专利名称：焦磷酸测序法检测nppa基因多态性的试剂盒及方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，具体的是涉及焦磷酸测序法检测NPPA基因多态性的试剂盒及方法。
背景技术：
NPPA基因编码ANP前体，ANP (心钠素)起利尿剂作用，它调节细胞外液容量和电解质稳态。钙离子拮抗剂是通过阻滞钙通道来降低血压的化学制剂。(又叫钙通道阻滞药、钙拮抗药)它可以选择性抑制Ca2+经细胞膜上的钙通道进入细胞内，具有扩张血管和负性肌力作用，松弛血管平滑肌，减少末梢血管阻力，从而降低血压，但脑、冠状动脉和肾血流量不 减少。钙拮抗剂抑制心肌的收缩力及传导，并抑制血管平滑肌的收缩使血管扩。硝苯地平、氨氯地平是常用的治疗高血压的钙离子拮抗剂。利尿剂主要是通过促进体内电解质(钠离子为主)和水分排出，使血容量减少,血压下降，该药降压作用较温和，作用持久。噻嗪类利尿剂治疗高血压，特别适用于轻中度高血压病人，、老年人单纯收缩期高血压、肥胖及高血压合并心力衰竭的患者久。该药因价格低廉此药而虽然是高血压患者常用药物常用的一种药物而且价格便宜，但部分患者服用此药效果不如其他患者。研究证明NPPA T2238C基因突变型患者对利尿药的反应更为敏感治疗效果好，而非突变患者对使用钙离子拮抗药效果更佳，检测NPPA基因型有利于患者选择适合于自己的抗高血压药物，防止远期副反应的发生。NPPA基因T2238C变异与与CHD、脑卒中、全因死亡，合并CHD和合并心血管病以及不同药物的疗效差异相关连，对于TT基因型患者，选择氨氯地平由优于其他利尿类以及血管紧张素转化酶抑制剂(JAMA. 2008; 299 (3) :253)。开发快速、高效、准确、便捷、经济的检测NPPA基因多态性的试剂盒将为其底物药的临床个体化治疗起到积极的推动作用。焦磷酸测序(Pyro sequencing)技术是新一代DNA序列分析技术,该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，是一种通用型技术平台。该技术具有操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量等特点，符合临床大样本检测要求。
发明内容
本发明旨在提供一种焦磷酸测序法检测NPPA基因(SEQ ID NO. I)多态性的试剂盒及方法，以实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测其底物(如利尿药等)个体化用药相关基因SNP。为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为一种焦磷酸测序法检测NPPA基因多态性的试剂盒，包括如下引物(I)扩增引物上游引物5/-ACA GGA GCC TCT TGC AGT CT-3' (SEQ ID NO. 2)；
下游引物5'-ACC AAG CCA GAT ATG TCT GTG TTC-3' (SEQ ID NO. 3)；其中，下游引物的5'进行生物素标记；(2)测序引物5' -TCT GTG TTC TCT TTG CAG TA-3' (SEQ ID NO. 4)；试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂。一种应用上述试剂盒检测NPPA基因多态性的方法，包括如下步骤(I) DNA 提取；(2)聚合酶链反应配制50μ I PCR扩增体系，包含10XPCR buffer 5. O μ I, dNTP I. 5 μ 1，上游引物
O.5μ 1，下游引物 O. 5μ l，rTaqO. 5μ 1，水 40μ 1，模板 2· Ομ I ;循环程序为 95° C 5min 预变性；依次在95° C 30S，55° C 30S，72° C 15S，进行35个循环；72° C保持5min，最终保持在4° C，得扩增产物；(3)焦磷酸测序单链样本纯化；(4)焦磷酸测序及结果分析。本发明的试剂盒对NPPA RS5065目标序列进行分析和检测，该目标序列包括野生型 TCCCTGGCTGTTATCTTCAGTACTGCAAAGAGAACACAG (SEQ ID NO. 5)和突变型 TCCCTGGCTGTTATCTTCGGTACTGCAAAGAGAACACAG (SEQ ID NO. 6)。由于设计了特异性高的引物，并且选择了合适的方法，本发明的试剂盒适用于对NPPA基因多态性进行快速检测，可广泛应用于临床上NPPA底物药个体化用药方案制定的基因检测。与现有技术相比，其应用焦磷酸测序技术可以快速、准确地进行短DNA序列分析，便于构建标准化操作流程；具有高通量、低成本等特点；PCR产物即可直接用于测序，不需进行产物纯化等二次处理，操作极为简便，所需样品量小。
图I为本发明NPPA(rs5065)野生型纯合子焦磷酸测序结果。
