一种基因重组纤维素分解酵母菌方法
【专利摘要】本发明公开了一种基因重组纤维素分解酵母菌方法，属于生物方法领域。包括如下步骤：1、纤维素酶基因cDNA模板制备；2、基因克隆片段制备；3、将目标基因克隆片段嵌入载体质粒，构建基因重组质粒；4、基因重组质粒的筛选与鉴别；5、基因重组质粒导入酵母表达系统；6、基因重组酵母菌的筛选与鉴别；7、重组基因表达的诱导。本发明解决了混合菌种在使用过程中存在的天然不可调和矛盾，减少了分解体系内部之间的排斥作用，最终有效的提高纤维素的利用效率，减少分解时间，增加其商业价值，从根本上解决了自然界中最大可再生资源的高效利用问题，为资源的可持续发展提供新的思路与方向。
【专利说明】一种基因重组纤维素分解酵母菌方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种生物方法，具体地说，涉及一种基因重组纤维素分解酵母菌方法。【背景技术】
[0002]纤维素、木质素一直是世界上总量最为巨大的可再生资源，所有植物中均含有，其最终分解物为各种小分子糖类:如葡萄糖、果糖等。都是许多其他生产活动所必须的优质的原材料，特别是在可再生生物能源领域。然而，由于纤维素结构十分稳定，其分解的生物学变化比较复杂，在自然界中极难被充分降解，并且即便能够适当降解，其耗时也过长，很难从经济角度产生价值。
[0003]目前，社会上现有的对于纤维素、木质素这类储量庞大的可再生资源的利用还基本停留在细胞层面，特别是在国内。由于纤维素等的分解需要多种酶和生化反应的参与，现有的技术主要通过将具有不同能力的多种微生物混合，通过各种微生物在整个分解过程中的不同环节发挥各自的作用，以最终分解纤维素。然而，从微生物学角度来说，在同一生态体系中的各微生物之间多存在拮抗作用。也就是说，由于营养物质的总量或空间大小固定，各菌种生长过程中为争夺营养物质或生存空间，确保自己是优势菌株，都会尽量抑制其他菌种的生长。同时，各不同菌种对于最佳生长环境的温度、湿度等要求不同。因此，多种菌种混合，很难使得各菌种都能同时获得最好生长条件。也就是说每一种菌株在实际过程中，很难有效的发挥其预计的在纤维素分解中特定环节的作用，从而使得纤维素分解的整个生化流程出现一个或多个瓶颈点，最终严重影响纤维素分解的效率，增加分解所需的时间。
[0004]PCR方法，即聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction),是利用单链寡核苷酸引物对特定DNA片 段进行体外快速扩增的一种方法。
[0005]电击法，利用高压电脉冲的电击穿孔作用将质粒DNA导入植物原生质体的方法。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是克服现有技术中的缺陷，提供一种基因重组纤维素分解酵母菌的方法。
[0007]为解决上述问题，本发明所采用的技术方案是:
[0008]一种基因重组纤维素分解酵母菌方法，其特征在于:包括如下步骤:
[0009]1、纤维素酶基因cDNA模板制备
[0010]以里氏木霉或者枯草芽孢杆菌作为供体菌株，将供体菌株中的mRNA通过逆转录获得cDNA ;以获得的cDNA为目标基因|旲板备用；
[0011]2、基因克隆片段制备
[0012]在NCBI数据库中确定供体菌株的纤维素酶系中的Cx酶、Cl酶和beta-葡萄糖苷酶3个目标基因的cDNA基因片段图谱，并针对基因片段图谱设计PCR反应的上下游引物；
[0013]以具有发酵产生酒精能力的酵母菌作为载体菌株，利用PCR反应，将载体菌株所需的3种特定基因表达片段的cDNA克隆，获得目标基因克隆片段；[0014]3、将目标基因克隆片段嵌入载体质粒，构建基因重组质粒
[0015]以pPICZ a作为载体质粒，将步骤2中所述的3组PCR产物分别与pPICZ a在缓冲液中进行三次酶切，酶切时温度控制在37°C，酶切时间2小时；
[0016]每次酶切完成后，均用T4-DNA连接酶将3个目标基因片段中的每一个都插入pPICZ a中，获得基因重组质粒；
[0017]4、基因重组质粒的筛选与鉴别
