专利名称：紫杉醇基因组重排菌株hdfs4-26及紫杉醇高产菌株的选育方法
技术领域：
本发明涉及一种紫杉醇基因组重排菌株及紫杉醇工程菌株的选育方法。
技术背景恶性肿瘤严重地威胁着人类的健康，而且癌症是目前人类疾病中仅次于心 脑血管疾患的第二大死因。紫杉醇是从红豆杉属植物中提取出来的具有多种抗肿瘤疗效的二萜生物 碱类药物(分子式如图l所示)。由于红豆杉(又名紫杉)是珍稀树种，生长 速度缓慢，并且其生物学特性对生态环境要求较高，天然更新能力差，所以 种群数量极为有限，属濒危保护植物，资源十分有限，因此国内外学者都在 积极地研究开发紫杉醇的新药源。微生物发酵生产是降低成本、大量获取紫杉醇的最理想方法。1993年美 国蒙塔那州立大学化学家Andrea Stierle和植物病理学家Gary Strobel在蒙塔那 西北部国家冰川公园的短叶红豆杉中分离到一株内生真菌roxom^^ ""&e"""e，在Stierle等的工作一经发表，美国细胞克隆公司就出价100万美 元支持蒙塔那州立大学的这项研究。但是目前可用于紫杉醇微生物发酵的菌 株的紫杉醇产量仍然较低(菌株HD，.23系菌株NCEU-1的孢子经UV和NTG 复合诱变后获得的高产紫杉醇的突变株，其杉醇产量为356.80pg/L，菌株 UV4(M9和UL5Q-6系菌株NCEU-1的原生质体分别经紫外线和紫外线与氯化锂 复合诱变后获得的高产紫杉醇的突变株，紫杉醇产量分别为376.38|ig/L和 392.63pg/L)，难以满足市场的需求。发明内容本发明的目的是为了解决目前可用于紫杉醇微生物发酵的菌株的紫杉醇 产量仍然较低的问题，而提供的紫杉醇基因组重排菌株HDFS4-26及紫杉醇高 产菌株的选育方法。本发明紫杉醇基因组重排菌株HDFS4-26为树状多节孢(A^/"fepon、m W/w/orme)属于多节孢属(iVo^fe/ on'ww)，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏地址是武汉大学，保藏日期为2008年2月28日，保藏号为 CCTCC M 208026;紫杉醇基因组重排菌株HDFS4-26菌落培养初期为白色， 后期为深灰褐色，背面为黑色；紫杉醇基因组重排菌株HDFS4-26菌丝部分内 生，部分表生，有隔，多分支，菌丝为深褐色向顶性逐渐变浅，直径为2.24 5.86,，未见到菌核产生；分生孢子梗单生，多数呈树状分支，褐色向顶性 变淡，长37 162|im;产孢细胞柱状，单生或轮状排列，6.37-22.63^im x2.51 3.86pm，合轴式产孢；分生孢子单生，椭圆形或卵圆形，平滑或具小 疣，无隔膜，5.07 7.89^imx2.45 3.79^im，分生孢子在产孢细胞的产孢点位置 呈头状排列。本发明紫杉醇高产菌株按以下方法选育 一、原生质体制备；二、原生质 体的灭活；三、原生质体的融合；四、原生质体再生；五、基因组重排、筛 选，即得到紫杉醇高产菌株；其中用于原生质体制备的菌株为紫杉醇产生菌 HD,、 UV职9禾口UL胁本发明紫杉醇高产菌株的选育方法中步骤一原生质体制备取活化的紫杉 醇产生菌HD跡23、 UV职9和UL则放入PDA液体培养基中在28士0.5"C的条 件下静置培养3天，菌悬液在4000g条件下离心10min收集菌丝体，再用旋 涡混合器将菌丝体振荡均匀，然后用渗透压稳定剂洗涤2次，之后按每250mg 菌丝体加入lmL酶裂解液的比例加入酶裂解液，再置于30。C环境中温浴7h， 然后用3层无菌镜头纸过滤，滤液4000g在4000g条件下离心10min，原生质 沉淀再用渗透压稳定剂洗涤2次得到纯化的原生质体，之后将原生质体悬浮 于渗透压稳定剂中。步骤二原生质体的灭活将纯化后的HD1Q()-23原生质体悬液移入无菌试管中，50。C恒温水浴5min 进行热灭活；将纯化后的UV4(M9的原生质体悬液移入直径为6cm的无菌平皿中，置于 已预热稳定的30W紫外灯下，平皿与紫外灯垂直距离为30cm，照射100s进 行紫外线灭活；向纯化后的UL5o-6的原生质体悬液中加入终浓度为0.6%LiCl，然后立即置 于已预热稳定的30W紫外灯下，平皿与紫外灯垂直距离为30cm，照射70s进行紫外线+氯化锂复合灭活。