专利名称：一种固态发酵生产漆酶的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种固态发酵法生产工业用酶的制备方法。
背景技术：
白腐真菌是一类使木材呈白色腐朽的真菌，能够分泌胞外氧化酶降解木质素，且降解木质素的能力优于降解纤维素的能力，这些酶可以促使木质腐烂成为淡色的海绵状团 ±夬——白腐，故称为白腐真菌。分类学上，白腐真菌属于真菌门，绝大多数为担子菌纲，少数为手囊菌纲。目前研究最多的有黄孢厚毛平革菌、彩绒草盖菌、变色栓菌、射脉菌、凤尾菇、 朱红密孔菌等。漆酶是一种多酚氧化酶，可以结合多个铜离子，能催化多酚类、芳胺类、羧酸类、生物色素等的氧化，也具有降解木质素的功能。漆酶可存活于空气中，发生反应后唯一的产物就是水，因此本质上是一种环保型酵素。漆酶独特的催化特性使其在生物检测中有广泛的应用，作为高效的生物检测器而成为底物、辅酶、抑制剂等成分分析的有效工具和手段。由于这几年环保意识逐渐被人所重视，因此近年来漆酶也成为众多学者的研究对象。工业上生产漆酶的方法主要是液态发酵。而液态发酵存在能耗大、工艺操作较复杂等特定，且生产规模较大，污染较重，成本较高。与液态发酵相比，固态发酵的主要优点为节能节水、后处理简单、发酵产酶活力较高、能耗低、环境危害小等。固态发酵生产漆酶越来越受到人们的重视。基质的组成，含水量以及湿度、通气量和培养基组成是影响固态发酵生产漆酶的主要影响因素。目前固态发酵产漆酶存在周期长的缺点。例如，付时雨研究了贝壳状革耳菌 (Panus conchatus)在固态及液体培养过程中胞外漆酶及同工酶的产生规律及其差异，结果表明固态培养基产漆酶的最高峰在培养17天以后，固态和液体培养过程所产的漆酶同工酶差异比较大，固态培养下产生的漆酶活性远大于液体培养产生的漆酶活性，在固态培养条件下，Rigidoporus Iignosus的漆酶产量也较液体培养大大提高；Gose等以栗子壳和麸皮为主要原料，其产漆酶高峰出现在发酵的12天Juan等使用木糖渣为主要原料，并用乙醇蒸气诱导固态发酵产漆酶，漆酶酶活力最大值出现在14天；孙芹英等人采用平板显色法从三株白腐真菌筛选出一株灵芝属漆酶高产菌，以农作物秸秆等为培养基进行固态发酵，该菌主要产漆酶和少量木质素过氧化物酶，在优化条件下，该菌发酵18天可达到产酶高峰。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本申请人提供了一种固态发酵生产漆酶的方法。 本发明使用的固态培养基由农作物秸秆、豆粕和水组成，发酵结束后加提取液浸提，经沉淀、超滤浓缩和冻干或喷雾得到粉状漆酶，操作简单，成本低廉。本发明的技术方案如下一种固态发酵生产漆酶的方法，具体步骤如下
(1)种子液制备将白腐真菌菌株接种在经灭菌处理的种子液培养基中，2(T35°C摇床培养2、天即为种子液，所述种子液培养基的组分及质量份数为酵母膏广5份，葡萄糖 5 20份，蛋白胨2 10份；
(2)发酵产酶将步骤(1)得到的种子液以体积分数2 15%接种量接入固态培养基中， 于2(T35°C条件下发酵6 15天，所述固态培养基的组分及质量份数秸秆广4份，豆粕广3 份，水1 7份；
(3)漆酶制剂制备向步骤(2)得到的发酵完毕的培养物中加入质量为该培养物全部质量的广5倍的蒸馏水，2(T40°C浸提2、小时，过滤；将滤液超滤浓缩5 20倍后干燥，即得漆酶制剂。所述秸秆可以为玄子小麦秸秆、水稻秸秆的一种或者两种混合，将其粉碎至平均长度为3cm以下使用。本发明有益的技术效果在于
本发明操作简单，所用固态基质均为廉价的农业废弃物秸秆，漆酶生产过程中只需要添加水来保持培养基的湿度，不需要添加其他营养物质，发酵成本极为低廉。本发明为秸秆等废弃物提供了一条工业化应用的有效途径，还可减少因焚烧造成的环境污染。本发明制备的漆酶酶活高，酶活达9500U/g (DMP法)以上。
具体实施例方式本发明所使用的白腐真菌菌株来自于中国典型培养物保藏中心，命名为 Pycnoporus sp. STOC-L3，保藏编号为CCTCC NO =M 2010235。酵母膏为国产分析纯浓稠浆液，葡萄糖为国产分析纯粉末，蛋白胨为国产分析纯粉末，豆粕为市面购买的粉末。实施例1
