专利名称：一种微生物产γ-谷氨基甲酰胺合成酶催化合成L-茶氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种近玫色锁掷孢酵母(Sporidiobolus pararoseus)T_C2,尤其涉及利用该微生物发酵生产的Y -谷氨基甲酰胺合成酶来催化合成L-茶氨酸的方法。
背景技术：
L-茶氨酸(L-Theanine)是茶树中特有的非蛋白质游离氨基酸，它是茶叶中主要的品质与功能成分之一，因其具有安神镇静、免疫调节等多种生理作用而广泛应用于食品、药品及饲料添加剂等领域，并于2002年被美国健康食品行业评为最具潜力的天然产物之L-茶氨酸的天然来源途径极少，茶树体内的L-茶氨酸是以谷氨酸和乙胺为底物，在茶氨酸合成酶的作用下形成的，它与茶树氮代谢有密切关联。目前其制备主要包括从茶叶中直接分离纯化、化学合成和生物合成等几种方法(I)分离纯化由于茶叶中还存在其他较高浓度的可溶性物质，如咖啡因和茶多酚等，那么针对现阶段的研究，最为关键的难点在于如何分离纯化得到高纯度L-茶氨酸。(2)化学合成茶氨酸化学合成提供了一种简单、方便、廉价的生产方法。但是化学合成会产生较多副产物，而且得到的产物是L-构型与D-构型的消旋体，同时反应时间较长、污染大，经济效益不够理想。(3)生物合成从产品加工成本、产品安全性以及产品质量等方面考虑，生物合成是制备L-茶氨酸的发展趋势。目前，国内外L-茶氨酸生物合成主要包括茶树细胞悬浮培养、茶树愈伤组织培养、及微生物酶促合成等方法。现在国外L-茶氨酸生物合成主要采用微生物酶促合成法生产。合成L-茶氨酸的微生物酶的研究主要集中于谷氨酰胺酶、谷氨酰胺合成酶、Y-谷氨酰基转肽酶和Y-谷氨基甲酰胺合成酶四种。上述四种微生物酶均具有Y-谷氨酰基转移功能，即在适宜条件下皆能将谷氨酰基转移给乙胺而合成L-茶氨酸，但合成机制有所不同。其中，谷氨酰胺转肽酶合成途径须以谷氨酰胺和乙胺为底物，而其他三种则可以谷氨酸和乙胺为底物，偶联酵母发酵作为ATP产生系统，就能合成L-茶氨酸。由于谷氨酰胺市价过高，且相比谷氨酰胺酶和谷氨酰胺合成酶，Y -谷氨基甲酰胺合成酶对乙胺具有较高的亲和力，反应中不产生副产物谷氨酰胺，使得其成为L-茶氨酸酶促合成的主要研究方向。由此可见，就目前L-茶氨酸的市场关注度和需求量而言，寻找一种能够生产合成L-茶氨酸的微生物Y-谷氨基甲酰胺合成酶，并建立Y-谷氨基甲酰胺合成酶催化合成L-茶氨酸的方法对其产业的未来发展具有重要的理论意义和实践价值。然而，因受到研究方法与技术手段的限制，对Y-谷氨基甲酰胺合成酶的酶源筛选、培养与固定化及其酶促合成L-茶氨酸等关键技术难点，国内外目前尚未取得突破性进展。因此，开展微生物产Y -谷氨基甲酰胺合成酶催化合成L-茶氨酸的研究已成为当前L-茶氨酸制备的热点问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种近玫色锁掷孢酵母(Sporidiobolus pararoseus) T-C2,同时还提供利用该近玫色锁掷孢酵母(Sporidiobolus pararoseus)T_C2发酵生产的Y -谷氨基甲酰胺合成酶催化合成L-茶氨酸的方法。本发明的近玫色锁掷抱酵母(Sporidio bolus pararoseus)T_C2,已于2012年6月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCN0 :M2012232，保藏地址中国，武汉，武汉大学。