步骤三原生质体的融合从灭活原生质体悬液中各取lmL悬液进行两两 混合，混合液在3000r/min的条件下离心10min，去除离心上清液后将原生质 体悬浮于0.2mL渗透压稳定剂中，再加入1.8mL、温度为30°C、质量浓度为 35%的PEG融合剂，在3(TC条件下水浴保温90s，再加入5mL、温度为4°C 的渗透压稳定剂终止融合，然后离心洗涤去除融合剂，经过融合的原生质体 再重新悬浮于渗透压稳定剂中；其中融合剂中添加有浓度为O.Olmol/L的 CaCl2。步骤四原生质体再生采用双层平板培养法将步骤三经过融合的原生质体悬液倍比稀释，稀释液各吸取0.5mL与4.5mL PDA再生半固体培养基混匀， 然后倾注于PDA再生固体培养基平板上，放入28。C的环境中培养3 5天。步骤五基因组重排收集步骤四培养的全部再生菌落为Fl代融合菌，然 后用Fl代杂合菌丝体制备原生质体，并分别采用步骤二中的热灭活、紫外线 灭活和紫外线+氯化锂复合灭活法对Fl原生质体进行灭活，然后按步骤三和 四进行融合和再生，即得到F2代融合菌；重复操作直到得到F4代融合菌， 再将F4代融合菌用浓度为135pg/mL的制霉菌素PDA培养基进行抗药性筛 选，然后将具有抗药性的融合菌进行摇瓶发酵培养，提取、纯化代谢产物， 进行分析，得到紫杉醇高产菌株。紫杉醇基因组重排菌株HDFS4-26就是采用本发明紫杉醇高产菌株的选育 方法选育出来的。采用与背景技术中相同的发酵方法和发酵条件进行发酵， 紫杉醇基因组重排菌株HDFS4-26的紫杉醇产量为516.37jxg/L，比菌株 NCEU-1紫杉醇产量提高了 64.41%，比亲本菌株紫杉醇产量提高了 31.52% 44.72%。紫杉醇基因组重排菌株HDFS4-26连续传代6次后其紫杉醇 产量仍然保持紫杉醇产量高于500pg/L，说明紫杉醇基因组重排菌株 HDFS4-26的高紫杉醇产量遗传性状稳定。'本发明紫杉醇高产菌株按以下方法选育简单，效果好，为提供高产紫杉醇 的工业生产菌株奠定了基础。本发明紫杉醇基因组重排菌株HDFS4-26为树状多节孢(iVo山fcpoW画 ^/vz/orwe)属于多节孢属(A^/w/z'^oWw附)，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉大学，保藏日期为2008年2月28日，保藏号为 CCTCCM 208026。
图1是紫杉醇分子式，图2是菌株HDFS4-26的分生孢子梗的显微镜观察 图，图3是菌株HDFS4-26的分生孢子的显微镜观察图，图4是菌株HDFS4-26 的分生孢子头排列的方式和分生孢子梗上的疣的显微镜观察图，图5为紫杉 醇标准品HPLC图谱，图6是菌株HDFS4-26发酵提取物HPLC图谱，图7 是紫杉醇基因组重排菌株HDFS4-26发酵提取纯化物质图谱。
具体实施方式
具体实施方式
一本实施方式紫杉醇基因组重排菌株HDFS4-26为树状多 节孢(^ ^//5^0〃'"附^/vz》m^)属于多节孢属(7Vo^^:s77W7'ww),保藏于中国典型 培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2008年2月28日，保藏号为CCTCC M 208026;紫杉醇基因组重排菌株HDFS4-26菌落培养初期为白色，后期为 深灰褐色，背面为黑色；紫杉醇基因组重排菌株HDFS4-26菌丝部分内生，部 分表生，有隔，多分支，菌丝为深褐色向顶性逐渐变浅，直径为2.24 5.86|im， 未见到菌核产生；分生孢子梗单生，多数呈树状分支，褐色向顶性变淡，长 37 162pm;产孢细胞柱状，单生或轮状排列，6.37 22.63pmx2.51 3.86^im， 合轴式产孢；分生孢子单生，椭圆形或卵圆形，平滑或具小疣，无隔膜， 5.07 7.89nmx2.45 3.79pm，分生孢子在产孢细胞的产孢点位置呈头状排列。本实施方式紫杉醇基因组重排菌株HDFS4-26的分生孢子梗如图2所示， 分生孢子如图3所示，分生孢子头排列的方式和分生孢子梗上的疣如图4所 示。