具体实施例方式下面结合实施例对上述试剂盒及检测方法进行详细描述。实施例I :NPPA-pyroF (上游引物):5' -ACA GGA GCC TCT TGC AGT CT-3' (SEQ ID NO. 2)；NPPA-pyroR (下游引物)5/ -ACC AAG CCA GAT ATG TCT GTG TTC-3' (SEQ IDNO. 3)；测序引物5'-TCT GTG TTC TCT TTG CAG TA-3' (SEQ ID NO. 4)；I. DNA 提取I. I实验前试剂材料准备与检查工作如下(I)检查试剂盒保质期以及确保Wash Buffer I和2中已添加乙醇，并在瓶上相应标识处打勾V ； (2)异丙醇(如无，可用无水乙醇替代)和75%乙醇；(3)高压灭菌有效期内的I. 5mL Eppendorf管和各类移液枪头。I. 2从4°C冰箱中取出装有全血的EDTA抗凝管，上下颠倒数次混匀；I. 3在I. 5mL Eppendorf管对应标本唯一11"生标识做好标记；
I. 4 分别移取 900uL Cell Lysis Solution 加至灭菌的 I. 5mL Eppendorf 管；I. 5小心移取300uL全血转移至上述加有Cell Lysis Solution的I. 5mL EP管；I. 6 盖上 Eppendorf 管盖，室温孵育 IOmin ；1.713，OOOrpm 室温离心 20 秒；I. 8取出Eppendorf管,观察白色沉淀；I. 9开Eppendorf管盖，手持管底部，倾斜EP管口弃去部分红色上清，尽量将红色上清吸尽；I. 10盖上Eppendorf管,用手指弹击EP管底部,使白色沉淀重悬；1.11移取300111^ Nuclei Lysis Solution 入上述Eppendorf 管中，盖上管，上下颠倒数次混匀；I. 12 打开 Eppendorf 管，移取 IOOuL Protein Precipitation Solution 入上述Eppendorf管中，盖上管管，振荡器上剧烈振荡20秒；13，OOOrpm室温离心3min ；I. 13移取上清转移到新的已灭菌I. 5mL Eppendorf管；I. 14移取300uL异丙醇入EP管，盖上管盖，上下颠倒数次混匀，可见白色絮状gDNA析出；I. 1513, OOOrpm 室温离心 Imin ；I. 16打开Eppendorf管，手捏管底部，倾斜管口弃去上清；I. 17移取300uL 75%乙醇加入Eppendorf管，盖上管盖，轻柔上下颠倒洗涤沉淀；I. 1813, OOOrpm 室温离心 Imin ；I. 19打开Eppendorf管，手持管底部，倾斜管口弃去上清；I. 20在实验台上放置新滤纸,倒扣Eppendorf管，吸干液体,将Eppendorf管开盖侧放风干；I. 21 目测沉淀大小，加入 50 IOOul DNA Rehydration Solution 至沉淀；I. 22过夜溶解后用Nano-Space紫外分光光度计进行核酸浓度测定，核酸浓度大于50ng/ul视为合格，如浓度不够，加入乙醇再次沉淀DNA，然后重新加适量的DNARehydration Solution 溶解 DNA。I. 23在管壁和管盖上再次标清样本唯一性编号，并用透明胶带缠绕保护；I. 24保存核酸标本至4°C冰箱；2.聚合酶链反应2. I在试剂准备区配制50 μ I PCR扩增体系(模板添加除外)，各组分及添加量如下表
权利要求
1.一种焦磷酸测序法检测NPPA基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括如下引物 (1)扩增引物 上游引物5' -ACA GGA GCC TCT TGCAGT CT-3'； 下游引物5' -ACC AAG CCA GAT ATG TCT GTG TTC-3'； 其中，下游引物的5'进行生物素标记； (2)测序引物5'-TCT GTG TTC TCT TTG CAG TA-3'。
2.一种应用权利要求I所述的试剂盒检测NPPA基因多态性的方法，包括如下步骤 (1)DNA 提取； (2)聚合酶链反应 配制 50 μ I PCR 扩增体系，包含10XPCR buffer 5. O μ I, dNTP I. 5 μ 1，上游引物.O. 5μ 1，下游引物 O. 5μ l，rTaqO. 5μ 1，水 40μ 1，模板 2· Ομ I ;循环程序为95° C 5min 预变性；依次在95° C 30S，55° C 30S，72° C 15S，进行35个循环；72° C保持5min，最终保持在4° C，得扩增产物； (3)焦磷酸测序单链样本纯化； (4)焦磷酸测序及结果分析。
全文摘要
本发明公开了一种焦磷酸测序法检测NPPA基因多态性试剂盒及方法。所述试剂盒NPPA基因多态性进行检查，具体是指rs5065(G>T)单核苷酸多态性。试剂盒包含如SEQ ID NO.2—4所示的引物。本发明的试剂盒，可以实现准确、快捷、高通量NPPA基因多态性的检测，从而达到对其底物实现安全合理有效的个体化给药。
文档编号C12Q1/68GK102876786SQ20121033894
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月13日 优先权日2012年9月13日
发明者周宏灏 申请人:周宏灏