专利名称：一种鉴别肺癌亚型的microRNA标志物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及肺癌亚型的诊断，具体地说，涉及鉴别肺癌亚型的microRNA标志物及该microRNA的应用。
背景技术：
肺癌已成为目前世界上病死率第一位的恶性肿瘤，2011年世界卫生组织最新资料显示，2008年全球约有160万肺癌新患者，约有140万肺癌患者死亡。在肺癌患者中，小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCL C)约占 15%,非小细胞肺癌(non-small cell lungcancer, NSCLC)约占 80%, NSCLC 主要包括腺癌(adenocarcinoma lung cancer, AC)及鱗癌(squamous cell lung cancer, SQ)两大类型。肺癌是预后最差的恶性肿瘤之一，即便早期(pla-plb)肺癌经手术及放化疗治疗后的5年复发率仍然高达40%，而大部分患者(约75%)就诊时已处于中晚期，已失去了外科手术及多学科根治的最佳时机，极易复发及远处转移，I-IV期患者总体5年生存率仅约10%。造成这种状况的主要原因是缺乏有效的肺癌早期诊断及早期治疗的方法。肺癌治疗已进入个体化时代，不同亚型、不同分期的肺癌治疗方案不同。SCLC早期即发生血行转移，首选治疗方案为全身化疗联合放疗，而非手术切除。根治性手术是SQ及AC的首选治疗方法，辅助以放化疗。分子靶向治疗被认为是特异性最高的肺癌个体化治疗手段，如表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)络氨酸激酶抑制剂仅对EGFR突变的肺腺癌患者有效，SQ对培美曲赛治疗效果不如AC，用贝伐单抗治疗可引起致命的大出血。因此，准确的肺癌病理分型对肺癌患者靶向治疗方案的选择至关重要，研究肺癌肿瘤标志物，并准确的对肺癌进行分子分型，进而正确指导靶向治疗显得尤为迫切，并将会带来巨大的社会效益及经济效益。microRNA (miRNA)是一类小的内源性非编码RNA分子，大小为20-25个核苷酸(nt),这些小的microRNA通常祀向一个或者多个mRNA,通过翻译水平的抑制或断裂革巴标mRNAs而调节基因的表达。它们大约在10年前被发现，已被认为在细胞发育、分化、增殖和凋亡中发挥重要作用(Bartel, D. P. (2004) Cell 116，281-297，Ambros, V. (2004)Nature 431, 350-355 ；He, L. et al. (2004) Nat Rev Genet 5, 522-531)。 microRNA比mRNA在作为肿瘤生物标志物方面具有更大的优势，因为它们在体外非常稳定(Lu，J. etal., (2005) Nature 435, 834-838; Lim, L. P. et al., (2005) Nature 433, 769-773)。microRNA 是从初级转录物(pri-microRNA)产生的，pri-microRNA 被 RNase IIIDrosha加工为含莖-环结构的前体microRNA(pre-microRNA)。接着，在Dicer(—种RNaseIII)的作用下，发夹状的pre-microRNA在细胞质中进一步被切割产生成熟的microRNA,这些成熟的microRNA与其他蛋白质一起组成microRNA-蛋白质复合体(miRNP)。microRNA引导miRNP到达它们的靶mRNA，在此它们发挥各自的功能(参见综述例如Bartel，D. P.(2004) Cell 23, 281-292 ；He, L. and Hannon, G. J. (2004) Nat. Rev. Genet. 5,522-531)。
根据microRNA与其祀mRNA之间的互补性程度,microRNA可以指导不同的调节过程。那些与microRNA高度互补的靶mRNA通过与RNA干扰(RNAi)相同的机制被特异降解。因此，在这种情况下，microRNA是担当小干扰RNA (siRNA)的角色；与microRNA互补性较低的靶mRNA被引导进入细胞降解途径，或者在蛋白质翻译上平上被阻遏而mRNA水平不受影响。高通量microRNA定量技术如microRNA微阵列，是以实时定量PCR为基础的miCToRNA检测，为研究癌症基因组中miCToRNA的表达谱提供了有力的工具。可获得的现有数据表明miciORNA表达失调可能与某种癌症的发生和/或发展相关。例如，研究表明hsa-miR-15及hsa-miR-16-l均定位在慢性淋巴性白血病(CLL)中缺失的遗传基因座上，在大约70%的CLL患者中,这两种microRNA基因缺失或下调。另外,在结肠癌中has-miR-143 及has-miR-145表达下调；而microRNA let-7的表达在肺癌中经常降低(Michael, Μ. Ζ.et al. (2003) Mol Cancer Res I, 882-891; Mayr, C. et al. (2007) Science 315,1576-1579)。