本实施方式紫杉醇基因组重排菌株HDFS4-26采用以下方法活化将4°C 保存的紫杉醇基因组重排菌株HDFS4-26接种于PDA斜面培养基上，在28°C 的条件下活化2 3天(重复操作一次)，将斜面活化两次的菌株HDFS4-26 转接于装有SOmLPDA液体培养基的三角瓶中，放入28。C、 120r/min的摇床 中继续活化培养2天。将经过活化的紫杉醇基因组重排菌株HDFS4-26悬液按3。/。 (v/v)的比例 接入改良的S-7培养基中(改良的S-7培养基是在1993年Strobel原S-7培养基基础上将苯丙氨酸、酪氨酸、亚油酸增至终浓度1.5 5.0mg/L制成)，在 25°C、 150r/min的条件下发酵，发酵时间为12天。发酵后紫杉醇按一下步骤提取将培养不同时间的菌体发酵液抽滤，滤液 和固体均回收；用等体积的乙酸乙酯分两次对滤液进行萃取，分液漏斗静止 lh分层；上层有机相中溶有紫杉醇，下层水相弃掉；同时研磨抽滤后剩余的 菌体，并加入乙酸乙酯震荡萃取30min过滤，将滤液与发酵液萃取后的有机 相混合；用旋转蒸发仪除去溶剂乙酸乙酯，待剩余溶液为原液体积的1/10时， 将剩余溶液倒入平皿中，在50。C条件下干燥；再用少量的乙腈反复冲洗平皿 表面的微量的紫杉醇，定溶，4'C保存。
具体实施方式
二本实施方式与具体实施方式
一的不同点是紫杉醇基因 组重排菌株HDFS4-26在25 28t:、 PDA培养基上培养3天，菌落平展，菌 落直径为4.1 5.8cm。其它与实施方式一相同。
具体实施方式
三本实施方式紫杉醇高产菌株按以下方法选育 一、原生 质体制备；二、原生质体的灭活；三、原生质体的融合；四、原生质体再生； 五、基因组重排、筛选，即得到紫杉醇高产菌株；其中用于原生质体制备的菌株为紫杉醇产生菌HDK)o-23、 UV4(M9和UL50-6。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
三的不同点是步骤一原生 质体制备取活化的紫杉醇产生菌HD1Q。.23、 UV4(M9和UL5。.6放入PDA液体培养基中在28士0.5。C的条件下静置培养3天，菌悬液在4000g条件下离心 10min收集菌丝体，再用旋涡混合器将菌丝体振荡均匀，然后用渗透压稳定剂 洗涤2次，之后按每250mg菌丝体加入lmL酶裂解液的比例加入酶裂解液， 再置于3(TC环境中温浴7h，然后用3层无菌镜头纸过滤，滤液4000g在4000g 条件下离心10min，原生质沉淀再用渗透压稳定剂洗涤2次得到纯化的原生质 体，之后将原生质体悬浮于渗透压稳定剂中。其它步骤及参数与实施方式三 相同。本实施方式中的稳定剂为浓度为0.7mol/L的NaCl溶液。 本实施方式中的酶裂解液为纤维素酶、蜗牛酶和溶菌酶的复合酶系，酶裂解液的pH值为5.5 6.0，酶裂解液中纤维素酶的浓度为30mg/mL，蜗牛酶的浓度为20mg/mL，溶菌酶的浓度为10mg/mL。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
四的不同点是原生质体悬浮于渗透压稳定剂中，原生质体的浓度为1.0xl07cfU/mL。其它步骤及参数与实施方式四相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
三的不同点是步骤二原生 质体的灭活将纯化后的HD1()Q.23原生质体悬液移入无菌试管中，50。C恒温水浴5min 进行热灭活；将纯化后的UV4(M9的原生质体悬液移入直径为6cm的无菌平皿中，置于 已预热稳定的30W紫外灯下，平皿与紫外灯垂直距离为30cm，照射100s进 行紫外线灭活；向纯化后的ULso-6的原生质体悬液中加入终浓度为0.6%LiCl，然后立即置 于已预热稳定的30W紫外灯下，平皿与紫外灯垂直距离为30cm，照射70s 进行紫外线+氯化锂复合灭活。其它步骤及参数与实施方式三相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
