专利名称：烟草漂浮育苗根腐致腐菌的快速检测方法
技术领域：
本发明属于一种植物保护技术，特别指一种烟草漂浮育苗根腐致腐菌的快速检测方法。
背景技术：
在烟草漂浮育苗过程中，一段式育苗放盘培养后约50天或两段式育苗抛苗培养约10天，时常发生根系腐变，影响烟苗移栽成活率和其它病害的协同侵染。导致弃苗率高，造成育苗业主和植烟农户的经济损失。然而，烟草漂浮育苗中的根腐现象，现有技术尚未明确致腐的确切原因或致腐生物，未见有关检测致腐原因或生物的方法。所以目前尚不能对根腐机理进行系统的阐述，也没有相应的防控技术可供采用，造成烟草育苗过程中极大的损失。因此，研究开发对根腐致腐菌的检测和防治方法，进而探索根腐发生机理具有十分重要的现实意义。·
发明内容
本发明的目的是提出一种烟草漂浮育苗根腐致腐菌的快速检测方法，该方法能够在漂浮育苗中烟苗出现根腐前或出现初期快速检测出致腐菌，针对育苗池液和根系组织中致腐菌的存在状况，采取预防和防控措施，减少或者避免根腐苗，提高成苗率，确保烟农育苗和烟草种植的正常生产，以解决现有技术的不足。本发明的上述目的通过如下手段实现
一种烟草漂浮育苗根腐致腐菌的快速检测方法，其特征在于有如下操作步骤
(一)建立比对标准
(1)制备LB培养基备用；
(2)分离和培养根腐组织中的菌体；
(3)利用革兰氏染色法和显微镜观察法确定培养皿中致腐菌生物学特性，建成比对标
准；
(二)分离并培养出漂池液中细菌；
(三)革兰氏染色法观察、比对培养皿所得漂池液菌落，根据上述对比标准鉴别，得漂池液中根腐致腐菌的定性定量检测结果。上述LB 培养基可以这样制备Trypton LP0042 (OXOID)-IOg ；Yeast ExtractLP0021 (OXOID) -5g ； NaCl (AR) -5g ;加蒸馏水至1000ml ;溶解后调pH至7. 2，固体培养基中加入2%的琼脂粉，分装至500ml的三角瓶中，121 °C灭菌20min，备用。上述根腐组织中菌体的分离和培养可以这样进行(a)用消过毒的剪刀和镊子取根腐组织，在灭菌水中漂洗3次，置于0. 1%的HgCl2溶液中2分钟，取出消过毒的根腐组织，在灭菌水中漂洗3次；(b)将消过毒的根腐组织共选5株根系，剪成小段，每植株的根系2段，分别置于已制备好的LB平皿中，25°C培养箱中培养48小时。根系小段长为0. 5cm。漂池液中细菌的分离和培养可以这样进行(I)取直径约9cm的培养皿60套，用报纸以10套/包进行包装，121 °C灭菌20min，备用；
(2)在超净台上将熔化的LB培养基倒入灭菌的培养皿中，约15ml/皿，室温自然冷凝(54套)，按上述试验处理在每一皿上标号，备用；
(3)取30支试管，每支加入9ml蒸馏水，121°C灭菌20min，自然冷却至室温后按上述试验处理编号，备用；
(4)用装有灭菌水试管将漂池液样品依次稀释成10倍、100倍和1000倍，混匀，分别从稀释液中取0. 2ml，按对应编号加入已制备的LB平皿中，用玻璃涂布棒涂匀；
(5)置上述平皿于25°C培养箱中培养48小时；
(6)取出培养皿，统计每一平皿上的菌落数(总数、不同颜色类群数量)，并换算成单位体积中菌体数量。所述革兰氏染色法的过程是(I)用滴管取无菌水，滴一滴水于载玻片中央，用接·种环从平皿中培养物挑取菌落，涂于水滴中，将载玻片底部略靠近酒精灯火焰，烘干载玻片上的涂液；
(2)用革兰氏染色液对涂抹菌体进行染色；
(3)用滴管中蒸馏水将载玻片上的染色液洗去；
(4)置载玻片于光学显微镜的油镜下观察染色反应的结果，包括观察菌体大小和形态，并以图片和相关描述记录。根据上述方法确定的烟草根腐致腐菌一组比对标准的生物学特性是
菌株编号I革兰氏染色反应I菌体形态
1_￡_长杆和短杆
2G_—杆状 —
3_￡_长杆状
4_G；_短杆状
5_￡_短杆状
6_G；_短杆状
I_￡_长杆和短杆
8G+—长杆状 —
9_￡_杆状
10_G_杆状_
IIG_—杆状 —
12_￡_长杆状
j_3_G_长杆状_