[0018]将步骤3获得的基因重组质粒导入大肠杆菌中，在含有25ug/ml博来霉素的低盐LB平板培养基上筛选抗性生长良好的菌落；
[0019]选取5-8个抗性生长良好的单菌落，纯化后提取基因重组质粒；
[0020]测序鉴定基因重组质粒，获得扩增好的基因重组质粒；
[0021]5、基因重组质粒导入酵母表达系统
[0022]将步骤4中获得的基因重组质粒用SacI酶进行线性化后，用电击法将构建好的基因重组质粒导入载体菌株中，获得基因重组酵母菌；
[0023]6、基因重组酵母菌的筛选与鉴别
[0024]电击结束后，立即加入温度为0°C、浓度为lmol/L的山梨醇1ml，非剧烈快速混匀后，吸取25-200ul，涂抹在含100ug/ml博来霉素的YPDS培养皿上，正方I小时后倒置于恒温培养箱中，在30°C的恒温条件下培养3-5天，直至形成生产良好的阳性单克隆；选取10-20个单菌落在含100ug/ml博来霉素的LB平板培养基上纯化，获得目标菌株；
`[0025]7、重组基因表达的诱导
[0026]挑选步骤6中得到的纯化的目标菌株，在Yro培养基中震荡培养过夜；WYro培养基中取IOOul培养液置于BMGY培养基中震荡培养过夜；在41:的恒温条件下，3500g离心IOmin ;去细胞沉淀悬浮于盛有25ml培养液的BMMY培养基中，并加入甲醇，至甲醇的终浓度为0.5%，在30°C的恒温条件下，震荡培养3-4天，诱导目标重组基因表达。
[0027]进一步地说:
[0028]所述载体菌株为毕赤酵母菌GS115。
[0029]所述PCR反应的上下游引物序列如下:
[0030]Cx 酶:上游引物 ATGGCGCCCTCAGTTACACT[0031 ] 下游引物 GAITTCCGTAACGCTCATCA
[0032]Cl 酶:上游引物 ATGTATCGGAAGITGGCCGT
[0033]下游引物 TTACAGGCACTGAGAGTAGT
[0034]beta-葡萄糖苷酶:上游引物 ATGCGTTACCGAACAGCAGC
[0035]下游引物 CTACGCTACCGACAGAGTGCT。
[0036]步骤3中所述的三次酶切中，第一次酶切是Cx酶的上下游引物、Cl酶的上下游引物和beta-葡萄糖苷酶的上下游引物分别与pPICZ a用限制性内切酶XhoI进行酶切；第二次酶切是Cx酶的上下游引物、Cl酶的上下游引物和beta-葡萄糖苷酶的上下游引物分别与pPICZa用限制性内切酶Xba I进行酶切；第三次酶切是Cx酶的上下游引物、Cl酶的上下游引物和beta-葡萄糖苷酶的上下游引物分别与pPICZ a用限制性内切酶Not I进行酶切。
[0037]与现有技术相比，本发明是利用当今世界主流及前沿的分子遗传学、微生物基因重组等技术，从生物学的本质上对纤维素等的分解提出的新的思路和方法。具体地说，本发明是通过基因克隆及重组技术，赋予单一菌种多项功能，实现了单一菌株完整分解纤维素的可能，消除了现有技术在中遇到的不可避免的拮抗作用，避开了由于多菌株发酵而必须要考虑的平衡各菌种之间最佳发酵条件的难题，保证了菌种在发酵过程中的最佳生长和发酵条件，从而可以最大程度的使得菌株在发酵体系中充分发挥其应有的功能和作用，提高纤维素等的利用率及有效减少反应所需时间。因而，本发明是一种全新的、从生物学本质层面更加有效的、更具有发展及推广前景的纤维素、木质素资源开发和利用的方法，解决了混合菌种在使用过程中存在的天然不可调和矛盾，减少了分解体系内部之间的排斥作用，最终有效的提高纤维素的利用效率，减少分解时间，增加其商业价值，从根本上解决了自然界中最大可再生资源的高效利用问题，为资源的可持续发展提供新的思路与方向。
[0038]下面结合【具体实施方式】对本发明做进一步的描述。
【具体实施方式】
[0039]实施例:
[0040]一种基因重组纤维素分解酵母菌方法，包括如下步骤:
[0041]1、纤维素酶基因cDNA模板制备
[0042]以里氏木霉或者枯草芽孢杆菌作为供体菌株，将供体菌株中的mRNA通过逆转录获得cDNA ；以获得的cDNA为目标基因|旲板备用。
[0043]2、基因克隆片段制备
