专利名称：一种促进胞外蛋白基质分泌的方法和其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种促进胞外酶分泌的的方法和其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术：
在制备重组蛋白的众多表达系统中，大肠杆菌表达系统凭借培养条件简单，生长周期短，表达效率高等优势被认为是实现规模化制备重组蛋白的有效表达系统之一。根据最终定位方式，采用大肠杆菌表达系统表达 外源蛋白有三种形式胞内表达、周质表达以及胞外基质表达。与胞内及周质空间定位相比，重组蛋白分泌至胞外基质中，不仅有助于蛋白的折叠，降低包涵体的形成几率，而且免除了通过菌体破碎或周质释放来回收目的蛋白步骤，大大减少了宿主菌杂蛋白污染，提高了下游纯化效率。因此，基质表达在生物产品规模化生产中具有重要的意义。根据大肠杆菌的两层细胞膜结构，生理条件下，大肠杆菌共有I-V型5种分泌蛋白的方式。重组蛋白的基质分泌一般采用绝大部分大肠杆菌自身蛋白跨膜转运所采纳的由SecB介导的II型分泌途径。在大肠杆菌中，当目的蛋白N末端有一段约20-30个氨基酸残基组成的Sec途径特征性信号肽序列(如PelB、OmpA, MalE等)时，前体目的蛋白从核糖体中合成后即与转运伴侣蛋白SecB结合,开始SecB途径介导的蛋白胞内运输与跨内膜转运，当前体蛋白的N-末端信号肽跨过内膜暴露于位于内外膜之间的周质空间时，周质空间中存在的特异性信号肽酶将信号肽切除，然后在一系列伴侣蛋白的帮助下完成构象折叠，并可进一步跨外膜于胞外基质中。由于外源蛋白在大肠杆菌中极易获得较高的合成速率，故在分泌型表达研究中，如何强化分泌过程尤为重要。研究者一般通过研究转运蛋白之间以及目标蛋白和转运蛋白之间的相互作用机制，强化蛋白分泌过程或者在不引起菌体裂解的情况下构建外膜渗漏突变型菌株、添加适量可导致膜通透性增加的化学添加剂来强化跨膜转运过程。角质酶是一种多功能酶，可水解各种可溶性酯类、乳化的甘油三酯、不溶性脂肪酸酯、不溶性多聚体角质等。前期工作已表明T. fusca角质酶具有磷脂酶的水解活性，并且可通过角质酶对大肠杆菌细胞膜磷脂成分的有限水解作用提高细胞膜的通透性来实现无信号肽的角质酶自身(吴敬，宿玲恰，陈晟，陈坚一种基质表达T. fusca角质酶的方法.201210241426. 7)和胞内目标蛋白(吴敬，宿玲恰，陈晟，陈坚一种将胞内蛋白基质表达的方法和其应用.201210045965. 3)的基质表达。本发明在此基础上利用该作用来促进胞外酶的基质分泌型表达。本发明选取两种重要的工业用酶α -高温酸性淀粉酶和内切-β-1，4-木聚糖酶作为报告蛋白。α-淀粉酶(α-1，4_葡萄糖-4-葡萄糖水解酶)可在淀粉分子链中间切断α-1，4糖苷键，生成可溶性糊精、低聚糖及少量麦芽糖、葡萄糖。其中α-高温酸性淀粉酶由于其优良的耐热性和耐酸性被广泛应用在以淀粉为原料的工业生产中。内切-β-ι，4-木聚糖酶可从木聚糖主链内部随机作用于β-1，4_糖苷键，将木聚糖分解成低聚木糖，在食品、饲料、造纸等行业均具有广泛的应用前景。
发明内容
本发明提供了一种促进胞外蛋白基质表达的方法，是将T. fusca角质酶基因(NCBI编号AAZ54921)和目标蛋白基因在宿主菌大肠杆菌中共表达，经发酵培养，收集发酵上清液。为解决上述技术问题，具体方法为I)将本研究室前期构建的Tfu_0883/pETDuet_l和含有胞内目标蛋白基因的重组质粒pET20b(+)进行双酶切，连接酶连接过夜，连接产物转化E. coliJM109感受态细胞，得到含有目标蛋白基因的重组质粒Tfu_0883/pETDuet-l ；2)将含有目标蛋白基因的重组质粒Tfu_0883/pETDuet_l导入宿主大肠杆菌；3)步骤2)构建的重组大肠杆菌发酵生产目标蛋白，收集发酵上清液。
所述宿主菌可以为E.coliBL21(DE3), E. coli W3110, E. coli JM109、E. coliJM109(DE3)、Ε· coli DH5 α 等，其中优选 E.coli BL21(DE3)。所述携带角质酶和目标蛋白的载体为pETDuet-1、pCOLADuet-1等双启动子载体；pUC系列，pET系列，pT7-7, pGEX等任意一种。所述胞外目标蛋白是指在细胞质核糖体中合成后，在一系列转运蛋白的帮助下通过特定的分泌途径(I型-V型)跨内外膜最终定位于基质培养基中，其中优选SecB介导的II型分泌途径。所述Tfu_0883/pETDuet-l (吴敬，宿玲恰，陈晟，陈坚一种将胞内蛋白基质表达的方法和其应用· 201210045965. 3)为含有T. fusca角质酶基因(NCBI编号AAZ54921)的