针对根腐组织中致腐菌的检测仅实施步骤(一)(D- (2)，以及革兰氏染色法观察培养皿中致腐菌生物学特性并与已建立的比对标准进行比对即得检测结果。本发明可以简单概括为在根腐发生前期或初期，利用稀释平板法快速检测单位体积漂池液中细菌数量，并根据培养的菌落特征，预测根腐发生的可能性和致腐菌群；进一步将培养的菌落或从根腐组织上分离的菌落，进行革兰氏染色，在光学显微镜下观察染色反应和菌体大小、形态等生物学特征，根据事先建立的致腐菌株特征比对标准，确定从漂池液或根腐组织中分离的菌落是否为烟苗根系腐变的致腐菌。本发明方法简捷，思路明晰，操作容易，材料消耗小，检测成本低，速度快。从取样到出结果仅60小时，准确率高于90%。很适合于烟站、烟农推广使用。所建立的比对标准中，本发明虽然尚未确定出致腐菌的生物学分类属种，但并不影响其在漂浮育苗过程中对烟苗根腐现象的防控和治理上的应用，能够有效降低根腐的发生率，确保治愈率，减小烟农损失，对烟草种植有重要的现实意义。
具体实施例方式下面用实例来进一步说明本发明。样本采集在申请人试验基地进行。漂池液样本一段式育苗在漂浮育苗播种、放盘培养后45天左右，或两段式育苗在抛苗培养约7天后，从可能发生根腐的育苗池中各采集漂池液100毫升样本。根腐组织样本在发生根腐初期(育苗池中仅有极少数烟苗的根系出现根腐的症状)，从漂盘上取出已显现根腐症状的烟苗植株样本。建立比对标准· 对从根腐组织上采集到的样本(细菌)进行纯化培养——采集到样本后，尽快(宜在24小时内，且需冷藏样本)利用上述方法在LB固体培养基上培养48小时。对培养出来的细菌进行革兰氏染色和显微观察-挑取所培养的菌落，在载玻片
上涂片、染色，置于显微镜下观察，记录所获得13株致腐菌的生物学物性，这些特性如下表，该表即为此后对漂池液和发病根腐烟苗进行检测的比对标准
菅~株编号I革兰氏染色反应I菌体形态 I根腐发生率％
1_G_长杆和短杆 56. I_
2' G-100-
3 长杆状 69.2
4~—短杆状一54.5
5 短杆状 70.5
6~G~MS 状万.9-82.5 -
7和短杆 $.2-84.1 —
8G+长杆状 79.5
9V70.2-
10V58.9-
11V82.4-
12~G~状0'
13|g_I长杆状卜8.6-实际检测
(I)对育苗漂池液中致腐菌的快速检测A.在育苗过程中的根腐发生初期或发生前5天从漂池液中采集样本100毫升。利用稀释平板法，按原液、稀释10倍和100倍液，分别取0. 2毫升涂于平皿中LB固体培养基上，置于25°C培养箱中培养48小时，观察长出的菌落、计数。首先根据生长的菌落数量、菌落形态和颜色，初步推断漂池液中细菌数量，结合已经获得的致腐菌的生物学特性，即比对标准，初步推断漂池液中致腐菌的类群和数量。B.利用革兰氏染色技术，对所培养的菌群在载玻片上涂片进行染色，置于显微镜下观测细菌的染色反应结果和菌体的形态与大小，结合已经确定出的13株细菌的特征，确定致腐囷株。此项工作可在12小时内完成。(2)对根腐发生初期的根系组织进行快速检测
A.从漂浮育苗中根腐发生初期的烟苗根系组织采集样本，选消毒的根腐组织剪取长约0. 5cm的小段,每植株的根系2段,分别置于LB平皿中，25°C培养箱中培养48小时,观察长出的菌落形态和颜色，结合已经获得的致腐菌的生物学特性，初步推断根腐组织中致腐菌的类群。B.利用革兰氏染色技术，对所培养的菌群在载玻片上涂片进行染色，置于显微镜下观测细菌的染色反应结果和菌体的形态与大小，结合已经确定出的13株细菌的特征，确定致腐囷株。此项工作可在12小时内完成。本检测方法可在60小时内获得结果，经在申请单位系统内实际应用，准确率高于90%。·
权利要求
1.一种烟草漂浮育苗根腐致腐菌的快速检测方法，其特征在于有如下操作步骤 (一)建立比对标准 (1)制备LB培养基备用； (2)分离和培养根腐组织中的菌体； (3)利用革兰氏染色法和显微镜观察法确定培养出来的致腐菌生物学特性，建成比对标准； (二)分离并培养出漂池液中细菌； (三)革兰氏染色法观察、比对培养皿所得漂池液菌落，根据上述对比标准鉴别，得漂池液中根腐致腐菌的定性定量检测结果。
