一种芽孢杆菌与乳酸菌复合抗菌肽的制备方法及其用途
【专利摘要】本发明涉及一种芽孢杆菌与乳酸菌复合抗菌肽的制备方法，其制备方法是将斜面保存的芽孢杆菌、乳酸菌高产株分别进行斜面活化、培养，按照芽孢杆菌和乳酸菌按1∶2的比例，接种到发酵培养基培养得抗菌肽发酵液，发酵液低温离心，取上清，冷冻干燥制得抗菌肽粉末。此方法制备的复合抗菌肽可以作为饲料添加剂，对于改善畜舍环境和促进动物生长有的积极作用。本发明具有广谱抗菌活性，对细菌有很强的杀伤作用，可以作为抗生素的替代品，且无耐药性。
【专利说明】一种芽孢杆菌与乳酸菌复合抗菌肽的制备方法及其用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物资源利用领域，具体涉及到一种芽孢杆菌与乳酸菌复合抗菌肽的制备方法及其用途。
【背景技术】
[0002]乳酸菌能促进动物生长，调节胃畅道正常菌群、维持微生态平衡，从而改善胃肠道功能；提高食物消化率和生物效价；降低血清胆固醇，控制内毒素；抑制肠道内腐败菌生长:提高机体免疫力等。乳酸菌代谢产物抗菌肽具有多种生理功能，可刺激组织发育，对机体的营养状态、生理功能、免疫反应和应激反应等产生作用。
[0003]芽孢杆菌能产生多种消化酶，破坏植物饲料细胞的细胞壁，促使细胞的营养物质释放出来，帮助动物对营养物质的消化吸收。枯草芽孢杆菌代谢物通常以多种类似物的形式存在于发酵液中，对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用，热稳定性高，对微生物不产生耐药性。
[0004]抗菌肽具有广谱抗菌活性，对细菌有很强的杀伤作用，可以作为抗生素的替代品，无需考虑耐药性的问题。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种芽孢杆菌与乳酸菌复合抗菌肽的制备方法。
[0006]本发明同时还提供了一种芽孢杆菌与乳酸菌复合抗菌肽的用途。
[0007]本发明是这样实现的，一种芽孢杆菌与乳酸菌复合抗菌肽的制备方法，包括以下步骤:
[0008](I)斜面保存的芽孢杆菌、乳酸菌高产株分别进行斜面活化；
[0009](2)用牙签挑取少量活化的芽孢杆菌、乳酸菌分别接种到脱脂乳液体培养基中进行培养；
[0010](3)将步骤⑵中得到的芽孢杆菌和乳酸菌按照1: 2的比例，3% -10%的接种量接种到发酵培养基培养得抗菌肽发酵液；
[0011](4)发酵液低温离心，取上清，冷冻干燥制得抗菌肽粉末，分袋包装。
[0012]步骤(2)所述脱脂乳液体培养由脱脂奶粉和水按照1: 8比例配制，110°C灭菌15min。
[0013]步骤(3)所述发酵培养基为胰蛋白胨5.0g、鱼蛋白胨5.0g、牛肉膏5.0g、酵母浸膏
2.5g、抗坏血酸0.5g、硫酸镁0.25g、甘油10.0g、乳糖3.0g、磷酸氢二钾5.0g、琼脂30.0g、蒸溜水1L，另加I %的葡萄糖。用NaOH调节pH至6.9，121°C蒸汽灭菌20min制得。
[0014]本发明采用发酵培养的方式得到芽孢杆菌、乳酸菌复合抗菌肽，发酵过程工艺简单，发酵产物无需精制，可以直接使用，易于推广。本发明抗菌肽具有作用范围广，促生长的作用。
[0015]按照上述方法制备的复合抗菌肽可以作为饲料添加剂，按照2-5%的比例添加到动物饲料中，对于改善畜舍环境和促进动物生长有的积极作用。
【具体实施方式】
[0016]本发明通过以下实施例进一步详述。需要说明的是:下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