[0044]在NCBI数据库中确定供体菌株的纤维素酶系中的Cx酶、Cl酶和beta-葡萄糖苷酶3个目标基因的cDNA基因片段图谱，并针对基因片段图谱设计PCR反应的上下游引物；
[0045]以具有发酵产生酒精能力的酵`母菌作为载体菌株，本实施例中，所述载体菌株优选为毕赤酵母菌GSl 15 ；
[0046]利用PCR反应，将载体菌株所需的3种特定基因表达片段的cDNA克隆，获得目标基因克隆片段；
[0047]所述PCR反应的上下游引物序列如下:
[0048]Cx 酶:上游引物 ATGGCGCCCTCAGTTACACT
[0049]下游引物 GAITTCCGTAACGCTCATCA
[0050]Cl 酶:上游引物 ATGTATCGGAAGITGGCCGT[0051 ] 下游引物 TTACAGGCACTGAGAGTAGT
[0052]beta-葡萄糖苷酶:上游引物 ATGCGTTACCGAACAGCAGC
[0053]下游引物 CTACGCTACCGACAGAGTGCT。
[0054]3、将目标基因克隆片段嵌入载体质粒，构建基因重组质粒
[0055]以pPICZ a作为载体质粒，将步骤2中所述的3组PCR产物分别与pPICZ a在缓冲液中进行三次酶切，酶切时温度控制在37°C，酶切时间2小时；
[0056]所述的三次酶切中，第一次酶切是Cx酶的上下游引物、Cl酶的上下游引物和beta-葡萄糖苷酶的上下游引物分别与pPICZ a用限制性内切酶Xho I进行酶切；第二次酶切是Cx酶的上下游引物、Cl酶的上下游引物和beta-葡萄糖苷酶的上下游引物分别与pPICZ a用限制性内切酶Xba I进行酶切；第三次酶切是Cx酶的上下游引物、Cl酶的上下游引物和beta-葡萄糖苷酶的上下游引物分别与pPICZ a用限制性内切酶Not I进行酶切；
[0057]每次酶切完成后，均用T4-DNA连接酶将3个目标基因片段中的每一个都插入pPICZ a中，获得基因重组质粒。
[0058]4、基因重组质粒的筛选与鉴别
[0059]将步骤3获得的基因重组质粒导入大肠杆菌中，在含有25ug/ml博来霉素的低盐LB平板培养基上筛选抗性生长良好的菌落；
[0060]选取5-8个抗性生长良好的单菌落，纯化后提取基因重组质粒；
[0061]测序鉴定基因重组质粒，获得扩增好的基因重组质粒。
[0062]5、基因重组质粒导入酵母表达系统
[0063]将步骤4中获得的基因重组质粒用SacI酶进行线性化后，用电击法将构建好的基因重组质粒导入载体菌株中，获得基因重组酵母菌。
[0064]6、基因重组酵母菌的筛选与鉴别
[0065]电击结束后，立即加入温度为0°C、浓度为lmol/L的山梨醇1ml，非剧烈快速混匀后，吸取25-200ul，涂抹在含100ug/ml博来霉素的YPDS培养皿上，正方I小时后倒置于恒温培养箱中，在30°C 的恒温条件下培养3-5天，直至形成生产良好的阳性单克隆；选取10-20个单菌落在含100ug/ml博来霉素的LB平板培养基上纯化，获得目标菌株。
[0066]7、重组基因表达的诱导
[0067]挑选步骤6中得到的纯化的目标菌株，在Yro培养基中震荡培养过夜；WYro培养基中取IOOul培养液置于BMGY培养基中震荡培养过夜；在41:的恒温条件下，3500g离心IOmin ;去细胞沉淀悬浮于盛有25ml培养液的BMMY培养基中，并加入甲醇，至甲醇的终浓度为0.5%，在30°C的恒温条件下，震荡培养3-4天，诱导目标重组基因表达。
[0068]最后，对重组酵母进行鉴定，具体操作如下:
[0069]将培养物4°C的恒温条件下，3500g离心lOmin，取上清液透析，浓缩后进行SDS_PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)，与阴性对照菌(导入不含插入目标基因片段的pPICZ a质粒)相比，重组工程菌培养上清液多出45-50KD的特异条带。
[0070]同时，将培养物离心得到的细胞沉淀收集，破碎细胞后提取胞内总DNA，利用3个酶基因的特异PCR引物分别做PCR，将产物在100V下进行SDS-PAGE (聚丙烯酰胺凝胶电泳)30min，EB染色后，紫外拍摄，确定重组菌是否出现特异基因扩增的DNA片段。