重组质粒。胞外目标蛋白的表达将上述含角质酶重组质粒与含胞外目标蛋白基因的重组质粒进行双酶切，连接酶连接，转化E. coli JM109感受态细胞，挑选转化子并提取重组质粒，将其导入宿主菌，进行液体培养。本发明通过共表达T. fusca角质酶，大肠杆菌细胞通透性提高，促进胞外目标蛋白的基质分泌，一方面可缩短发酵周期，提高生产效率；另一方面，由于蛋白合成后可快速转运至培养基中，因此可减少胞内包涵体的生成，大大提高生产水平。
图I重组大肠杆菌摇瓶发酵生产淀粉酶的过程曲线图■，对照重组菌； ，共表达角质酶重组菌图2重组大肠杆菌生产淀粉酶的SDS-PAGE分析M，蛋白质分子量标准；1，对照菌发酵液上清2，共表达角质酶重组菌发酵液上清图3重组大肠杆菌摇瓶发酵生产木聚糖酶的过程曲线图■，对照重组菌；·，共表达角质酶重组菌图4重组大肠杆菌生产木聚糖酶的SDS-PAGE分析M，蛋白质分子量标准；1，对照菌发酵液上清；2，共表达角质酶重组菌发酵液上清；3，对照菌细胞破壁上清；4，共表达角质酶重组菌细胞破壁上清；5，对照菌细胞破壁沉淀；6，共表达角质酶重组菌细胞破壁沉淀
具体实施例方式实施例I :Tfu_0883/amy/pETDuet-l 重组质粒的构建Tfu_0883/pETDuet_l 质粒(吴敬，宿玲恰，陈晟，陈坚一种将胞内蛋白基质表达的方法和其应用.201210045965. 3)和实验室前期构建的amy/pET20b (+)(吴敬，陈晟，李祝，陈坚一种耐热α -淀粉酶及其基因工程菌的构建方法.201210274173. 3)进行NdeI和XhoI双酶切，酶切产物割胶回收后，再用Τ4连接酶16°C连接过夜，连接产物转化Ε. coli JM109感受态细胞，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB固体平板，经37°C培养过夜，挑选转化子于含100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基进行培养，然后提取质粒，得到重组质粒Tfu_0883/amy/pETDuet-Ι。α -高温酸性淀粉酶的表达将 Tfu_0883/amy/pETDuet-Ι 转化E. coli BL21 (DE3)宿主菌，在含100mg/L氨苄青霉素的LB固体平板上经37°C培养8_10h，挑选转化子在LB 液体培养基中37°C培养8-10h，后以5%接种量接入TB (甘油5g/L，蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，K2HPO412. 54g/L，KH2P042. 31g/L)发酵液体培养基(含 100 μ g/mL 氨苄青霉素)37 °C培养2h后用0. 4mM IPTG(异丙基硫代-β-D半乳糖苷)30°C诱导约60h。对照菌amy/pET20b (+) -E. coli BL21(DE3)采用同样的条件进行发酵培养。发酵液于4°C，SOOOrpm离心lOmin，分别测定对照重组菌和共表达角质酶重组菌的培养基中淀粉酶酶活为308U/mL和358U/mL，并且后者发酵周期仅为前者的一半(图I)，SDS-PAGE显示，两者目标蛋白分子量一致，约为53kDa (图2)，而胞内均检测不到酶活，表明目标蛋白几乎全部分泌至胞外。实施例2 Tfu_0883/xynA/pETDuet-l 重组质粒的构建将 Tfu_0883/pETDuet_l 质粒和实验室前期构建的xynA/pET20b(+)(吴敬，陈晟，何洁，宿玲恰，陈坚一种宽pH作用范围木聚糖酶及其应用.201210284346. X)进行NdeI和XhoI双酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶16°C连接过夜，连接产物转化E. coli JM109感受态细胞，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB固体平板，经37°C培养过夜，挑选转化子于含100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基进行培养，然后提取质粒，得到重组质粒Tfu_0883/xynA/pETDuet-l。