[0017]本发明提供了一种芽孢杆菌和乳酸菌复合抗菌肽的制备方法，其制作步骤如下:
[0018](I)按照划线法将芽孢杆菌和乳酸菌高产株接种到斜面培养基上，于37°C培养24小时。斜面培养基为PDA培养基，新鲜马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000ml煮沸30分钟，纱布过滤。
[0019](2)用牙签挑取少量活化的芽孢杆菌、乳酸菌分别接种到脱脂乳液体培养基中，于37°C 200rmp的摇床上培养24小时。脱脂乳液体培养基由脱脂奶粉和水按照1: 8比例配制，IlCTC灭菌 15min。
[0020](3)发酵培养基按照本领域常用的方法进行灭菌，冷却处理，具体于121°C蒸汽灭菌20min，按照4%的接种量将步骤(2)培养的菌液按2: I的比例接种到发酵培养基，370C 200rmp的摇床上培养24小时，得抗菌肽发酵液。
[0021](4)抗菌肽发酵液，4°C离心12000rmp离心15分钟，弃去沉淀，上清液-80°C冷冻12-24小时候后放入冷冻干燥机干燥成粉。分袋密封4°C保存。本发明复合抗菌肽的用途:
[0022]试验选择条件相近的4栋猪舍(每个栋舍450头左右，猪只日龄在35日龄左右)，随机分为对照组和试验组，每组2个重复，每个重复2各栋舍。对照组饲喂基础日粮，试验组基础日粮中添加2.5%复合抗菌肽，试验期I个月，观察效果。
[0023]表1:复合抗菌肽`对仔猪生长性能的影响
[0024]
【权利要求】
1.一种芽孢杆菌与乳酸菌复合抗菌肽的制备方法，包括以下步骤: (1)斜面保存的芽孢杆菌、乳酸菌高产株分别进行斜面活化； (2)用牙签挑取少量活化的芽孢杆菌、乳酸菌分别接种到脱脂乳液体培养基中进行培养; (3)将步骤(2)中得到的芽孢杆菌和乳酸菌按照1: 2的比例，3%-10%的接种量接种到发酵培养基培养得抗菌肽发酵液； (4)发酵液低温离心，取上清，冷冻干燥制得抗菌肽粉末，分袋包装。 步骤(2)所述脱脂乳液体培养由脱脂奶粉和水按照1: 8比例配制，110°C灭菌15min。步骤(3)所述发酵培养基为胰蛋白胨5.0g、鱼蛋白胨5.0g、牛肉膏5.0g、酵母浸膏2.5g、抗坏血酸0.5g、硫酸镁0.25g、甘油10.0g、乳糖3.0g、磷酸氢二钾5.0g、琼脂30.0g、蒸溜水1L，另加I %的葡萄糖。用NaOH调节pH至6.9，121°C蒸汽灭菌20min制得。
2.根据权利I要求所述的一种芽孢杆菌与乳酸菌复合抗菌肽，其特征在于，芽孢杆菌与乳酸菌活化培养的条件为37°C培养24-36小时。
3.根据权利I要求所述一种芽孢杆菌与乳酸菌复合抗菌肽的制备方法，其特征在于，活化的芽孢杆菌、乳酸菌分别接种到脱脂乳液体培养基中，于37°C 100-300rmp的摇床上培养24-36小时。
4.根据权利I要求所述的一种芽孢杆菌与乳酸菌复合抗菌肽的制备方法，其特征在于，3%-10%的接种量，芽孢杆菌与乳酸菌按2: I的比例接种到发酵培养基，370C 100-300rmp的摇床上培养24-36小时。
5.根据权利I要求所述的一种芽孢杆菌与乳酸菌复合抗菌肽的制备方法，其特征在于，4°C离心8000-12000rmp离心10-50分钟，上清液_80°C冷冻12-24小时候，分袋密封4°C保存。
【文档编号】C12R1/07GK103525894SQ201210225229
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2012年7月3日 优先权日:2012年7月3日
【发明者】安同伟, 陈庆忠, 胡景威, 李迎梅 申请人:天津市中敖饲料有限公司