2.根据权利要求I所述烟草漂浮育苗根腐致腐菌的快速检测方法，其特征在于LB培养基这样制备Trypton LP0042 (OXOID)-IOg ；Yeast Extract LP0021 (OXOID) -5g ； NaCl(AR)-5g ;加蒸馏水至1000ml ;溶解后调pH至7. 2，固体培养基中加入2%的琼脂粉，分装至500ml的三角瓶中，121°C灭菌20min，备用。
3.根据权利要求I所述烟草漂浮育苗根腐致腐菌的快速检测方法，其特征在于上述根腐组织中菌体的分离和培养这样进行(a)用消过毒的剪刀和镊子取根腐组织，在灭菌水中漂洗3次，置于O. 1%的HgCl2溶液中2分钟，取出消过毒的根腐组织，在灭菌水中漂洗3次；(b)将消过毒的根腐组织共选5株根系，剪成小段，每植株的根系2段，分别置于已制备好的LB平皿中，25 °C培养箱中培养48小时。
4.根据权利要求3所述烟草漂浮育苗根腐致腐菌的快速检测方法，其特征在于根系小段长为O. 5cm。
5.根据权利要求I所述烟草漂浮育苗根腐致腐菌的快速检测方法，其特征在于漂池液中细菌的分离和培养这样进行(I)取直径约9cm的培养皿60套，用报纸以10套/包进行包装，121°C灭菌20min，备用； (2)在超净台上将熔化的LB培养基倒入灭菌的培养皿中，约15ml/皿，室温自然冷凝(54套)，按上述试验处理在每一皿上标号，备用； (3)取30支试管，每支加入9ml蒸馏水，121°C灭菌20min，自然冷却至室温后按上述试验处理编号，备用； (4)用装有灭菌水试管将漂池液样品依次稀释成10倍、100倍和1000倍，混匀，分别从稀释液中取O. 2ml，按对应编号加入已制备的LB平皿中，用玻璃涂布棒涂匀； (5)置上述平皿于25°C培养箱中培养48小时； (6)取出培养皿，统计每一平皿上的菌落数(总数、不同颜色类群数量)，并换算成单位体积中菌体数量。
6.根据权利要求I所述烟草漂浮育苗根腐致腐菌的快速检测方法，其特征在于革兰氏染色法的过程是 (1)用滴管取无菌水，滴一滴水于载玻片中央，用接种环从平皿中培养物挑取菌落，涂于水滴中，将载玻片底部略靠近酒精灯火焰，烘干载玻片上的涂液； (2)用革兰氏染色液对涂抹菌体进行染色； (3)用滴管中蒸馏水将载玻片上的染色液洗去； (4)置载玻片于光学显微镜的油镜下观察染色反应的结果，包括观察菌体大小和形态，并以图片和相关描述记录。
7.根据权利要求I所述烟草漂浮育苗根腐致腐菌的快速检测方法，其特征在于根据上述方法确定的烟草根腐致腐菌一组比对标准的生物学特性是
8.根据权利要求I所述烟草漂浮育苗根腐致腐菌的快速检测方法，其特征在于针对根腐组织中致腐菌的检测仅实施步骤(一)(O- (2)，以及革兰氏染色法观察培养皿中致腐菌生物学特性并与已建立的比对标准进行比对即得检测结果。
全文摘要
本发明是涉及一种烟草漂浮育苗根腐致腐菌的快速检测方法，其做法是在根腐发生前期或初期，利用稀释平板法快速检测单位体积漂池液中细菌数量，并根据培养的菌落特征，预测根腐发生的可能性和致腐菌群；进一步将培养的菌落或从根腐组织上分离的菌落，进行革兰氏染色，在光学显微镜下观察染色反应和菌体大小、形态等生物学特征，根据事先建立的致腐菌株特征比对标准，确定从漂池液或根腐组织中分离的菌落是否为烟苗根系腐变的致腐菌。本发明方法简捷，思路明晰，操作容易，材料消耗小，检测成本低，速度快，从取样到出结果仅60小时，准确率高于90%。很适合于烟站、烟农推广使用。本发明与防治措施相结合能够大幅度降低根腐的发生率，确保治愈率，减小烟农损失，对烟草种植有重要的现实意义。
文档编号C12Q1/04GK102787159SQ20121026785
公开日2012年11月21日 申请日期2012年7月31日 优先权日2012年7月31日
发明者张绍松, 李宏光, 李永军, 钟晓田 申请人:云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所, 云南省烟草公司红河州公司