按照以上技术路线制备的胶体金颗粒合格。3)确定最低偶联抗体浓度调节胶体金溶液至PH5. 5 (可利用常规的弱酸、弱碱溶液进行调节)用于稀释抗体TBCA6。分别取5ul，IOul，15ul，20ul，25ul等体积的抗体TBCA6加入各自对应的Iml胶体金溶液中，混匀后于室温下放置5min，加入10% (质量浓度)NaCL水溶液O. Iml混匀后静置，10-20min后胶体金溶液颜色不变时所含最少抗体量，为稳定Iml胶体金溶液所需最低偶联抗体量； 4)在本实施例中，最少抗体量对应的是O. 6mg每IOOml胶体金溶液的比例。5)将120%倍的上述最低偶联抗体量的抗体TBCA6按比例加入到50ml胶体金溶液中(即将抗体TBCA6按O. 72mg每IOOml胶体金溶液的比例偶联，该胶体金溶液已调节至PH5. 5)，混匀后室温静置I小时，得TBCA6的免疫胶体金探针溶液；将TBCA6的免疫胶体金探针溶液4°C 15000r/min离心30min后轻轻弃去上清，以I体积倍(即50ml)的重悬液重悬沉淀物，得TBCA6单克隆抗体胶体金探针溶液；重悬液的制备方法如下在浓度为O. 01mol/L,PH7. 4的PB缓冲液I升中加入IOg的 BSA、35g 的蔗糖和 O. 3g 的 PEG20000 ；6)将上述5)的溶液(TBCA6单克隆抗体胶体金探针溶液)按Iml溶液铺25cm2的比例均匀地铺在亲水玻璃纤维膜或相对亲水聚酯纤维膜(厚度约为O. 25-0. 8mm)上，再置干燥间，于20-25°C小于30%湿度(例如为20%的相对湿度)的条件下干燥2_4小时，制成胶体金垫2备用。该胶体金垫2为含有金标记的抗CFP-10单克隆抗体TBCA6的胶体金垫。4、检测CFP-10免疫层析试纸(快速检测结核分枝杆菌的免疫层析试纸)的组装检测抗CFP-10的免疫层析试纸由上样垫I、包被了检测线6和质控线3的硝酸纤维素膜5(以下简称包被抗体的硝酸纤维素膜5)、胶体金垫2、吸样垫4和支撑板7这五部分组成。将制备好的包被抗体的硝酸纤维素膜5粘贴在支撑板7上(硝酸纤维素膜5的下表面与支撑板7相接触)，胶体金垫2右端的下表面与包被抗体的硝酸纤维素膜5左端的上表面固定相连(以粘贴的方式实现)；上样垫I右端的下表面与胶体金垫2左端的上表面固定相连(以粘贴的方式实现)。吸样垫4左端的下表面与包被抗体的硝酸纤维素膜5右端的上表面固定相连(以粘贴的方式实现)；最后按宽度O. 25cm-0. 5cm切割(如图3所示)，即为检测抗CFP-10蛋白的免疫层析试纸，加干燥剂后密封保存。实验I、结核分枝杆菌分泌蛋白CFP-10检测试验I、试纸检出CFP-10的敏感性以 Fitzgerald Industries International 公司购买的重组蛋白 CFP-10 为标准，经生理盐水有限稀释后，作为样品检测液，取CFP-10检测试纸(即实施例I所得的免疫层析试纸)，分别浸入不同CFP-10浓度样品检测液中，2分钟后开始观察结果，15分钟观察终止。结果报告出现I条红色(对照)沉淀线为阴性，即无CFP-10检出；出现2条红色(样品和对照)沉淀线为阳性，即有CFP-10检出。具体检测结果如表I所述。本发明所提供的CFP-10试纸可检出最低限I. 2ng/mL·表I、试纸条敏感性
权利要求
1.一种快速检测结核分枝杆菌的免疫层析试纸，其特征是包括上样垫(I)、含有金标记的抗CFP-IO单克隆抗体TBCA6的胶体金垫(2)、包被质控线(3)和检测线(6)的硝酸纤维素膜(5)、吸样垫(4)以及支撑板(7);所述检测线￠)为包被在硝酸纤维素膜上的抗CFP-10单克隆抗体TBCD6，质控线(3)为包被在硝酸纤维素膜(5)上的羊抗鼠IgG抗体；在硝酸纤维素膜(5)的上表面分别设置胶体金垫(2)和吸样垫(4)，上样垫(I)位于胶体金垫(2)的上表面，硝酸纤维素膜(5)的下表面与支撑板(7)固定相连。
