专利名称：Bcl-2/IgH基因重排在作为B细胞淋巴瘤骨髓浸润标志中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及Bcl-2/IgH基因重排在作为B细胞淋巴瘤骨髓浸润标志中的应用，特别涉及用于检测Bcl-2/IgH基因重排的物质或/和仪器在制备筛查B细胞淋巴瘤疑似骨髓浸润或潜在骨髓浸润患者产品中的应用。
背景技术：
B细胞淋巴瘤(B-NHL)在肿瘤病理组织学诊断中属于疑难病种之一，种类繁多，分类复杂，弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤(NHL)中最频发的类型，占新诊断NHL 的 30-40%。由于骨髓内造血细胞的组织学特点，常规的病理组织形态学和免疫组织化学染色技术可以检测出骨髓受侵，合并白血病阶段，对骨髓微小浸润尚不能满足诊断需要，微小浸润病灶是淋巴瘤复发的主要根源，骨髓是否浸润直接影响DLBCL的分期，进而影响治疗及预后。目前，评价淋巴瘤骨髓浸润与否的常用方法是骨髓涂片细胞形态学染色，该方法存在一定的局限性一是淋巴瘤细胞形态变化多样不好辨认，尤其化疗后更是难判别，易导致假阳性和假阴性；二是常规判定幼稚淋巴细胞> 5%为骨髓受侵，而正常人骨髓幼稚淋巴细胞< 1%。这就给我们提出了如下迫切需要解决的问题对于骨髓形态学检查幼稚淋巴细胞在1-5%之间，如何判定哪些是正常状态，哪些是骨髓形态学阴性的潜在的微小浸润？骨髓形态学检查固然重要，如何增加其他辅助手段减少人为因素尽量达到标准化？个体化治疗需要实验室提出个体化的诊断，骨髓检查如何为下一步的临床靶向治疗提供有价值的靶点？这些问题现阶段均无满意的答案。人类B淋巴细胞在发育至前B细胞阶段时重组酶有选择地将分隔在胚系基因染色体上的可变区(V)、多样区(D)、连接区(J)及恒定区(C)基因连接，即所谓重链(IgH)重排。由于V、D、J基因是多拷贝的，其间又有随机碱基插入(N区插入)V-D. D-J之间，因此所形成的V-N-D-N-J序列数以百万计，但对于每个B淋巴细胞来说该序列却是独特的。B-NHL是由巳完成IgH重排的B细胞恶变来的。bcl-2/IgH重排中bcl-2断点发生于距bcl_2第3个外显子3’端280bp的非翻译区，称为主要断裂区(major breakpoint region, MBR),发生于距主要断裂区30kb的下游，称为次要断裂区(minor cluster region，MCR)，其余的断裂点分布在MBR和MCR之间或bcl-2基因5’端序列。IgH的断点在J片段的5’侧，大多位于J5和J6，少数断裂点位于IgH的JH区3'端,极少数位于IgH的转换区。D-J之间可有碱基缺失，bcl-2同额外的碱基一起插入该区，形成bcl-2/IgH融合基因。发生在MBR的重排，产生bcl-2/IgH融合mRNA转录；发生在MCR的重排，导致bcl-2mRNA水平上调。随后可能是在MBR和MCR之间插入了一小段包含E u增强子的IgH基因超越了正常的bcl — 2基因调控过程，导致bcl-2基因在B细胞的高表达，从而抑制B细胞凋亡，使B细胞持续增殖，引发肿瘤。
间期核FISH技术的研究材料广泛，无论是细胞病理学的涂片、印片、穿刺，还是组织病理学的新鲜标本和石蜡切片都适用。这种方法比传统的染色体显带技术更加精确、灵敏度更高，比PCR方法的操作更为简便，敏感性和特异性均较高，结果更加客观可靠。再者，目前已知某些基因异常与蛋白表达异常并非同步显现。遗传学改变在淋巴组织病变的良、恶性鉴别、类型鉴别、复合型淋巴瘤的诊断及骨髓受侵情况的诊断均有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测Bcl-2/IgH基因重排的物质或/和仪器的新用途。本发明所提供的检测Bcl-2/IgH基因重排的物质或/和仪器的新用途具体为用于 检测Bcl-2基因和IgH基因重排的物质或/和仪器在制备筛查B细胞淋巴瘤疑似骨髓浸润或潜在骨髓浸润患者的产品中的应用。