木聚糖酶的表达与制备将Tfu_0883/xynA/pETDuet_l 转化Ε· coli BL21 (DE3)宿主菌，在含100mg/L氨苄青霉素的LB固体平板上经37°C培养8_10h，挑选转化子在LB液体培养基中37°C培养8-10h，后以5%接种量接入TB (甘油5g/L，蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，K2HPO4 12. 54g/L，KH2PO4 2. 31g/L)发酵液体培养基(含100 μ g/mL氨苄青霉素)25°C培养6h后用0. ImM IPTG (异丙基硫代-β -D半乳糖苷)诱导约60h。对照菌xynA/pET20b (+) -E.coli BL21(DE3)采用同样的条件进行发酵培养。发酵液于4°C，SOOOrpm离心lOmin，分别测定对照重组菌和共表达角质酶重组菌的培养基中木聚糖酶酶酶活为68U/mL和480U/mL，并且后者发酵周期至少缩短了 10h(图
3)，SDS-PAGE表明，两者目标蛋白分子量一致，约为43kDa，但对照菌存在大量包涵体，而共表达角质酶重组菌的包涵体极少(图4)，表明在角质酶提高细胞膜通透性的情况下，可加快目标蛋白的转运速率，促使后续合成的目标蛋白的正确折叠，因此可减少胞内包涵体的生成，大大提高生产水平。两者胞内酶活分别为5. 2和8. 8U/mL，表明目标蛋白几乎全部分泌至胞外。·
权利要求
1.一种促进胞外酶基质分泌的方法，其特征在于，将NCBI编号为AAZ54921的T. fusca角质酶基因和目标蛋白基因在宿主菌大肠杆菌中共表达，发酵培养并收集发酵上清液。
2.权利要求I所述的方法，其特征在于，具体方法为 1)将Tfu_0883/pETDuet-l和含有目标蛋白基因的重组质粒pET20b(+)进行双酶切，连接酶连接过夜，连接产物转化E. coli JM109感受态细胞，得到含有目标蛋白基因的重组质粒 Tfu_0883/pETDuet-l ； 2)将含有目标蛋白基因的重组质粒Tfu_0883/pETDuet-l导入宿主大肠杆菌； 3)步骤2)构建的重组大肠杆菌发酵生产目标蛋白，收集发酵上清液。
3.权利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述宿主大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)、E.coli W3110.E. coli JM109、E.coli JM109 (DE3)、E. coli DH5 α 中任意一种。
4.权利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述目标蛋白为携带大肠杆菌特征性信号肽，通过大肠杆菌特定分泌途径分泌的蛋白。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述分泌途径为大肠杆菌I型-V型分泌途径中的任意一种。
6.权利要求2所述的方法，其特征在于，所述含有目标蛋白基因的重组质粒pET20b(+)为 amy/pET20b (+)或 xynA/pET20b (+)。
7.权利要求3所述的方法，其特征在于，所述宿主大肠杆菌为E.coliBL21(DE3)。
8.权利要求5所述的方法，其特征在于，所述分泌途径为SecB介导的II型分泌途径。
9.一种权利要求I所述方法在基质分泌胞外蛋白中的应用。
全文摘要
一种促进胞外蛋白基质分泌的方法和其应用，属于生物工程技术领域。是将T.fusca角质酶和胞外目标蛋白在大肠杆菌中共表达，利用角质酶对细胞膜磷脂的水解作用提高细胞膜的通透性，从而促进目的蛋白的基质分泌，可缩短发酵周期，减少包涵体的生成，提高生产效率，具有较高的学术意义和应用价值。
文档编号C12N15/70GK102827863SQ201210338830
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月3日 优先权日2012年9月3日
发明者吴敬, 宿玲恰, 陈坚 申请人:江南大学