事实上，常见癌症经常存在相关microRNA表达改变，而且microRNA通常定位于与癌症相关的基因组区域，因此可以推测miCToRNA可能发挥着抑癌基因和癌基因的双重作用(Esquela-Kerscher, A. and Slack, F. J (2006) Nat Rev Cancer 6, 259-269 ；Calin, G. A. and Croce, C. M. (2007) JClin Invest 117，2059-2066 ；Blenkiron, C.and Miska, E. A. (2007) Hum Mol Genet 16, R106-R113)。已证实的 microRNA 在人类癌症中的异常表达更突出了它们作为诊断和预后生物标志物的潜在应用价值。近年来对肺癌组织的研究表明，在肺癌中约有70个microRNA表达异常。但上述前人的结果都是从未经纯化肺癌组织的混合细胞中获得的，其杂交信号可以来自肺癌细胞，也可以来自肺癌组织中的炎症细胞、间质细胞甚至正常肺组织细胞，而这些非目的细胞的比例在不同肺癌组织中可以存在很大的差异，从而造成了结果的不可靠。王漱阳和朱虹光等人发现，整块肿瘤组织的microRNA表达谱与被显微切割下来的纯净癌细胞有所不同。因此，只有从纯净的靶细胞中检测得到的microRNA表达，才能正确反映特异性细胞在体内的表达情况，并可能成为可靠的肿瘤标志物和治疗靶点。而目前从肺癌组织中分离纯净的靶细胞获得的能够准确诊断肺癌亚型的microRNA报道较少。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种鉴别肺癌亚型的miCToRNA。本发明的再一的目的是，提供一种上述microRNA的用途。本发明的另一的目的是，提供一种基于上述microRNA的鉴别肺癌亚型的试剂盒。本发明的第四个目的是，提供一种鉴别肺癌亚型的microRNA集。本发明的第五个目的是，提供一种上述HiiCT0RNA集的用途。本发明的第六个目的是，提供一种基于上述microRNA集的鉴别肺癌亚型的试剂盒。本发明的第七个目的是，提供一种鉴别肺癌亚型的microRNA芯片。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是
一种鉴别肺癌亚型的microRNA,所述的microRNA选自
a)序列如SEQ ID No. η所示的microRNA，其中η为2，3，4或7 ;或b)与SEQ ID No. η所不序列互补的microRNA。为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是
如上所述的鉴别肺癌亚型的microRNA在制备鉴别肺癌亚型的试剂中的用途。为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是
一种鉴别肺癌亚型的试剂盒，所述的试剂盒中含有如上所述的鉴别肺癌亚型的microRNA。为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是
一种鉴别肺癌亚型的microRNA集，所述的集至少包含下列中的一种
a)包含序列如SEQ ID No. 3所示的microRNA和序列如SEQ ID No. 4所示的microRNA 的集；
b)包含序列如SEQ ID No. 2所不的microRNA和序列如SEQ ID No. 7所不的microRNA的集。为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是
如上所述的鉴别肺癌亚型的microRNA集在制备鉴别肺癌亚型的试剂中的用途。为实现上述第六个目的，本发明采取的技术方案是
一种鉴别肺癌亚型的试剂盒，所述的试剂盒中含有如上所述的鉴别肺癌亚型的microRNA 集。为实现上述第七个目的，本发明采取的技术方案是
一种鉴别肺癌亚型的microRNA芯片，所述的microRNA芯片包括固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性的对应于SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4和/或SEQ ID No. 7所示的部分或全部序列。本发明优点在于
1、提供了可用于鉴别诊断肺癌亚型的四种microRNA,该四种microRNA可构成两个组合SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4，可分别用于鉴别诊断小细胞肺癌与非小细胞肺癌、腺癌与鳞癌；
2、四种microRNA是从采用激光捕获显微分离系统从鳞癌、腺癌及小细胞癌组织中分离纯净的癌细胞，运用Agilent芯片技术进行全基因组microRNA差异表达分析筛选获得的，能更加准确地反应不同亚型肺癌细胞中的microRNA的表达谱，更加准确地显示肺癌的microRNA分子表型。且该四种microRNA经独立验证,证实其诊断小细胞肺癌与非小细胞肺癌、腺癌与鳞癌结果准确可靠，有利于快速、准确、低成本的鉴别诊断肺癌亚型以对患者进行准确的靶向治疗，可制备成诊断芯片或试剂盒，具有广阔的应用前景。
