专利名称：一种β-葡萄糖苷酶的固定化及其协同纤维素酶水解秸秆纤维素的方法
技术领域：
本发明ー种β -葡萄糖苷酶的固定化及其协同纤维素酶水解秸秆纤维素的方法， 具体涉及ー种磁性固定化β -葡萄糖苷酶的制备方法，以及该固定化酶在秸秆纤维素水解中的应用，属于生物催化技术领域。
背景技术：
β -葡萄糖苷酶(EC3. 2. 1. 21)又称纤维ニ糖酶，是一种能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键的水解酶。它能够作用于纤维ニ糖或纤维寡糖，使其水解为葡萄糖分子，也是纤维素酶的成分之一，可以协同纤维素酶提高木质纤维素水解的速度和程度。 在纤维素降解、食品风味的改善等领域具有广泛的应用。一般认为纤维素类物质经酶促作用生成葡萄糖至少需要三种酶内切葡聚糖酶，外切纤维ニ糖水解酶和纤维ニ糖酶(β -葡萄糖苷酶)。内切葡聚糖酶和外切纤维ニ糖酶把纤维素降解成纤维ニ糖，它再被纤维ニ糖酶分解成葡萄糖，纤维素酶的重要作用是通过这三种酶协同进行，最后将纤维素转化为葡萄糖，因此在这个过程中纤维ニ糖酶起到关键作用。而在多数的纤维素酶组成中纤维ニ糖酶组分较少，活力低，影响ニ糖类物质分解，成为纤维素酶整个水解的瓶颈。纤维素是葡萄糖以1，4-糖苷键结合的聚合物，为植物細胞壁的构成成分，占植物干重的1/2到1/3。全球一年间由光合作用生产的的纤维素达1000亿吨，是最丰富的可再生资源。将植物纤维应用于发酵食品エ业原料，具有缓减资源短缺的优势，将对人类是ー个重大贡献。因此，开发优化纤维素水解的方法具有良好的应用价值。由于多数商品纤维素酶液中，葡萄糖苷酶活力低，在纤维素酶中额外添加适量的葡萄糖苷酶，可以一定程度上提高秸秆纤维素的酶解率。但商品葡萄糖苷酶价格昂贵，通过固定化酶能实现其回收利用，因此降低酶的使用成本。虽然国内外对固定化葡萄糖苷酶研究较多，如来用海藻酸钠通过吸附法固定葡萄糖苷酶(催化学报，2008，四(10) :1021-20 )；采用ACA微胶囊固定β -葡萄糖苷酶(现代化工，2009， 29(10):51-54).但是这些固定化酶是应用在均相体系的反应中。纤维素酶水解秸杆的产物除了水解得到的糖类外，还有其它固体残渣，这给固定化酶的回收造成困难。虽然中国专利CN101270352A公布了ー种用磁性纳米颗粒固定β -葡萄糖苷酶的方法，该法制备纳米固定化酶过程较复杂，酶活回收率不高，且无在秸杆纤维素非均相反应体系中的应用报道。
发明内容
本发明的目的是提供ー种葡萄糖苷酶的固定化及其协同纤维素酶水解秸秆纤维素的方法，本发明针对纤维素酶水解秸杆反应体系，通过制备磁性固定化酶，实现
葡萄糖苷酶的反复利用。本发明的技术方案
本发明提供了ー种β-葡萄糖苷酶的固定化及其协同纤维素酶水解秸秆纤维素的方法。包括
(1)用壳聚糖、丙酸、PEG400和!^e3O4颗粒制备磁性壳聚糖微球，并用戊ニ醛活化，得到固定化载体；
(2)β -葡萄糖苷酶吸附于磁性壳聚糖微球固定化载体上，得磁性固定化β -葡萄糖苷
酶；
(3)磁性固定化β-葡萄糖苷酶协同纤维素酶水解秸秆纤维素。该方法制得的磁性固定化β -葡萄糖苷酶在温度、PH及使用次数上面表现出良好的稳定性。将此固定化酶应用于水解秸秆，表现出一定的促进作用。以下是本发明方法的详细描述 固定化载体的制备
在45飞0 mL去离子水体系中，壳聚糖质量为0. 5^1. 0 g，丙酸质量分数为1. 59Γ2. 5%， PEG400为40 60 μ L，Fe3O4颗粒质量为0. 5 1. 0 g，将上述组份搅拌均勻，形成透明均一的胶体后，除去气泡，滴入50-300 mL 2 M的NaOH溶液中，静置8 12 h，得到壳聚糖磁性微球， 过滤后Ig壳聚糖磁性微球用20mL 1. 59Γ3. 0%的戊ニ醛溶液在25°C处理2、h，过滤后得到固定化载体；
磁性壳聚糖微球固定化载体吸附β-葡萄糖苷酶