所述骨髓浸润为骨髓涂片细胞形态学检测阳性，即骨髓中出现淋巴瘤细胞或幼稚淋巴细胞占有核细胞总数百分比> 5%。在本发明中，所述Bcl-2基因为人Bcl-2基因，所述IgH基因为人IgH基因。所述Bcl-2基因和IgH基因的重排具体为由t (14 ；18)染色体易位所致所述Bcl-2基因和IgH基因的重排，更为具体的，为由t (14；18) (q32;q21)染色体易位所引起的所述Bcl-2基因和IgH基因的重排，使所述Bcl-2基因置于所述IgH基因启动子下游。在本发明的一个实施例中，所述用于检测Bcl-2基因和IgH基因重排物质具体为用于检测Bcl-2基因和IgH基因重排的探针，更为具体的，为用于检测Bcl-2基因和IgH基因重排的荧光原位杂交探针，如美国Vysis公司LSI系列Bcl-2/IgH双色双融合探针(产品目录号32-191018)。Bcl-2/IgH双色双融合探针，IgH基因被绿色荧光素标记，范围大约I. 5Mb，覆盖了 14q32上IgH的整个同源序列，并从3'端向IgH基因外扩展了 300kb的长度。Bcl-2基因被橙红色荧光素标记，范围大约750kb，覆盖了整个Bcl-2基因并向远近两端延伸了 250kb的长度。当然，根据实际需要也可以为其它类型的探针，或是其他可用于检测所述Bcl-2基因和IgH基因重排的物质。在本发明的一个实施例中，所述B细胞淋巴瘤具体为弥漫大B细胞淋巴瘤。本发明的再一个目的是提供一种筛查B细胞淋巴瘤疑似骨髓浸润或潜在骨髓浸润患者的广品。本发明所提供的筛查B细胞淋巴瘤疑似骨髓浸润或潜在骨髓浸润患者的产品具体为用于检测Bcl-2基因和IgH基因重排的物质或/和仪器。所述骨髓浸润为骨髓涂片细胞形态学检测阳性，即骨髓中出现淋巴瘤细胞或幼稚淋巴细胞占细胞总数百分比> 5%。在本发明中，所述Bcl-2基因为人Bcl-2基因，所述IgH基因为人IgH基因。所述Bcl-2基因和IgH基因的重排具体为由t (14 ；18)染色体易位所致所述Bcl-2基因和IgH基因的重排，更为具体的，为由t (14；18) (q32;q21)染色体易位所引起的所述Bcl-2基因和IgH基因的重排，使所述Bcl-2基因置于所述IgH基因启动子下游。在本发明中，所述筛查B细胞淋巴瘤疑似骨髓浸润或潜在骨髓浸润患者的产品可为用于筛查B细胞淋巴瘤疑似骨髓浸润患者或潜在骨髓浸润患者的试剂或试剂盒。在本发明的一个实施例中，所述用于检测Bcl-2基因和IgH基因重排物质具体为用于检测Bcl-2基因和IgH基因重排的探针，更为具体的，为用于检测Bcl-2基因和IgH基因重排的荧光原位杂交探针，如美国Vysis公司LSI系列Bcl-2/IgH双色双融合探针(产品目录号32-191018)。Bcl-2/IgH双色双融合探针，IgH基因被绿色荧光素标记，范围大约I. 5Mb，覆盖了 14q32上IgH的整个同源序列，并从3'端向IgH基因外扩展了 300kb的长度。Bcl-2基因被橙红色荧光素标记，范围大约750kb，覆盖了整个Bcl-2基因并向远近两端延伸了 250kb的长度。当然，根据实际需要也可以为其它类型的探针，或是其他可用于检测所述Bcl-2基因和IgH基因重排的物质。
在本发明的一个实施例中，所述B细胞淋巴瘤具体为弥漫大B细胞淋巴瘤。在实际应用中，为了提高检测结果的准确率，也可以将本发明的方法配合其他检测手段一同使用，如常规的骨髓涂片细胞形态学染色检测法。在本发明中，所述产品的筛查对象是临床上确诊患有弥漫大B细胞淋巴瘤患者，或是健康人。更为具体的，所述弥漫大B细胞淋巴瘤患者为原发部位(如淋巴结)发生所述Bcl-2基因和IgH基因重排的患者；所述健康人满足外周血中淋巴细胞占白细胞比例在0. 20-0. 40之间，且无异型淋巴细胞及幼稚淋巴细胞的条件。所述产品的筛查样本具体为采自所述对象的骨髓。