2.如权利要求I所述的快 速检测结核分枝杆菌的免疫层析试纸的制备方法，其特征是包括以下步骤 A、抗CFP-10单克隆抗体TB⑶6和TBCA6的制备 用于包被检测线(6)的抗CFP-10单克隆抗体TBCD6，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为 CCTCC NO C201082 ； 用于胶体金垫(2)中金标记的抗CFP-10单克隆抗体TBCA6，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO C201083 ； 制备方法如下 1)单抗腹水的诱导在接种杂交瘤细胞前一周，给BALB/C小鼠腹腔注射降植烷每只O.5ml，然后每只接种5 X IO6TB⑶6或TBCA6的阳性杂交瘤细胞，10天后收集腹水离心，测定抗体效价； 2)TB⑶6或TBCA6单克隆抗体的纯化利用Protein G亲和纯化法分别纯化腹水中的TBCD6或TBCA6单克隆抗体； B、制作包被检测线(6)和质控线(3)的硝酸纤维素膜(5);然后将包被检测线(6)和质控线⑶的硝酸纤维素膜(5)粘贴在支撑板(7)上； 包被检测线(6)和质控线(3)的硝酸纤维素膜(5)制作方法依次进行如下步骤 1)、用O.OImoI/L PH7. 4磷酸盐PBS缓冲液将抗CFP-10单克隆抗体TB⑶6配制成浓度为O. 3mg/ml的溶液，用喷膜仪在硝酸纤维素膜(5)的下表面以O. 8 I. 2ul/cm的参数划线，包被成检测线(6)； 2)、用O.01mol/L PH7. 4磷酸盐PBS缓冲液将羊抗鼠IgG抗体配制成2. 4mg/ml的溶液，用喷膜仪在硝酸纤维素膜(5)的上表面以O. 8 I. 2ul/cm的参数划线，包被成质控线(3)； 3)将划线后的硝酸纤维素膜(5)于36.5 37. 5°C的温度和小于30%的湿度的条件下干燥8 10小时；得包被检测线(6)和质控线(3)的硝酸纤维素膜(5)； C、制备含有金标记的抗CFP-10单克隆抗体TBCA6的胶体金垫(2): 将TBCA6单克隆抗体胶体金探针溶液加入至玻璃纤维膜或聚脂膜，干燥后，得胶体金垫(2);将胶体金垫(2)粘贴在步骤B得到的硝酸纤维素膜(5)的上表面的左侧； 所述TBCA6单克隆抗体胶体金探针溶液的制备方法如下 1)、将质量浓度O.01 %的HAuCL4水溶液加热煮沸，每50ml HAuCL4水溶液在100-110°C的磁力加热搅拌下加入I. 7 I. 8ml的质量浓度I %的柠檬酸三钠水溶液，于100-110°C继续加热搅拌8 12分钟，得胶体金溶液； 2)、调节胶体金溶液至ρΗ5·5，将抗体TBCA6按O. 7 O. 75mg抗体TBCA6/100ml胶体金溶液的比例偶联，混匀后为TBCA6的免疫胶体金探针溶液；3)、将上述TBCA6的免疫胶体金探针溶液4°C 15000r/min离心30min后弃去上清，以重悬液重悬沉淀物，得TBCA6单克隆抗体胶体金探针溶液；所述重悬液是步骤2)的胶体金溶液体积的O. 9 I. 2倍； 所述重悬液的制备方法如下在浓度为O. 01mol/L，PH7. 4的PB缓冲液一升中加入9 Ilg 的 BSA,33 37g 的蔗糖和 O. 28 O. 32g 的 PEG20000 ； D、在步骤C所得的胶体金垫(2)的上表面粘贴上样垫(I);在硝酸纤维素膜(5)的上表面的右侧搭接吸样垫(4)，得快速检测结核分枝杆菌的免疫层析试纸。
3.根据权利要求2所述的快速检测结核分枝杆菌的免疫层析试纸的制备方法，其特征是所述步骤C中将TBCA6单克隆抗体胶体金探针溶液按Iml溶液铺23 27cm2的比例均匀地铺在玻璃纤维膜或聚酯纤维膜上。
全文摘要
本发明公开了一种快速检测结核分枝杆菌的免疫层析试纸，包括上样垫(1)、含有金标记的抗CFP-10单克隆抗体TBCA6的胶体金垫(2)、包被质控线(3)和检测线(6)的硝酸纤维素膜(5)、吸样垫(4)以及支撑板(7)；检测线(6)为包被在硝酸纤维素膜上的抗CFP-10单克隆抗体TBCD6，质控线(3)为包被在硝酸纤维素膜(5)上的羊抗鼠IgG抗体；在硝酸纤维素膜(5)的上表面分别设置胶体金垫(2)和吸样垫(4)，上样垫(1)位于胶体金垫(2)的上表面。本发明还同时提供了上述免疫层析试纸的制备方法。本发明的免疫层析试纸，适合于基层现场快速检测培养物中结核分枝杆菌。
文档编号G01N33/558GK102621318SQ20121004522
公开日2012年8月1日 申请日期2012年2月27日 优先权日2012年2月27日
发明者姚航平, 徐宁 申请人:浙江工业大学