附图I是石蜡包埋手术切除肺组织的ROC曲线分析。A :手术训练样本中microRNA组合A鉴别SCLC与NSCLC的AUC估算；B :手术训练样本中microRNA组合B鉴别SQ与AC的AUC估算。附图2是石蜡包埋手术切除肺组织的ROC曲线分析。A :手术确认样本中microRNA组合A鉴别SCLC与NSCLC的AUC估算；B :手术确认样本中microRNA组合B鉴别SQ与AC的AUC估算。
附图3是支气管活检样本的ROC曲线分析。A :支气管活检样本中microRNA组合A鉴别SCLC与NSCLC的AUC估算；B :支气管活检样本中microRNA组合B鉴别SQ与AC的AUC估算。附图4是支气管刷检样本的ROC曲线分析。A :支气管刷检样本中microRNA组合A鉴别SCLC与NSCLC的AUC估算；B :支气管刷检样本中microRNA组合B鉴别SQ与AC的AUC估算。
具体实施例方式下面结合附图对本发明提供的具体实施方式
作详细说明。实施例I microRNA的筛选获取和独立验证 总体实验方案如下
通过收集2008年8月至2011年12月间中山医院586例肺癌组织或脱落细胞样本，每例均由两名有经验的肺癌病理学家审核，586份样本被分配至五组之一，其中各组病例独立
不重叠。I.发现组采用激光捕获显微分离技术从82例(36例AC、30例SQ与16例SCLC)独立冷冻组织中提取癌细胞作微阵列研究，得到用于肺癌分型的候选miCToRNA，并进一步经定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)证实其价值。2.训练组人工分离85份石蜡包埋的肺部组织(29例AC、24例SQ与32例SCLC)以确保癌细胞> 75%。85份手术训练样本经定量RT-PCR后根据Logistic回归模型分别构建SCLC与NSCLC和SQ与AC鉴别诊断的microRNA组合。3.验证组人工分离68份石蜡包埋的肺部组织(24例AC、21例SQ与23例SCLC)以确保癌细胞> 75%。68份手术确认样本经RT-PCR证实microRNA组合的诊断价值。4.应用组A :从疑似肺癌病人与接受纤维支气管镜检查的病人中获取支气管活检样本144例(48例AC、48例SQ与48例SCLC)。支气管镜活检诊断结果均由两位经验丰富病理学家审核。定量RT-PCR用以证实两个microRNA组合的诊断价值。5.应用组B :从疑似肺癌病人与接受纤维支气管镜检查的病人中获取支气管刷检样本207份(85例AC、69例SQ与53例SCLC)。显微镜检测癌细胞后排除未发现癌细胞的纤维支气管镜病人。为确保准确性与公正性，肺癌分型由上海肿瘤医院与中山医院两位细胞病理学家进行，两人分别有十年以上细胞学诊断经历。肿瘤分型经纤维支气管镜活检样本或手术样本的组织学诊断确认。定量RT-PCR用以证实两个microRNA组合的诊断价值。具体实验方法及结果如下
一、发现组获取用于肺癌分型的候选microRNA
I实验方法
I.I Agilent芯片实验
I.I. I样品RNA的放大和标记
提取癌细胞总RNA,总RNA采用Agilent表达谱芯片配套试剂盒，Low Input QuickAmp Labeling Kit, One-Color (Cat#5190-2305, Agilent technologies, Santa Clara,CA, US)和标准操作流程对样品总RNA中的mRNA进行放大和标记，并用RNeasy mini kit(Cat#74106, QIAGEN, GmBH, Germany)纯化标记后的 cRNA。
I. 2. 2芯片杂交
按照Agilent表达谱芯片配套提供的杂交标准流程和配套试剂盒，Gene ExpressionHybridization Kit(Cat#5188-5242, Agilent technologies, Santa Clara, CA， US)，在滚动杂交炉(Hybridization Oven, Cat#G2545A, Agilent technologies, Santa Clara,CA，US)中65*€，lOrpm，滚动杂交17小时，杂交cRNA上样量600ng，并在洗缸(stainingdishes, Cat#121, Thermo Shandonj Waltham, MAj US)中洗片，洗片所用的试剂为 GeneExpression Wash Buffer Kit (Cat#5188_5327， Agilent technologies, Santa Clara,CA，US)。I. I. 3芯片扫描
完成杂交的芯片米用 Agilent Microarray Scanner (Cat#G2565CA, Agilenttechnologies, Santa Clara, CA，US)进行扫描，软件设置 Dye channel: Green,Scan resolution=3μ m，20bito 用 Feature Extraction software 10. 7 (Agilent·technologies, Santa Clara, CA，US)读取数据，最后米用 Gene Spring Software11.0 (Agilent technologies, Santa Clara, CA，US)进行归一化处理，所用的算法为Quantile01. I. 4芯片信号的检测与分析