本发明菌株近玫色锁掷孢酵母T-C2，菌落呈玫粉色，形态呈卵圆形凸起，不透明，表面光滑，边缘平整，菌体粘稠，易挑起，菌体多呈椭圆形或球杆状有锁状联合，年幼的菌落中可生出茁芽；经生化检测发现，糖发酵、硝酸盐还原和类淀粉物质的生成试验均呈阴性，脲酶试验呈阳性；经分子生物学鉴定，获得555 bp序列，BLAST比对分析表明，该菌株与近玫色锁掷抱酵母(Sporidiobolus pararoseus)最为接近。参照《真菌鉴定手册》、中国真菌志及酵母菌各属检索表，按J · Lodder酵母分类学鉴定进行分析，由检索表将其归为近玫色锁掷孢酵母(Sporidiobolus pararoseus)。将本发明的菌株T-C2接种于富集培养基中发酵，可得到Y-谷氨基甲酰胺合成酶发酵液，发酵条件为接种量为5-10%，温度为28-30°C，转速为120-180r/min，振荡培养2-4天。该富集培养基的组成为0. 25%甲胺盐酸盐、0. 25 %甲醇、0. 2 % NaCUO. I % KC1、
0.03 % MgS04.7H20、0· 005 % KH2PO4、0· 005 % K2HPO4 UXlO ' 7 % VB12 及 O. 03 % 酵母粉，ρΗ7· 0-7. 4。本发明还提供由上述发酵液得到纯化的Y-谷氨基甲酰胺合成酶的方法，是将上述发酵液于4°C、12000 r/min离心15-20min,弃去上清,用10 mmol/L pH 6. O的磷酸盐缓冲液浸洗两次后，再于4°C、12000 r/min离心15_20min，弃去上清，然后将得到的细胞重悬于少量缓冲液中，缓冲液没住细胞即可，再于冰上用20 kHZ的超声波进行细胞破碎2-3min,得到粗酶液；将粗酶液调节pH值为8_9，在30°C条件下加入30-35%饱和度的硫酸铵进行盐析，用蛋白沉淀重溶液重溶至原始体积，超滤脱盐后进行SephadexG-75柱层析得到纯化的Y-谷氨基甲酰胺合成酶。本发明同时还提供利用上述方法得到的纯化的Y-谷氨基甲酰胺合成酶合成L-茶氨酸的方法，该方法是将上述纯化得到的Y -谷氨基甲酰胺合成酶按每升L-茶氨酸合成体系加0. 01-0. 02mL Y -谷氨基甲酰胺合成酶的比例加入到装有L-茶氨酸合成体系的试管中反应，在30-35°C、pH值为8-9的条件下反应10_12h后，将试管浸入沸水中终止反应，冷却至室温后，离心取上清，得到L-茶氨酸。其中，上述L-茶氨酸合成体系的组成为30 mmol /I,谷氛酸、150 mmol /I,乙胺盐酸盐、15 mmol /T, ATP>30 mmol/L MgCl2、ρΗ7· 75 的100 mmol/L 咪唑缓冲液、及 0. lmg/mL CTAB。本发明从筛选生产合成L-茶氨酸的微生物Y-谷氨基甲酰胺合成酶酶源入手，利用筛选出的微生物菌株生产Y -谷氨基甲酰胺合成酶，将其加入经优化的酶促合成L-茶氨酸体系中生产L-茶氨酸，并根据其酶促合成L-茶氨酸的产量判定酶活力高低，得到最佳的生产Y-谷氨基甲酰胺合成酶方法。本发明得到的近玫色锁掷孢酵母培养条件简单，无需严格控制生长环境，且酵母偶联ATP发酵反应已有较为成熟的研究基础，具有良好的开发前景。而利用微生物自身活动产生的具有体外茶氨酸合成酶活性的生物酶，在人工控制的特殊条件下，只要给予适当的底物、能量及适宜的外界条件，进行发酵生产，就可以得到安全、无污染、无毒副作用的L-茶氨酸。本发明成果可应用于后续的L-茶氨酸生产中，在绿色、无污染的基础上提高产量，实现了安全、简便、高效、经济化生产，为今后开展L-茶氨酸大规模微生物酶促发酵生产提供了理论和实践依据。