1、种子液的制备
配制种子液培养基酵母膏ι份，葡萄糖5份，蛋白胨2份，PH为自然状态，高压蒸汽灭菌20 min0冷却后接种白腐真菌菌株，于20°C的恒温摇床中培养4天；
2、接种于固态培养基
配制固态培养基平均长度为3cm以下的玄子小麦秸秆1份，豆粕3份，水1份，pH为自然状态，高压蒸汽灭菌20 min0冷却后按体积分数洲的比例将种子液接入固态培养基中，于35°C条件下发酵6天；发酵过程是在固态发酵罐中，发酵罐密封；
3、后处理
向发酵完毕的培养基中加入1倍质量的蒸馏水，20°C浸提2小时，过滤，超滤浓缩5倍后，即得漆酶液体制剂。经过喷雾干燥后即得漆酶粉状制剂；
4、漆酶活性的测定
漆酶活性的测定方法以DMP为底物，每3ml反应体系含160 mmol/1柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 3. 5),10 mmol/1 DMP, 30 °C保温5 min，加入100 μ 1酶液，用紫外可见分光光度计在470 nm处测吸光值。以每分钟氧化1 μ mol的DMP成为3，5，3‘ 5'-四甲氧基二苯醌(ε =49. 6 mrnoF1 · 1 · cnT1)所需要的酶量定义为1个酶活力单位，以U/ml表示；
5、结果漆酶粉末制剂的酶活达到9500U/g。
实施例2
1、种子液的制备
配制种子液培养基酵母膏5份，葡萄糖20份，蛋白胨10份，pH为自然状态，高压蒸汽灭菌20 min0冷却后接种白腐真菌菌株。于35°C的恒温摇床中培养2天；
2、接种于固态培养基
配制固态培养基平均长度为3cm以下的水稻秸秆4份，豆粕1份，水7份，pH为自然状态，高压蒸汽灭菌20 min0冷却后按体积分数15%的比例将种子液接入固态培养基中，于 20°C条件下发酵15天；发酵过程是在固态发酵罐中，发酵罐密封；
3、后处理
向发酵完毕的培养基中加入5倍质量的蒸馏水，40°C浸提8小时，过滤，超滤浓缩20倍后，即得漆酶液体制剂。经过喷雾干燥后即得漆酶粉状制剂；
4、漆酶活性的测定与实施例1相同；
5、结果
漆酶粉末制剂的酶活达到7800U/g。
权利要求
1.一种固态发酵生产漆酶的方法，其特征在于具体步骤如下(1)种子液制备将白腐真菌菌株接种在经灭菌处理的种子液培养基中，2(T35°C摇床培养2、天即为种子液，所述种子液培养基的组分及质量份数为酵母膏广5份，葡萄糖 5 20份，蛋白胨2 10份；(2)发酵产酶将步骤(1)得到的种子液以体积分数2 15%接种量接入固态培养基中， 于2(T35°C条件下发酵6 15天，所述固态培养基的组分及质量份数秸秆广4份，豆粕广3 份，水1 7份；(3)漆酶制剂制备向步骤(2)得到的发酵完毕的培养物中加入质量为该培养物全部质量的广5倍的蒸馏水，2(T40°C浸提2、小时，过滤；将滤液超滤浓缩5 20倍后干燥，即得漆酶制剂。
2.根据权利要求1所述的固态发酵生产漆酶的方法，其特征在于所述秸秆可以为玄子小麦秸秆、水稻秸秆的一种或者两种混合，将其粉碎至平均长度为3cm以下使用。
全文摘要
一种固态发酵生产漆酶的方法，具体步骤(1)种子液制备将白腐真菌菌株接种在经灭菌处理的种子液培养基中，20~35℃摇床培养2~4天即为种子液，种子液培养基的组分及质量份数为酵母膏1~5份，葡萄糖5~20份，蛋白胨2~10份；(2)发酵产酶将步骤(1)得到的种子液以体积分数2~15%接种量接入固态培养基中，于20~35℃条件下发酵6~15天，固态培养基的组分及质量份数秸秆1~4份，豆粕1~3份，水1~7份；(3)漆酶制剂制备向步骤(2)得到的发酵完毕的培养物中加入质量为该培养物全部质量的1~5倍的蒸馏水，20~40℃浸提2~8小时，过滤；将滤液超滤浓缩5~20倍后干燥，即得漆酶制剂。本发明使用的固态培养基由农作物秸秆、豆粕和水组成，操作简单，成本低廉。
文档编号C12R1/645GK102533685SQ20121005480
公开日2012年7月4日 申请日期2012年3月5日 优先权日2012年3月5日
发明者廖详如, 杨胜林, 王欣, 赵晓联 申请人:宜兴市金和农业技术有限公司