本发明利用荧光原位杂交(FISH)等技术对弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者的原发部位(如淋巴结)石蜡组织切片和骨髓涂片进行检测，最终发现Bcl-2基因和IgH基因的重排可作为DLBCL骨髓浸润与否的分子标志以及治疗效果评价的标志，具体体现为与传统的单一骨髓涂片形态学染色法相比，形态学结合FISH法比单一形态学染色法提高了阳性率(33. 0%vsl0. 3%);本发明骨髓涂片FISH检测Bcl-2/IgH基因重排且骨髓涂片细胞形态学存在1-5%幼稚淋巴细胞的病例83. 3% (10/12)比单一形态学染色不同程度提早诊断骨髓浸润，比临床复发提早预警至少3个月以上。这为淋巴瘤骨髓浸润的临床分期、治疗及预后复查提供了有力的补充。
图I为Bcl-2/IgH双色双融合探针结构和原理。图2为DLBCL患者淋巴结和骨髓的Bcl-2/IgH基因分析和Bcl_2蛋白表达。a，冰冻淋巴结石蜡切片证实是DLBCL(HE X 100 )。b，细胞形态学检查骨髓涂片计数幼稚淋巴细胞是6. 0%，按常规诊断标准，判为骨髓浸润(X 1000)。C，免疫组化染色评价DLBCL的Bcl_2蛋白阳性表达(X 400)。d，免疫细胞化学染色Bcl-2蛋白细胞浆呈棕黄色阳性表达(X 400)。
e,淋巴结石蜡切片(2 y m)的Bcl-2/IgH荧光原位杂交结果，基因融合信号黄色箭头标记(X630)。f，骨髓受侵间期核片的Bcl-2/IgH荧光原位杂交结果，可见14号及18号染色体呈多体改变黄色箭头标记(X 630)。图3为DLBCL骨髓微小浸润的瑞氏-吉姆萨染色和双色荧光原位杂交在同一张骨髓涂片的结果对比(Bcl-2/IgH)。A，阳性对照(X630)。B，阴性对照(X630)。C，DLBCL骨髓形态学瑞氏-吉姆萨染色涂片，可疑细胞用黄色箭头标记(X 630 )。D，DLBCL骨髓细胞的荧光原位杂交结果，形态可疑细胞发生基因融合用黄色箭头标记(X 630)。图4为DLBCL淋巴结石蜡切片和骨髓经双色荧光原位杂交检测发生信号扩增(黄色箭头标记)。A，淋巴结石蜡切片(X630)。B，骨髓间期核片(X630)。
图5为不同厚度石蜡组织切片的荧光原位杂交结果(2um和4um) (X630)。A，
2u m0 B，4 u m0图6为DLBCL骨髓浸润病例的病程进展中的骨髓形态学与双色荧光原位杂交结果(Bcl-2/IgH)的比较。A，淋巴结石蜡切片证实为DLBCL (HEX100)。B，淋巴结组织切片(2um厚)FISH检测Bcl-2/IgH显示阳性(X630，箭头所示)。C，3个月后复诊行骨髓穿刺，骨髓形态学检查幼稚淋巴细胞I. 5%，依据形态学诊断标准判为骨髓未受侵(X 1000)。D，3个月后复诊的骨髓间期核片经FISH检测Bcl-2/IgH显示阴性。E，6个月后复诊，骨髓形态学检查幼淋细胞3. 5%，依据形态学诊断标准判为骨髓未受侵(X 1000)。F，6个月后复诊的骨髓间期核片经FISH检测Bcl-2/IgH显示阳性(X 630，箭头所示)。G，14个月后复诊，骨髓形态学诊断为NHL合并急性淋巴细胞白血病(X 1000)。H，14个月后复诊的骨髓间期核片经FISH检测Bcl-2/IgH显示阳性(X 630，箭头所示)。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。I、主要试剂和仪器Bcl-2/IgH探针美国Vysis公司，产品目录号为32-191018。Bcl-2/IgH探针是双色双融合探针，IgH基因被绿色荧光素标记，范围大约I. 5Mb，覆盖了 14q32上IgH的整个同源序列，并从3'端向IgH基因外扩展了 300kb的长度。Bcl-2基因被橙红色荧光素标记，范围大约750kb，覆盖了整个Bcl-2基因并向远近两端延伸了 250kb的长度。正常的一个间期核中可见各自独立的两个橙红色信号和两个绿色信号(202G)，发生染色体易位(Bcl-2/IgH基因重排)的细胞核内有两个黄色信号(101G2F)，见图1，有时可以观察到更多的融合信号或其他异常现象。