具体实施例方式下述实施例中的培养基组成如下，培养基组成如无特别说明，皆为常规配制。筛选培养基0.25% 甲胺盐酸盐、O . 25% 甲醇、O. 2 % NaCl、O. I % KC1、0. 03 %MgS04.7H20、0· 005% ΚΗ2Ρ04、0· 005% K2HPO4、及 I X 10 ' 7 % VB12, ρΗ7· 0-7. 4 ；纯化培养基同筛选培养基，另加20g/L琼脂；富集培养基同筛选培养基，另加O. 03%酵母粉；磷酸钾缓冲液pH 6. 0，含10%甘油、lmmol/L MgCl2、及lmmol/L 2-巯基乙醇；实施例I本发明菌株的制备(I)菌种驯化从湖南省茶叶研究所高桥实验茶场生长状况良好的茶树根际15-25cm处土壤中取样，将IOg新鲜土样装入含有90mL无菌水的三角瓶中,用玻璃珠打散,置于恒温摇床中，25°C、150 r/min振荡lh，制成土壤悬液，静置。按2%体积比将土壤悬液上清加入筛选培养基中，30°C、150 r/min振荡培养5-14天后，将浑浊的培养基(0D610值大于O. I)转到新鲜的筛选培养基中，再培养至浑浊，这个过程反复3-5次，即得到驯化菌液。(2)菌株分离纯化将驯化菌液用无菌水依次逐级稀释至lO'lO'lO'lO'lO'lO—6六个稀释度，分别涂布于平板上，并做平行样，30°C恒温培养3-7天。选取菌落生长疏密适当的倍数(10_4或10_5)，挑选单菌落于纯化培养基上进行划线分离。30°C培养3-7天后，菌落被初步纯化，重复一次，3-7天后分离出本发明菌株，斜面划线保存。实施例2 Y -谷氨基甲酰胺合成酶的制备取上述得到的斜面菌株，挑取一环置于40mL富集培养基中，30°C、150r/min振荡培养3天，检测OD值大于0. I即可。再将富集培养液4°C、12000r/min离心18min，弃去上清，用10 mmol/L pH 6. O的磷酸盐缓冲液浸洗两次后,再于4°C、12000r/min离心18min,弃上清，然后将得到的细胞重悬于少量缓冲液中(没住细胞即可)，再于冰上进行超声细胞破碎(20 kHZ，2-3 min)，制成粗酶液。将粗酶液调节pH值为8，在30°C条件下加入30%饱和度的硫酸铵进行盐析，用蛋白沉淀重溶液重溶至原始体积，超滤脱盐后进行SephadexG-75柱层析即可。将得到的上述产物采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，采用5%浓缩胶、12%分离胶，以低分子量标准蛋白(ll_72ku)对照，测定产物的酶蛋白分子量为17-26ku之间，可确定纯化得到的产物即为Y-谷氨基甲酰胺合成酶。实施例3 Y -谷氨基甲酰胺合成酶催化合成L-茶氨酸将纯化的Y -谷氨基甲酰胺合成酶按每升L-茶氨酸合成体系加0. 02mL Y -谷氨基甲酰胺合成酶的比例加入到装有L-茶氨酸合成体系的试管中反应，在30°C、pH值为8的条件下反应12h后将试管浸入沸水中终止反应,冷却至室温后，12000r/min离心5 min,取上清，得到L-茶氨酸，-20°C保存。其中，L-茶氨酸合成体系为30 mmol/L谷氨酸、150 mmol/L乙胺盐酸盐、15mmol/L ATP,30 mmol/L MgCl2UOO mmol/L 咪唑缓冲液(pH7. 75)、及 0. lmg/mL CTAB。实施例4 Y-谷氨基甲酰胺合成酶酶活力检测使用HPLC高效液相色谱对产物进行检测，通过检测得到的L-茶氨酸产量来衡量相对酶活力高低。HPLC高效液相色谱检测条件日本岛津高效液相色谱仪，离子对色谱法。色谱柱KromasilTMC18(5 μ m, 200 mmX 4. 6 mm);流动相 A :0. 1% 憐酸水溶液(添加 10 mol/L SDS);流动相B :乙腈；流速为lml/min ;检测器光电二极管阵列检测器，检测波长为200nm ;柱温32°C ;进样量为10 μ L。经HPLC检测L-茶氨酸合成产量为16. 90mmol/L,与现有微生物酶促合成L-茶氨 酸技术相比较，结果如下表I:表I L-茶氨酸产量对比表
权利要求