上述微阵列的统计学分析米用分类器PAM (Prediction Analysis of Microarray，可参见文献Tibshirani R et al (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99:6567-6572)和分类器WEKACWaikato Environment for Knowledge Analysis，可参见文献Frank E et al (2004)Bioinformatics 20:2479-2481)以选取子集及构建分类模型。候选microRNA的统计学分析米用 Unpaired Unequal Variance t-test with Benjamini-Hochberg Correction 以分析是否存在可鉴别SCLC与NSCLC和SQ与AC的miciORNA差异性表达，得到用于肺癌分型的 microRNA。I. 2定量RT-PCR反应验证 1.2. I RNA提取和纯化
米用 TRIZOL Reagent (Cat#15596_018，Life technologies, Carlsbad, CA，US)，并且根据生产厂商提供的标准操作流程进行样品的总RNA抽提，抽提所得总RNA经Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent technologies, Santa Clara, CA，US)电泳质检后使用 RNeasy mini kit (Cat#74106, QIAGENj GmBHj Germany)和 RNase-Free DNase Set(Cat#79254, QIAGENj GmBHj Germany)，纯化总 RNA。1.2.2内参基因及引物
内参基因选用小 RNA U47，U47 和 7 个候选 microRNA (has-miR-25、has-miR-205、has-miR-375、has_miR-29a、has_miR-29b、has_miR-27a、has_miR-34a)的基因的引物均向ABI公司订做购买成品。引物序列如下
权利要求
1.一种鉴别肺癌亚型的microRNA,其特征在于,所述的microRNA选自 a)序列如SEQID No. η所示的microRNA，其中η为2，3，4或7 ;或 b)与SEQID No. η所不序列互补的microRNA。
2.权利要求I所述的microRNA在制备鉴别肺癌亚型的试剂中的用途。
3.一种鉴别肺癌亚型的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有权利要求I所述的microRNAο
4.一种鉴别肺癌亚型的microRNA集，其特征在于，所述的集至少包含下列中的一种a)包含序列如SEQ ID No. 3所示的microRNA和序列如SEQ ID No. 4所示的microRNA 的集； b)包含序列如SEQ ID No. 2所不的microRNA和序列如SEQ ID No. 7所不的microRNA的集。
5.权利要求4所述的microRNA集在制备鉴别肺癌亚型的试剂中的用途。
6.一种鉴别肺癌亚型的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有权利要求4所述的microRNA 集。
7.一种鉴别肺癌亚型的microRNA芯片,其特征在于,所述的microRNA芯片包括固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性的对应于SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4和/或SEQ ID No. 7所示的部分或全部序列。
全文摘要
本发明提供了一种鉴别肺癌亚型的microRNA，所述的microRNA选自a)序列如SEQ ID No.n所示的microRNA，其中n为2，3，4或7；或b)与SEQ ID No.n所示序列互补的microRNA。本发明还提供了上述microRNA的用途和基于上述microRNA的试剂盒。本发明另提供了由上述microRNA组成的集、该集的用途和基于该集的试剂盒。其优点在于上述microRNA可构成两个组合SEQ ID No.2和SEQ ID No.7、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4，可分别用于鉴别诊断小细胞肺癌与非小细胞肺癌、肺腺癌与肺鳞癌，且诊断速度快、成本低、结果准确可靠，为肺癌患者进行准确的靶向治疗提供了重要依据。
文档编号C12N15/113GK102839179SQ201210338988
公开日2012年12月26日 申请日期2012年9月14日 优先权日2012年9月14日
发明者卢韶华, 白春学, 黄威, 侯英勇, 吴莹, 朱虹光 申请人:复旦大学附属中山医院