专利名称：一种猪肉风味肽及其生产方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程和食品添加剂领域，具体涉及一种猪肉风味肽及其生产方法与应用。
背景技术：
食品具有营养、安全和感官三大要素。滋味是食品感官质量最重要的属性之一，主要是通过舌头的味蕾感知，其次是自由神经末梢，是水溶性物质刺激味觉感受器再经过味觉神经传入到大脑的味觉中枢，经分析整合产生的化学感应。滋味一般由甜味、成味、苦味、酸味和鲜味五种基本味觉构成，它们的味觉感受器分别位于舌头的不同区域，同时口腔后部，胃和直肠也有部分能与呈味物质发生特异性结合的受体，呈味物质与这些受体结合后并不能让人产生味感，而只是起到加强味感的作用。呈味肽是指从食物中提取或由氨基酸合成得到的对食品风味具有一定贡献的相对分子量低于5000u的寡肽类，包括·特征滋味肽和风味前体肽。呈味肽具有多种滋味特征，其呈味效果往往不是单一的某种滋味，而是各种滋味的综合效应，从而赋予食品鲜美浓郁、圆润香滑、回味悠长的味感。呈味肽存在于肉类、水果和蔬菜等各种食物中，无论对于加工食品还是未经加工食品的风味都非常重要。呈味肽不但能产生特征滋味，还可以作为挥发性风味物质的前体物参与美拉德反应，形成特殊的芳香气味，因此通常所说的各种肽的呈味作用是其综合效果。基因工程技术在食品工程领域得到了越来越多的应用。在蛋白类香精生产方面，利用基因工程方法特异性表达蛋白类香精具有目前酶法水解方法无法比拟的专一性强的优点，同时也将克服目前蛋白类香精生产原料成分不确定，有苦味物质存在，影响产品风味等缺点，得到了世界香精香料大公司和一些研究单位的重视。天津科技大学曾松荣等中国生物工程杂志发表《重组毕赤酵母发酵牛肉风味肽的中试研究》，称在毕赤酵母中表达牛肉风味肽，生产的牛肉风味肽具有牛肉风味特征，但其采用的表达宿主菌是毕赤酵母，其利用甲醇作为碳源与诱导剂具有较高的食品安全隐患。
发明内容
本发明的目的在于根据现有技术中存在的上述不足，提供一种具有强烈猪肉风味特征与高食品安全的猪肉风味肽。本发明另一目的在于提供上述猪肉风味肽的生产方法。本发明还有一个目的在于提供上述猪肉风味肽的应用。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现一种猪肉风味肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。编码所述猪肉风味肽的核苷酸序列如SEQ ID NO : 2所示。一种重组质粒，是将所述猪肉风味肽基因连入酿酒酵母分泌表达载体PlCAS中，构成重组质粒。
一种重组菌株,是携带有所述重组质粒质粒的菌株Escherichia coli Top 10/PICAS-PFP。一种重组工程菌，由所述重组质粒转化酿酒酵母宿主菌酿酒酵母MT8-1后得到。本发明所述猪肉风味肽的生产方法，其特征在于包括如下步骤(I)将猪肉通过木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、中性蛋白酶中的一种或几种酶解获得猪肉酶解物，通过Sephadex G_15凝胶柱分离不同肽类物质，并进行感官评价，利用MALD1-T0F-MS质谱分析鉴定感官评价6. 5分以上的呈味肽肽段序列，得到具有明显猪肉风味特征的猪肉风味肽氨基酸序列；(2)利用酿酒酵母偏好密码子设计与猪肉风味肽氨基酸序列相对应的核苷酸序列，通过β_乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动合成仪合成；(3)为实现猪肉风味肽在酿酒酵母中分泌表达，采用PICAS质粒，该质粒主要包含它有一个启动子GAPDH，一个来自葡萄糖淀粉酶的分泌信号序列，一个多克隆位点(包含Sac I1、Bgl I1、Xho1、Nco I酶切位点);含有两个选择性遗传标记TRPl和Ampr以及一个可在大肠杆菌中独立复制的复制起始位点ColElori，在其基础上引入技术方案I中合成的基因(SEQ ID NO 3)，合成的基因中引入Bgl II与Xho I酶切位点，把合成基因与PICAS质粒通过Bgl II与Xho I进行双酶切，体外连接构建重组质粒pICAS-pfp ；(4)以LiCl法将Xba I线性化的质粒pICAS-p fp转化酿酒酵母MT8-1，在SD平板上培养3-4天，挑取SD平板上的克隆转化子，提取基因组DNA作为模板，进行酵母重组基因组PCR鉴定，获得重组转化子；(5)将重组转化子接种至ImL YI3D培养基中培养适当时间后，转接到50mlSDC培养基中培养72h离心收集上清液，对上清液进行抽滤，即得到具有强烈猪肉风味的猪肉风味肽； 其中，步骤(I)中所述感官评价的方法是将酶解产物水提物凝胶柱分离峰组分冻干粉，按照O. 2mg/mL的质量浓度添加到纯水中,请12名感官评定员进行评定,评定的定义是添加酶解产物纯水的浓厚味强度为4分，并以八分标度法对样品浓厚感强度进行标度检验，从而评定这酶解产物对猪肉风味的影响。