Bcl-2抗体丹麦Dako公司，产品目录号为IR614。PV-9000试剂盒(二步法免疫组化检测试剂)北京中杉金桥生物技术有限公司，产品目录号为PV-9000，内含3%H202去离子水、Polymer Helper (试剂I)、polyperxidase-anti-mouse/rabbit IgG (试剂 2)。一抗稀释液、浓缩型DAB Kit,EDTA缓冲液、PBS缓冲液北京中杉金桥生物技术有限公司。2、溶液配方(I) 20XSSC :175. 3g NaCl，88. 2g 柠檬酸钠，用 10ml/L NaOH 调制 pH7. 0，加蒸馏水定容至1L。(2)1 Xpepsin (胃蛋白酶)10% (w/v)pepsinO. 5 U 1,0. OlN HCLlmlo(3) 10XPBS 40g NaCl，IgKCl，14. 35g Na2HPO4,用 HCl 调制 pH7. 4，加蒸馏水定容至 500ml。(4) 40%硫酸葡聚糖40g硫酸葡聚糖，100ml8XSSC溶液。(5) 1% 多聚甲醛lg 多聚甲醛，IOOmll XPBS0(6)70% 甲酰胺 /2XSSC (pH = 7. 0，100ml)70ml 100%(v/v)甲酰胺，10ml20XSSC溶液，20ml去离子水。、
(7)50% 甲酰胺 /2XSSC(pH = 7. 0，100ml)50ml 100%(v/v)甲酰胺，10ml20XSSC溶液，40ml去离子水。(8) 0. 075M KCl :1. 12gKCl，200ml 去离子水。(9)20iU杂交液3iil7%(v/v)吐温-20水，12 甲醛，5 硫酸葡聚糖(现用现配)。(10)2XSSC/0. 3%NP-40 100ml20 X SSC(pH5. 3)溶于 850ml 纯化水，加 3mlNP_40，至NP-40完全溶解。NaOH调至pH7. 0，加纯化水至1L。3、主要仪器
权利要求
1.用于检测Bcl-2基因和IgH基因重排的物质或/和仪器在制备筛查B细胞淋巴瘤疑似骨髓浸润或潜在骨髓浸润患者的产品中的应用。
2.根据权利要求I所述的应用，其特征在于所述物质为用于检测Bcl-2基因和IgH基因重排的探针。
3.根据权利要求I或2所述的应用，其特征在于所述B细胞淋巴瘤为弥漫大B细胞淋巴瘤。
4.筛查B细胞淋巴瘤疑似骨髓浸润或潜在骨髓浸润患者的产品，为用于检测Bcl-2基因和IgH基因重排的物质或/和仪器。
5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于所述物质为用于检测Bcl-2基因和IgH基因重排的探针。
6.根据权利要求4或5所述的产品，其特征在于所述B细胞淋巴瘤为弥漫大B细胞淋巴瘤。
全文摘要
本发明公开了Bcl-2/IgH基因重排在作为B细胞淋巴瘤骨髓浸润标志中的应用。本发明所提供的应用具体为用于检测Bcl-2基因和IgH基因重排的物质或/和仪器在制备筛查B细胞淋巴瘤疑似骨髓浸润或潜在骨髓浸润患者的产品中的应用；所述B细胞淋巴瘤为弥漫大B细胞淋巴瘤。实验证明，与传统的单一骨髓涂片形态学染色法相比，形态学结合FISH法比单一形态学染色法提高了阳性率(DLBCL:33.0%vs10.3%)；本发明骨髓涂片FISH检测Bcl-2/IgH发生基因重排且骨髓涂片细胞形态学存在1-5%幼稚淋巴细胞的病例83.3%(10/12)比单一形态学染色不同程度提早诊断骨髓浸润，比临床复发提早预警至少3个月以上。这为淋巴瘤骨髓浸润的临床分期、治疗及预后复查提供了有力的补充。
文档编号C12Q1/68GK102747156SQ20121024343
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月13日 优先权日2012年7月13日
发明者刘鹏, 张长弓, 徐欣, 曲媛, 王明荣, 罗扬, 车轶群, 郝佳洁, 齐军 申请人:中国医学科学院肿瘤医院