高产l-赖氨酸的生产菌株及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种天冬氨酸激酶：(a)其氨基酸序列如SEQ?ID?NO:2所示；或(b)包含(a)所限定的序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有(a)所限定多肽功能的由(a)衍生的多肽。本发明的天冬氨酸激酶能有效生产L-赖氨酸，并且抗L-赖氨酸负反馈抑制的能力高。本发明还提供包含编码所述天冬氨酸激酶的基因的重组宿主以及利用所述宿主或天冬氨酸激酶产生L-赖氨酸的方法。本发明的天冬氨酸激酶或包含本发明天冬氨酸激酶的宿主细胞还用于产生苏氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸或缬氨酸。本发明还提供利用所述天冬氨酸激酶或宿主细胞产生L-天冬氨酰-4-基磷酸的方法。
【专利说明】高产L-赖氨酸的生产菌株及其应用
【技术领域】[0001]本发明属于生物【技术领域】。具体地说，本发明涉及肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)来源的天冬氨酸激酶(ASK)。
【背景技术】
[0002]L-赖氨酸是人体必需氨基酸之一，能促进人体发育、增强免疫功能。由于谷物食品中的L-赖氨酸含量甚低，在加工过程中易被破坏，而人体及动物不能自己合成L-赖氨酸，只能从食物中获取，故称为限制性氨基酸。L-赖氨酸主要用于饲料添加剂以补充限制性氨基酸提高饲料的吸收利用率，食品添加剂，医药，化学制剂等。以年产量比较，L-赖氨酸目前是仅次于谷氨酸的世界第二大氨基酸品种，并且以5%-10%的年增长率增加。
[0003]国际上生产L-赖氨酸主要通过微生物发酵法。许多种类野生型或者诱变微生物都能够生产L-赖氨酸。基因工程大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌是主要的生产L-赖氨酸的微生物。
[0004]L-赖氨酸的合成途径在许多微生物中都是从天冬氨酸起始的，包括两步和甲硫氨酸和苏氨酸共用的步骤，经过九步的酶催化过程，最终产生L-赖氨酸(生物合成途径如下所示)。其中，天冬氨酸激酶(Aspartate Kinase, ASK)是L_赖氨酸合成途径中天冬氨酸起始的第一个酶，它的活力决定着代谢流流向L-赖氨酸合成途径的比例。天冬氨酸激酶的活力在微生物体内受复杂的调控。在许多L-赖氨酸的生产菌中，天冬氨酸激酶的活力受到终产物L-赖氨酸的负反馈抑制。
[0005]
【权利要求】
1.一种重组的宿主细胞，其特征在于，所述重组的宿主细胞含有编码选自下组的天冬氨酸激酶的外源性基因: (a)氨基酸序列如SEQID NO:2所示的天冬氨酸激酶；或 (b)包含(a)所限定的序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有(a)所限定的天冬氨酸激酶功能的由(a)衍生的天冬氨酸激酶。
2.如权利要求1所述的重组的宿主细胞，其特征在于，所述重组的宿主细胞含有的外源性基因如SEQ ID NO:1所示；或者 所述天冬氨酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，但其中305位的A取代为N、V或I，或343位的H取代为I或F。
3.如权利要求1或2所述的重组的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞来自埃希氏菌属(Escherichia)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus)、沙雷氏菌属(Serratia)或弧菌属(Vibrio)。
4.如权利要求3所述的重组的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是大肠杆菌(E.Coli)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
5.一种重组的宿主细胞， 其特征在于，所述重组的宿主细胞含有编码抗赖氨酸负反馈抑制的天冬氨酸激酶的外源性基因，其中所述的天冬氨酸激酶来源于链球菌，优选地，所述链球菌是肺炎链球菌。
6.以上权利要求中任一项所述的重组的宿主细胞在生产L-赖氨酸中的应用。
7.—种生产L-赖氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: (a)培养权利要求1-5中任一项所述的宿主细胞,使之产生L-赖氨酸；和 (b)从培养体系中分离L-赖氨酸。
8.一种多肽，其特征在于，所述多肽: (a)包含SEQID N0:2所示序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且 (b)基本具有包含SEQID N0:2所示序列的多肽的功能。
9.如权利要求8所述的多肽，其特征在于，所述多肽包含SEQID N0:2所示序列，但其中305位的A取代为N、V或I，或343位的H取代为I或F。
10.权利要求8或9所述的多肽或氨基酸序列如SEQID NO: 2所示的多肽在生产L-赖氨酸中的应用。
11.如权利要求6或10所述的应用，其特征在于，所述的重组的宿主细胞或所述的多肽还用于产生苏氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸或缬氨酸。
12.—种生产L-赖氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: (a)利用权利要求8或9所述的多肽或氨基酸序列如SEQID N0:2所示的多肽作为天冬氨酸激酶(EC 2.7.2.4)，催化从L-天冬氨酸生成L-赖氨酸过程中以下反应，进而获得L-赖氨酸:
13.—种产生L-天冬氨酰-4-基磷酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤:(a)培养权利要求1-5中任一项所述的宿主细胞，从而产生L-天冬氨酰-4-基磷酸；和 (b)从培养体系中分离L-天冬氨酰-4-基磷酸。 或者所述方法包括以下步骤: (al)利用权利要求8或9所述的多肽或氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示的多肽作为天冬氨酸激酶(EC 2.7.2.4)，催化从L-天冬氨酸生成L-天冬氨酰_4_基磷酸；和(b I)从反应体系中分离L-天冬氨酰-4-基磷酸。
14.编码权利要求8或9所述多肽的基因。
15.包含权利要 求14所述基因的载体。
【文档编号】C12N15/54GK103667165SQ201210337506
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年9月12日 优先权日:2012年9月12日
【发明者】黄鹤, 杨晟 申请人:中国科学院上海生命科学研究院, 上海工业生物技术研发中心