每个评价样品都随机3位数编号后，打乱顺序交给评价员进行滋味评定，同一个样品每名评价员评价3次，，取3次测定平均值为最终评价分数。本发明猪肉风味肽与10%木糖、6%核糖、50%奶油、14%丙二醇、20%水调节pH值6. 5，在100°C加热2h，除去上层奶油层即得猪肉热反应香精。在200g本发明猪肉风味肽中加入10%肉豆蘧油、5%姜油，7%月桂油，7%孜然油、3%芥末油加入单甘酯乳化lOmin，即得具有猪肉风味的调味品。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果本发明采用酿酒酵母表达体系分泌表达从猪肉酶解物中分离纯化出的猪肉风味肽，在保持猪肉风味的同时，与一般昂贵的通过蛋白酶酶解猪肉获得猪肉风味肽的方法比起来具有产量高、生产成本低可工业化应用等优点。酿酒酵母作为酿酒工业中广泛应用的菌种，具有遗传背景清晰并且已经被证明是一种安全的可应用于食品的微生物。利用酿酒酵母作为表达体系的宿主菌，在高效、快速、低成本获取猪肉风味肽的同时保证了获取的猪肉风味肽食品安全的问题。
具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施例1猪肉风味肽的氨基酸序列与基因序列将猪肉通过木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、中性蛋白酶中的一种或几种酶解获得猪肉酶解物，通过Sephadex G_15凝胶柱分离不同肽类物质，将酶解产物水提物凝胶柱分离峰组分冻干粉，按照O. 2mg/mL的质量浓度添加到纯水中，请12名感官评定员进行评定，评定的定义是添加酶解产物纯水的浓厚味强度为4分，并以八分标度法对样品浓厚感强度进行标度检验，从而评定这酶解产物对猪肉风味的影响。每个评价样品都随机3位数编号后，打乱顺序交给评价员进行滋味评定，同一个样品每名评价员评价3次，取3次测定平均值为最终评价分数。取感官评价分数在6. 5分以上的组分，利用MALD1-T0F-MS质谱分析鉴定感官评价6. 5分以上的呈味肽肽段序列，得到具有明显猪肉风味特征的猪肉风味肽氨基酸序列，基因序列根据猪肉风味肽氨基酸序列利用酿酒酵母偏好密码子设计基因序列，得到具有猪肉风味肽的基因序列(PfP)。具体的序列见SEQ ID NO I与SEQ ID NO 2。设计的基因在两端引入Bgl II与Xho I酶切位点，并在两端引入GCGC保护碱基(SEQ ID NO 3)后委托上海生物工程有限公司合成。实施例2重组质粒pICAS-pfp的构建将上述合成的基因序列与质粒pICAS进行双酶切。体系为无菌(ΜΗ2013μ1、质粒pICAS 或 pfp 基因 3μ 1、10XM buffer 2μ1、Bgl II I μ1、Xho I μ I。将双酶切后的 pfp基因与质粒进行体外的连接后用CaC12转化法转入Ε. coli ToplOF，在Amp+LB (50mg/ml)平板上涂板，过夜培养。提取 阳性转化子委托上海生物工程有限公司进行测序。实施例3表达猪肉风味肽工程菌的构建培养将质粒pICAS-pfp线性化后按照以下方法转化酿酒酵母分别在ΙΟΟμ I新制备酵母感受态细胞的Ep管中加入3 μ I Xba I线性化处理的pICAS、pICAS-celAL-CALB，再加入10 μ I变性处理的Herring Testes Carrier DNA(购自Takara公司)轻轻混勻。每管中加Λ 600 μ L PEG/LiAc溶液，轻轻振荡混匀。30°C温育30分钟，每隔10分钟轻摇振荡一次，以混匀溶液。加入70 μ L DMSO，轻摇混匀。42°C热激15min,每5min轻摇振荡一次。热激后在冰上放置15min。14, OOOrpm高速离心5min。弃去上清，用500 μ L TE溶液悬浮细胞。取200 μ L涂布于SD平板上培养3-4 天。利用目的基因的基因序列，提取SD平板上单克隆转化子提取酵母基因组PCR鉴定总反应体积为20 μ L，酶量为2U，取2 μ LPCR产物进行O. 8%琼脂糖凝胶电泳鉴定。实施例4猪肉风味调味品的制备在200g猪肉风味肽中加入10%肉豆蘧油、5%姜油，7%月桂油，7%孜然油、3%芥末油加入单甘酯乳化lOmin，即得具有猪肉风味的调味品。实施例5热反应猪肉香精的制备取500g猪肉风味肽加入10%木糖、6%核糖、50%奶油、14%丙二醇、20%水调节pH值6. 5，在100°C加热2h，除去上层奶油层即得猪肉热反应香精。序列表
