一种1,5-脱水葡糖醇的脱氢酶法测定方法
【专利摘要】本发明涉及一种1，5-脱水葡糖醇的脱氢酶法测定方法，可广泛应用在医学及生物化学【技术领域】。其特点是：用ATP依赖性己糖激酶(ATP-HK)将待测物1，5-脱水葡萄糖醇(1，5-AG)和主要干扰物葡萄糖(Glu)分别转化为1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸(1，5-AG-6-P)和葡萄糖-6磷酸(Glu-6-P)，通过系统中的丙酮酸激酶(PK)和磷酸烯醇式丙酮酸盐(PEP)，建立ATP再生系统，确保1，5-AG和Glu分别向1，5-AG-6-P和Glu-6-P转化。转化后的1，5-AG-6-P被1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶(AG6PDH)特异性地脱氢氧化，同时使2-(4-碘苯)-5-(2，4-二硝基苯)-5-(2，4-二磺基苯)-2H-四氮唑(WST-5)还原为有色物质，用全自动生化分析仪比色定量。
【专利说明】一种1 ’ 5-脱水葡糖醇的脱氢酶法测定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及1，5_脱水葡糖醇(1，5-AG)的脱氢酶法测定方法，可广泛应用在医学及生物化学【技术领域】。
【背景技术】
[0002]血清中1，5_脱水葡糖醇浓度不受即时的饮食、葡萄糖摄食量影响，能快速、灵敏的反映3-5天内总血糖变化情况。糖尿病患者血清1，5-AG显著降低，当糖尿病得到良好控制时，血清1，5-AG的日回升率十分稳定，不受冶疗方法、性别、年龄、体重、患病时间和血清中1，5-AG起初的浓度影响，回升幅度和对糖尿病诊断的敏感性及特异性均明显大于常用的糖尿病诊断指标糖化血红蛋白(HbAlc)和果糖胺(GSP)。
[0003]文献报道测定1，5_AG的方法有阴离子交换层析法、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱质谱法(LC-MS)、全自动酶分析法等，前三种方法需要对1，5-AG进行衍生和复杂的样品前处理，同时需特殊、昂贵仪器，不适合临床常规分析。全自动酶法虽好，但易受血清中高浓度葡萄糖干扰，如Fukumura Y (Clin Chem, 1994,40:2013-2016.)、陈国军等(中华医学检验杂志，1999，22 (6):358-361.)在测定1，5-AG时，将葡萄糖通过葡萄糖激酶(GK)转化为6-磷酸葡萄糖，然后用吡喃糖氧化酶(PROD)将1，5-AG氧化产生过氧化氢并偶联TrindreJ s反应显色定量。由于PROD酶的底物特异性不佳，反应中生成的6-磷酸葡萄糖在丙酮酸激酶等含量不足时 易重新转化为葡萄糖，生成的葡萄糖被PROD酶氧化后参与Trindre^ s反应并显色，从而引起1，5_AG的测定结果假性升高。
[0004]本发明的目的是为了解决上述技术的不足，通过ATP依赖性己糖激酶(ATP-HK)将待测物1，5-脱水葡萄糖醇(1，5-AG)和主要干扰物葡萄糖(Glu)分别转化为1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸(l，5-AG-6-P)和葡萄糖-6磷酸(Glu_6_P)，并通过系统中的丙酮酸激酶(PK)和磷酸烯醇式丙酮酸盐(PEP)，建立ATP再生系统，确保1，5-AG和Glu分别向1，5-AG-6-P和Glu-6-P转化，转化后的1，5-AG-6-P用1，5-脱水葡萄糖醇_6_磷酸脱氢酶(AG6H)H)特异性地脱氢氧化，利用2-(4-碘苯)-5-(2，4_ 二硝基苯)-5-(2，4_ 二磺基苯)_2H_四氮唑(WST-5)的变色反应实现对I，5-AG的定量检测。该法避免使用了价格昂贵的葡萄糖激酶和批喃糖氧化酶，方法特异性好，高达14.8g/L(82.2mmol/L)的葡萄糖不干扰本法测定。
【发明内容】
[0005]本发明提供了 1，5_脱水葡糖醇(1，5-AG)的脱氢酶法测定方法，用于血清1，5_脱水葡糖醇的测定。该测定体系主要是用ATP依赖性己糖激酶(ATP-HK)将待测物1，5-脱水葡萄糖醇(1，5-AG)和主要干扰物葡萄糖(Glu)分别转化为1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸(L5-AG-6-P)和葡萄糖-6磷酸(Glu-6-P)，通过系统中的丙酮酸激酶(PK)和磷酸烯醇式丙酮酸盐(PEP)，建立ATP再生系统，确保1，5-AG和Glu分别向1，5-AG-6-P和Glu_6_P转化。转化后的1，5-AG-6-P被1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶(AG6H)H)特异性地脱氢氧化，同时使2-(4-碘苯)-5-(2，4-二硝基苯)-5-(2，4-二磺基苯)-2H-四氮唑(WST-5)还原为有色物质，用全自动生化分析仪比色定量。
[0006]为了达到理想的检测效果，本发明还特别提供了 1，5_脱水葡糖醇(1，5-AG)的脱氢酶法测定试剂，分为A、B 二个组份。两个组份的具体成份组成可表述如下。
[0007]A 组份:
[0008]
【权利要求】
1.一种1，5-脱水葡糖醇的脱氢酶法测定方法，其特征是用ATP依赖性已糖激酶(ATP-HK)将待测物1，5-脱水葡萄糖醇(1，5-AG)和主要干扰物葡萄糖(Glu)分别转化为1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸(l，5-AG-6-P)和葡萄糖_6磷酸(Glu_6_P)，通过系统中的丙酮酸激酶(PK)和磷酸烯醇式丙酮酸盐(PEP)，建立ATP再生系统，确保1，5-AG和Glu分别向I，5-AG-6-P和Glu-6-P转化。转化后的I，5-AG-6-P被I，5-脱水葡萄糖醇_6_磷酸脱氢酶(AG6H)H)特异性地脱氢氧化，同时使2- (4-碘苯)-5- (2,4- 二硝基苯)_5_ (2,4- 二磺基苯)-2H-四氮唑(WST-5)还原为有色物质，用全自动生化分析仪比色定量。
2.根据权利要求1所述的一种1，5-脱水葡糖醇的脱氢酶法测定方法，其特征是在将主要干扰物葡萄糖转化为葡萄糖-6磷酸(Glu-6-P)的同时，必须建立ATP再生系统。
3.根据权利要求1所述的一种1，5_脱水葡糖醇的脱氢酶法测定方法，其特征是在将主要干扰物葡萄糖转化为葡萄糖-6磷酸(Glu-6-P)的酶是ATP依赖性己糖激酶(ATP-HK)。
4.根据权利要求1所述的一种1，5_脱水葡糖醇的脱氢酶法测定方法，其特征是待测物1，5-脱水葡萄糖醇(1，5-AG)在转化为1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸(1，5-AG-6_P)后，被1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸`脱氢酶(AG6H)H)特异性地脱氢氧化。
【文档编号】C12Q1/26GK103725748SQ201210417853
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2012年10月16日 优先权日:2012年10月16日
【发明者】潘利琴 申请人:温州市人民医院