三的不同点是步骤三原生 质体的融合从灭活原生质体悬液中各取lmL悬液进行两两混合，混合液在 3000r/min的条件下离心10min，去除离心上清液后将原生质体悬浮于0.2mL 渗透压稳定剂中，再加入1.8mL、温度为3(TC、质量浓度为35%的PEG融合 剂，在3(TC条件下水浴保温90s，再加入5mL、温度为4'C的渗透压稳定剂终 止融合，然后离心洗涤去除融合剂，经过融合的原生质体再重新悬浮于渗透 压稳定剂中；其中融合剂中添加有浓度为0.01mol/L的CaCl2。其它步骤及参 数与实施方式三相同。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
三的不同点是步骤四原生质体再生采用双层平板培养法将步骤三经过融合的原生质体悬液倍比稀释，稀释液各吸取0.5mL与4.5mL PDA再生半固体培养基混匀，然后倾注于PDA 再生固体培养基平板上，放入28。C的环境中培养3 5天。其它步骤及参数与 实施方式三相同。
具体实施方式
九本实施方式与具体实施方式
三的不同点是步骤五基因 组重排收集步骤四培养的全部再生菌落为Fl代融合菌，然后用F1代杂合菌丝体制备原生质体，并分别采用步骤二中的热灭活、紫外线灭活和紫外线+氯化锂复合灭活法对F1原生质体进行灭活，然后按步骤三和四进行融合和再 生，即得到F2代融合菌；重复操作直到得到F4代融合菌，再将F4代融合菌 用浓度为135pg/mL的制霉菌素PDA培养基进行抗药性筛选，然后将具有抗 药性的融合菌进行摇瓶发酵培养，提取、纯化代谢产物，进行分析，得到紫 杉醇高产菌株。其它步骤及参数与实施方式三相同。
具体实施方式
十本实施方式与具体实施方式
九的不同点是采用薄层层析(TLC)、高效液相色谱(HPLC)和质谱(MS)法进行分析。其它步骤及 参数与实施方式九相同。
具体实施方式
十一本实施方式采用具体实施方式
三方法选育得到紫杉醇 基因组重排菌株HDFS4-26。利用本实施方式选育得到的高产紫杉醇基因组重排菌株HDFS4-26进行发 酵培养和紫杉醇提取、纯化，然后分别采用高效液相色谱(HPLC)和质谱(MS) 法进行分析，分析结果分别如图6和图7所示(图5为紫杉醇标准品HPLC 的图谱，图5、图6和图7中箭头表示为紫杉醇峰)。
权利要求
1、紫杉醇基因组重排菌株HDFS4-26，其特征在于紫杉醇基因组重排菌株HDFS4-26为树状多节孢(Nodulisporium sylviforme)属于多节孢属(Nodulisporium)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2008年2月28日，保藏号为CCTCC M 208026；紫杉醇基因组重排菌株HDFS4-26菌落培养初期为白色，后期为深灰褐色，背面为黑色；紫杉醇基因组重排菌株HDFS4-26菌丝部分内生，部分表生，有隔，多分支，菌丝为深褐色向顶性逐渐变浅，直径为2.24～5.86μm，未见到菌核产生；分生孢子梗单生，多数呈树状分支，褐色向顶性变淡，长37～162μm；产孢细胞柱状，单生或轮状排列，6.37～22.63μm×2.51～3.86μm，合轴式产孢；分生孢子单生，椭圆形或卵圆形，平滑或具小疣，无隔膜，5.07～7.89μm×2.45～3.79μm，分生孢子在产孢细胞的产孢点位置呈头状排列。
2、 根据权利要求1所述的紫杉醇基因组重排菌株HDFS4-26，其特征在 于紫杉醇基因组重排菌株HDFS4-26在25 28°C 、 PDA培养基上培养3天， 菌落平展，菌落直径为4.1 5.8cm。
3、 紫杉醇高产菌株的选育方法，其特征在于紫杉醇高产菌株按以下方法 选育 一、原生质体制备；二、原生质体的灭活；三、原生质体的融合；四、 原生质体再生；五、基因组重排、筛选，即得到紫杉醇高产菌株；其中用于原生质体制备的菌株为紫杉醇产生菌HD1G().23、 UV4(M9和UL50.6。