发明名称一种猪肉风味肽及其生产方法与应用申请人广州市澳键丰泽生物科技有限公司
SEQ ID NO:〗猪肉风味肽氨基酸序列
Gly-V al-Glu-Asn—Ala-V al-V al-Pro-Gln-Asn
SEQ ID N02猪肉风味肽核苷酸序列
GGT-GTT-GAA-AAT-GCT-GTT-GTT-CCA-CAA-AAT
SEQ ID N0:3 GCGC保护碱基
GCGC-GGT-GTT-GAA-AAT-GCT-GTT-GTT-CCA-CAA-AAT—GCGC
权利要求
1.一种猪肉风味肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.编码权利要求1所述猪肉风味肽的核苷酸序列如SEQID N0:2所示。
3.—种重组质粒，其特征在于是将权利要求2所述猪肉风味肽基因连入酿酒酵母分泌表达载体PlCAS中，构成重组质粒。
4.一种重组菌株，其特征在于是携带有权利要求3所述重组质粒质粒的菌株Escherichia coli Top 10/pICAS_PFPo
5.一种重组工程菌，其特征在于由权利要求3所述重组质粒转化酿酒酵母宿主菌酿酒酵母MT8-1后得到。
6.权利要求1所述猪肉风味肽的生产方法，其特征在于包括如下步骤 (1)将猪肉通过木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、中性蛋白酶中的一种或几种酶解获得猪肉酶解物，通过Sephadex G_15凝胶柱分离不同肽类物质，并进行感官评价，然后利用MALD1-TOF-MS质谱分析鉴定感官评价6. 5分以上的呈味肽肽段序列，得到具有明显猪肉风味特征的猪肉风味肽氨基酸序列； (2)利用酿酒酵母偏好密码子设计与猪肉风味肽氨基酸序列相对应的核苷酸序列，通过￠-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动合成仪合成； (3)为实现猪肉风味肽在酿酒酵母中分泌表达，采用PICAS质粒，在其基础上引入GCGC保护碱基(如SEQ ID NO :3所示)，合成的基因中引入Bgl II与Xho I酶切位点，把合成基因与PICAS质粒通过Bgl II与Xho I进行双酶切，体外连接构建重组质粒pICAS-pfp ； (4)以LiCl法将XbaI线性化的质粒pICAS-p fp转化酿酒酵母MT8-1，在SD平板上培养3-4天，挑取SD平板上的克隆转化子，提取转化子酿酒酵母基因组DNA作为模板，进行酵母重组基因组PCR鉴定，获得重组转化子； (5)将重组转化子接种至ImLYH)培养基中培养24h后，转接到50mlSDC培养基中培养72h离心收集上清液，对上清液进行抽滤，即得到具有强烈猪肉风味的猪肉风味肽； 其中，步骤(I)中所述感官评价的方法是将酶解产物水提物凝胶柱分离峰组分冻干粉，按照0. 2mg/mL的质量浓度添加到纯水中，请12名感官评定员进行评定，评定的定义是添加酶解产物纯水的浓厚味强度为4分，并以八分标度法对样品浓厚感强度进行标度检验，从而评定这酶解产物对猪肉风味的影响。每个评价样品都随机3位数编号后，打乱顺序交给评价员进行滋味评定，同一个样品每名评价员评价3次，取3次测定平均值为最终评价分数。
7.权利要求1所述猪肉风味肽在制备猪肉香精中的应用，其特征在于200g的猪肉风味肽中加入10%肉豆蘧油、5%姜油，7%月桂油，7%孜然油、3%芥末油加入单甘酯乳化IOmin,即得具有猪肉风味的调味品。
8.权利要求1所述猪肉风味肽在制备猪肉风味调味料的应用，其特征在于10%猪肉风味肽加入10%木糖、6%核糖、50%奶油、14%丙二醇、20%水调节pH值6. 5，在100°C加热2h,除去上层奶油层即得猪肉热反应香精。
全文摘要
本发明公开了一种猪肉风味肽及其生产方法与应用。本发明所述猪肉风味肽的氨基酸序列如SEQ ID NO1所示，编码该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。本发明将猪肉风味肽基因经过密码子优化，在酿酒酵母中高效分泌表达，得到的猪肉风味肽具有很强的猪肉风味，适合应用于调味品或香精领域。
文档编号C12R1/19GK103044525SQ20121023568
公开日2013年4月17日 申请日期2012年7月9日 优先权日2012年7月9日
发明者江逢春, 云帆, 许小博, 彭勇, 钟健 申请人:广州市澳键丰泽生物科技有限公司