【权利要求】
1.一种基因重组纤维素分解酵母菌方法，其特征在于:包括如下步骤: (1)纤维素酶基因cDNA模板制备 以里氏木霉或者枯草芽孢杆菌作为供体菌株，将供体菌株中的mRNA通过逆转录获得cDNA ；以获得的cDNA为目标基因I旲板备用； (2)基因克隆片段制备 在NCBI数据库中确定供体菌株的纤维素酶系中的Cx酶、Cl酶和beta-葡萄糖苷酶3个目标基因的cDNA基因片段图谱，并针对基因片段图谱设计PCR反应的上下游引物； 以具有发酵产生酒精能力的酵母菌作为载体菌株，利用PCR反应，将载体菌株所需的3种特定基因表达片段的cDNA克隆，获得目标基因克隆片段； (3)将目标基因克隆片段嵌入载体质粒，构建基因重组质粒 以pPICZ a作为载体质粒，将步骤(2)中所述的3组PCR产物分别与pPICZ a在缓冲液中进行三次酶切，酶切时温度控制在37°C，酶切时间2小时； 每次酶切完成后，均用T4-DNA连接酶将3个目标基因片段中的每一个都插入pPICZ a中，获得基因重组质粒； (4)基因重组质粒的筛选与鉴别 将步骤(3)获得的基因重组质粒导入大肠杆菌中，在含有25ug/ml博来霉素的低盐LB平板培养基上筛选抗性生长良好`的菌落； 选取5-8个抗性生长良好的单菌落，纯化后提取基因重组质粒； 测序鉴定基因重组质粒，获得扩增好的基因重组质粒； (5)基因重组质粒导入酵母表达系统 将步骤(4)中获得的基因重组质粒用SacI酶进行线性化后，用电击法将构建好的基因重组质粒导入载体菌株中，获得基因重组酵母菌； (6)基因重组酵母菌的筛选与鉴别 电击结束后，立即加入温度为0°C、浓度为lmol/L的山梨醇1ml，非剧烈快速混匀后，吸取25-200ul，涂抹在含100ug/ml博来霉素的YPDS培养皿上，正方I小时后倒置于恒温培养箱中，在30°C的恒温条件下培养3-5天，直至形成生产良好的阳性单克隆；选取10-20个单菌落在含100ug/ml博来霉素的LB平板培养基上纯化，获得目标菌株； (7)重组基因表达的诱导 挑选步骤(6)中得到的纯化的目标菌株，在YH)培养基中震荡培养过夜；从YH)培养基中取IOOul培养液置于BMGY培养基中震荡培养过夜；在4°C的恒温条件下，3500g离心-1Omin ;去细胞沉淀悬浮于盛有25ml培养液的BMMY培养基中，并加入甲醇，至甲醇的终浓度为0.5%，在30°C的恒温条件下，震荡培养3-4天，诱导目标重组基因表达。
2.根据权利要求1所述基因重组纤维素分解酵母菌方法，其特征在于:所述载体菌株为毕赤酵母菌GS115。
3.根据权利要求2所述基因重组纤维素分解酵母菌方法，其特征在于:所述PCR反应的上下游引物序列如下: Cx 酶:上游引物 ATGGCGCCCTCAGTTACACT 下游引物 GAITTCCGTAACGCTCATCA Cl 酶:上游引物 ATGTATCGGAAGITGGCCGT下游引物 TTACAGGCACTGAGAGTAGT beta-葡萄糖苷酶:上游引物ATGCGTTACCGAACAGCAGC 下游引物 CTACGCTACCGACAGAGTGCT。
4.根据权利要求3所述基因重组纤维素分解酵母菌方法，其特征在于:步骤(3)中所述的三次酶切中，第一次酶切是Cx酶的上下游引物、Cl酶的上下游引物和beta-葡萄糖苷酶的上下游引物分别与pPICZ a用限制性内切酶Xho I进行酶切；第二次酶切是Cx酶的上下游引物、Cl酶的上下游引物和beta-葡萄糖苷酶的上下游引物分别与pPICZ a用限制性内切酶Xba I进行酶切；第三次酶切是Cx酶的上下游引物、Cl酶的上下游引物和beta-葡萄糖苷酶的上下游引物分别与pPICZ a`用限制性内切酶Not I进行酶切。
【文档编号】C12N1/19GK103773703SQ201210429311
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2012年10月23日 优先权日:2012年10月23日
【发明者】李毅 申请人:贵州爱微生物技术有限责任公司