4、 根据权利要求3所述的紫杉醇高产菌株的选育方法，其特征在于步骤一原生质体制备取活化的紫杉醇产生菌HD跡23、 UV4(M9和UL则放入PDA液体培养基中在28±0.5"的条件下静置培养3天，菌悬液在4000g条件下离 心10min收集菌丝体，再用旋涡混合器将菌丝体振荡均匀，然后用渗透压稳 定剂洗涤2次，之后按每250mg菌丝体加入lmL酶裂解液的比例加入酶裂解 液，再置于30。C环境中温浴7h，然后用3层无菌镜头纸过滤，滤液4000g在 4000g条件下离心10min，原生质沉淀再用渗透压稳定剂洗涤2次得到纯化的 原生质体，之后将原生质体悬浮于渗透压稳定剂中。
5、 根据权利要求4所述的紫杉醇高产菌株的选育方法，其特征在于原生 质体悬浮于渗透压稳定剂中，原生质体的浓度为1.0xl07cfU/mL。
6、 根据权利要求3所述的紫杉醇高产菌株的选育方法，其特征在于步骤二原生质体的灭活-将纯化后的1^1()()_23原生质体悬液移入无菌试管中，50。C恒温水浴5min 进行热灭活；将纯化后的UV4(M9的原生质体悬液移入直径为6cm的无菌平皿中，置于 已预热稳定的30W紫外灯下，平皿与紫外灯垂直距离为30cm，照射100s进 行紫外线灭活；向纯化后的UL5o—6的原生质体悬液中加入终浓度为0.6%LiCl，然后立即 置于已预热稳定的30W紫外灯下，平皿与紫外灯垂直距离为30cm，照射70s 进行紫外线+氯化锂复合灭活。
7、 根据权利要求3所述的紫杉醇高产菌株的选育方法，其特征在于步骤 三原生质体的融合从灭活原生质体悬液中各取lmL悬液进行两两混合，混 合液在3000r/min的条件下离心10min，去除离心上清液后将原生质体悬浮于 0.2mL渗透压稳定剂中，再加入1.8mL、温度为30°C、质量浓度为35%的PEG 融合剂，在3(TC条件下水浴保温90s，再加入5mL、温度为4"C的渗透压稳定 剂终止融合，然后离心洗涤去除融合剂，经过融合的原生质体再重新悬浮于 渗透压稳定剂中；其中融合剂中添加有浓度为0.01mol/L的CaCl2。
8、 根据权利要求3所述的紫杉醇高产菌株的选育方法，其特征在于步骤 四原生质体再生采用双层平板培养法将步骤三经过融合的原生质体悬液倍 比稀释，稀释液各吸取0.5mL与4.5mLPDA再生半固体培养基混匀，然后倾 注于PDA再生固体培养基平板上，放入28°C的环境中培养3 5天。
9、 根据权利要求3所述的紫杉醇高产菌株的选育方法，其特征在于步骤 五基因组重排收集步骤四培养的全部再生菌落为Fl代融合菌，然后用Fl 代杂合菌丝体制备原生质体，并分别采用步骤二中的热灭活、紫外线灭活和 紫外线+氯化锂复合灭活法对Fl原生质体进行灭活，然后按步骤三和四进行 融合和再生，即得到F2代融合菌；重复操作直到得到F4代融合菌，再将F4 代融合菌用浓度为135jig/mL的制霉菌素PDA培养基进行抗药性筛选，然后 将具有抗药性的融合菌进行摇瓶发酵培养，提取、纯化代谢产物，进行分析， 得到紫杉醇高产菌株。
10、 根据权利要求9所述的紫杉醇高产菌株的选育方法，其特征在于采 用薄层层析、高效液相色谱和质谱法进行分析。
全文摘要
紫杉醇基因组重排菌株HDFS4-26及紫杉醇高产菌株的选育方法，它涉及一种紫杉醇基因组重排菌株及紫杉醇工程菌株的选育方法。它解决了目前可用于紫杉醇微生物发酵的菌株的紫杉醇产量仍然较低的问题。紫杉醇基因组重排菌株HDFS4-26为树状多节孢属于多节孢属，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2008年2月28日，保藏号为CCTCC M 208026。紫杉醇高产菌株按以下方法选育一、原生质体制备；二、原生质体的灭活；三、原生质体的融合；四、原生质体再生；五、基因组重排、筛选，即得到紫杉醇高产菌株。菌株HDFS4-26的紫杉醇产量为516.37μg/L。本发明紫杉醇高产菌株按以下方法选育简单，效果好，为提供高产紫杉醇的工业生产菌株奠定了基础。
文档编号C12R1/645GK101280281SQ200810064048
公开日2008年10月8日 申请日期2008年2月29日 优先权日2008年2月29日
发明者军 刘, 周东坡, 平文祥, 张丽娜, 燕 林, 凯 赵 申请人:黑龙江大学