1.一种产Y-谷氨基甲酰胺合成酶的菌株，该菌株为近玫色锁掷孢酵母(Sporidiobolus pararoseus) T-C2,已于2012年6月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO M2012232o
2.权利要求I所述的菌株在制备Y-谷氨基甲酰胺合成酶中的应用。
3.一种发酵法制备Y-谷氨基甲酰胺合成酶发酵液的方法，其特征在于发酵所用菌株为权利要求I所述的菌株，发酵所用培养基为富集培养基，发酵条件为接种量为5-10%，温度为28-30°C，转速为120-180r/min，振荡培养2-4天。
4.如权利要求3所述的发酵法制备Y-谷氨基甲酰胺合成酶发酵液的方法，其特征在于所述富集培养基的组成为0. 25%甲胺盐酸盐、O. 25 %甲醇、O. 2 % NaCUO. I % KCl、O. 03 % MgS04*7H20、0. 005 % KH2PO4、O. 005 % K2HPO4 UXlO ' 7 % VB12 及 O. 03 % 酵母粉，ρΗ7· 0-7. 4。
5.如权利要求3或4所述方法得到的Y-谷氨基甲酰胺合成酶发酵液。
6.由权利要求5所述的发酵液制得的Y-谷氨基甲酰胺合成酶粗酶液。
7.如权利要求6所述的Y-谷氨基甲酰胺合成酶粗酶液，其特征在于该粗酶液是将发酵液于4°C、12000 r/min离心15_20min,弃去上清,用10 mmol/L pH 6.0的磷酸盐缓冲液浸洗两次后，再于4°C、12000 r/min离心15_20min，弃去上清，然后将得到的细胞重悬于少量缓冲液中，缓冲液没住细胞即可，再于冰上用20 kHZ的超声波进行细胞破碎2-3min，即可。
8.利用权利要求6或7所述的Y-谷氨基甲酰胺合成酶粗酶液纯化得到Y-谷氨基甲酰胺合成酶的方法，其特征在于该方法是将所述粗酶液调节PH值为8-9，在30°C条件下加入30-35%饱和度的硫酸铵进行盐析，用蛋白沉淀重溶液重溶至原始体积，再超滤脱盐后，采用SephadexG-75柱层析得到。
9.利用权利要求8所述的纯化的Y-谷氨基甲酰胺合成酶合成L-茶氨酸的方法，其特征在于该方法是将上述纯化得到的Y-谷氨基甲酰胺合成酶按每升L-茶氨酸合成体系加O. 01-0. 02mL Y-谷氨基甲酰胺合成酶的比例加入到装有L-茶氨酸合成体系的试管中反应，在30-35°C、pH值为8-9的条件下反应10_12h后，将试管浸入沸水中终止反应，冷却至室温后，12000 r/min离心4-6min,取上清,得到L-茶氨酸。
10.如权利要求9所述的合成L-茶氨酸的方法，其特征在于所述L-茶氨酸合成体系为30 mmol /I,谷氛酸、150 mmol /I,乙胺盐酸盐、15 mmol /T, ATP>30 mmol/L MgCl2、pH7. 75的 100 mmol/L 咪唑缓冲液、及 0. lmg/mL CTAB。
全文摘要
一种微生物产γ-谷氨基甲酰胺合成酶催化合成L-茶氨酸的方法，是从茶树根际土壤筛选得到γ-谷氨基甲酰胺合成酶酶源菌株近玫色锁掷孢酵母(Sporidiobolus pararoseus)T-C2，保藏编号为CCTCC NOM2012232，以获得纯化的γ-谷氨基甲酰胺合成酶，并应用该酶进行酶促合成L-茶氨酸，从而得到了具有高酶活力的γ-谷氨基甲酰胺合成酶生产合成L-茶氨酸的方法，其合成效率远高于现有微生物酶酶促合成L-茶氨酸技术，实现了安全、简便、高效、经济化生产，为后续开展L-茶氨酸大规模微生物酶促发酵生产提供了理论和实践依据。
文档编号C12P13/04GK102719367SQ201210235889
公开日2012年10月10日 申请日期2012年7月10日 优先权日2012年7月10日
发明者张玥, 肖文军, 龚志华 申请人:湖南农业大学