将0. 5 0. 8 g固定化载体加入到8 12 mL、pH4. 5 5. 0的β -葡萄糖苷酶溶液中，酶活为0.6-10 CBIU/mL，于150 200 r/min、2(T25°C下震荡5 15 h，得到磁性固定化β-葡萄糖苷酶。磁性固定化β -葡萄糖苷酶协同纤维素酶水解秸秆纤维素
以用常规的碱预处理的玉米秸秆纤维素为底物，用ΡΗ4. 5、. 0的柠檬酸缓冲液配成 50^100 g/L玉米秸杆纤维素的浆液，加入固定化β -葡萄糖苷酶和纤维素酶，固定化β -葡萄糖苷酶用量为8(T150 g/L浆液(湿重)，纤维素酶的用量为1(T30 FPIU/g秸秆，在4(Γ65 °C下水解10 48 h。固定化β -葡萄糖苷酶的保存
将0. 2 0. 5 g固定化β -葡萄糖苷酶加入到0. 05 N、ρΗ4. (Γ7. 0的柠檬酸缓冲液中保存。磁性固定化β -葡萄糖苷酶酶活测定
将固定化酶0.1 g加入2 mL的纤维ニ糖底物在50°C下恒温反应30 min，再于100°C 水浴灭活10 min，用生物传感仪測定葡萄糖含量。酶活单位CBIU/g。其中一个纤维ニ糖酶活力国际单位(CBIU)定义为标准酶促反应条件下(50°C下恒温反应30 min)每分钟生成 2.0 μ mol葡萄糖的酶量。相关计算公式
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权利要求
1. 一种葡萄糖苷酶的固定化及其协同纤维素酶水解秸秆纤维素的方法，其特征在于步骤为(1)用壳聚糖、丙酸、PEG400和!^e3O4颗粒制备磁性壳聚糖微球，并用戊二醛活化，得到固定化载体在45飞0 mL去离子水体系中，壳聚糖质量为0.5 1.0 g，丙酸质量分数为 1. 5% 2. 5%，PEG400为40 60 μ L，Fe3O4颗粒质量为0. 5 1. 0 g，将上述组份搅拌均勻，形成透明均一的胶体后，除去气泡，滴入50-300 mL 2 M的NaOH溶液中，静置8 12 h，得到壳聚糖磁性微球，过滤后Ig壳聚糖磁性微球用20 mL 1. 59Γ3. 0%的戊二醛溶液在25°C处理2、 h，过滤后得到固定化载体；(2)β -葡萄糖苷酶吸附于磁性壳聚糖微球固定化载体上，得磁性固定化β -葡萄糖苷酶将0.5 0.8 g固定化载体加入到纩12 mL、pH4.5 5.0& β -葡萄糖苷酶溶液中，酶活为 0.6-10 CBIU/mL，于150 200 r/min、2(T25°C下震荡5 15 h，得到磁性固定化β -葡萄糖苷酶；(3)磁性固定化葡萄糖苷酶协同纤维素酶水解秸秆纤维素以用碱预处理的玉米秸秆纤维素为底物，用ΡΗ4. 5^5. 0的柠檬酸缓冲液配成5(T100 g/L玉米秸杆纤维素的浆液，加入固定化葡萄糖苷酶和纤维素酶，固定化葡萄糖苷酶用量为8(T150 g/L浆液，纤维素酶的用量为10 30 FPIU/g秸秆，在40 65 °C下水解10 48 h。
全文摘要
一种β-葡萄糖苷酶的固定化及其协同纤维素酶水解秸秆纤维素的方法，属生物催化技术领域。本发明方法包括(1)将壳聚糖溶解在丙酸溶液中形成透明均一的胶体，再与Fe3O4颗粒混合搅拌，滴入NaOH溶液，得到磁性微球。将磁性微球于戊二醛溶液中交联得到固定化载体。(2)将固定化载体加入到β-葡萄糖苷酶液中进行吸附得到磁性固定化酶。用磁性固定化酶水解纤维二糖底物测其酶活性。(3)将此磁性固定化酶协同纤维素酶降解玉米秸秆。用该方法制得的固定化酶形状均一，比表面积大，机械强度高，酶活高，易回收。并能够协同纤维素酶水解秸秆纤维素，提高水解糖的得率，重复使用稳定性好，可降低酶法水解秸秆纤维素的成本。
文档编号C12N11/02GK102533717SQ201210052838
公开日2012年7月4日 申请日期2012年3月2日 优先权日2012年3月2日
发明者卢婵, 杨绪娥, 王杰, 郑璞 申请人:江南大学