专利名称：一种植物甾醇-β-D-葡萄糖苷的酶催化制备方法
技术领域：
本发明涉及一种有机相中酶催化合成水溶性植物留醇衍生物的制备方法，特别涉及一种植物留醇-β-D-葡萄糖苷的制备方法。本产品的应用开发涉及到食品、医药、化工和化妆品等技术领域。
背景技术：
植物留醇，又称植物固醇，属于植物性留体化合物，它是植物细胞的重要组成成分，也是一种植物活性成分。植物留醇的以环戊烷全氢菲为骨架，属于4-无甲基留醇，主要存在于坚果，种子，谷物等。植物留醇一般从植物油精炼时的脱臭馏出物中提取，目前国内已有大规模工业化生产。植物留醇主要包括β -谷留醇、豆留醇、菜籽留醇、菜油留醇四种，其中以β_谷甾醇为主。人们发现从膳食中摄入植物留醇越多，胆固醇的吸收率就越低，血清中的胆固醇水平也越低，近年来植物留醇的降胆固醇功能再度引起了人们的兴趣。大量动物试验和人体实验研究证明，补充植物留醇和留烷醇能明显降低血液中总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的含量。这种降低血液中醇的吸收被抑制有关，亦可能源于植物留醇影响了肝/肠胆固醇代谢的其他方面。植物留醇和留烷醇能降低血液中胆固醇的功效已为公认。近年来还发现植物留醇在防治前列腺疾病、抗癌、抗炎、抗病毒、提高免疫力等方面具有重要作用；在化妆品工业中作为乳化剂，目前受到了越来越多的重视。植物留醇-β -D-葡萄糖苷是植物留醇的衍生物，广泛存在于许多植物(包括水果和蔬菜)中。更值得关注的是，植物留醇-β-D-葡萄糖苷还存在于许多药材中，如人参、刺五加、胡萝卜籽等。植物留醇-D-葡萄糖苷能明显提高巨噬细胞吞噬能力和体液免疫和细胞免疫活性，所以具有消炎、退热、抗肿瘤和调节免疫等功效。植物留醇-β -D-葡萄糖苷可以改善植物留醇的水溶性。到目前为止，合成植物甾醇- β -D-葡萄糖苷的方法只有化学法，合成工艺主要有以下专利；CN1235907C公开了一种植物甾醇-β -D-葡萄糖苷或/和植物甾烷醇-β -D-葡萄糖苷的制备方法。该法首先将植物留醇或/和植物留烷醇粗品进行重结晶纯化得到晶体；再将该晶体与多取代-D-葡萄糖三氯乙烯亚胺酯在路易氏酸催化剂存在下进行糖苷化反应，在脱去保护基生成植物留醇- β -D-葡萄糖苷或/和植物留烷醇_β -D-葡萄糖苷类化合物。该技术方案需要三步才能完成，操作复杂且反应条件苛刻。如何简化操作，优化工艺及提高产品安全性是一个需要迫切解决的问题。
发明内容
本发明是提供一种用生物酶催化生成植物留醇-D-葡萄糖苷的制备方法。本方法工艺简单，成本较低，收率高，合成途径简便、绿色，适合用于食品等工业生产。本发明采用以下技术方案将一定量的植物留醇与葡萄糖在酶的作用下反应生成水溶性植物留醇衍生物，将制得的水溶性植物留醇衍生物经柱层析分离纯化后得到植物留醇_β-D-葡萄糖苷； 将植物甾醇与葡萄糖在酶催化的作用下反应；所述酶催化的体系为酶用量为底物用量的O.5% 20% (w/w)，植物甾醇与葡萄糖的摩尔比为I : O. 5 I : 4，底物质量与溶剂体积之比为I : 5 I : 15 (g/mL)，缓冲液的体积为溶剂体积的5% 25%，反应温度为40°C 65°C，振荡速度为50rpm 600rpm，反应时间为12h 140h，缓冲溶液的pH值为3. O 6. O。
所述植物留醇为豆留醇、β-谷留醇、菜油留醇和菜籽留醇中的一种或一种以上任意比例的混合植物甾醇。
所述的糖苷酶类催化剂，糖苷酶类催化剂包括游离糖苷酶及固定化糖苷酶；所述游离糖苷酶为葡萄糖苷酶、果胶酶和淀粉酶中的一种，来源于杏仁、根霉、细菌、木霉、黑曲霉、米曲霉中的一种或几种；上述固定化糖苷酶为上述来源糖苷酶的固定化形式。
所述的糖苷化反应中所用溶剂为N-N 二甲基酰胺、二氧六环、四氢呋喃、乙腈、丙酮、叔丁醇、二甲亚砜中的一种或一种以上任意比例的混合物，其中优选丙酮。
所述的糖苷化反应中所用缓冲液为醋酸盐标准缓冲溶液、磷酸盐标准缓冲溶液和柠檬酸盐标准缓冲溶液。
所述的酶用量为底物用量的O. 5% 20% (w/w)，优选I % 15% (w/w)。
所述的植物甾醇与葡萄糖的摩尔比为I : O. 5 I : 4，优选I : I I : 3;所述的底物质量与溶剂体积之比为I : 5 I : 15(g/mL)，优选I : 9 I : 12(g/mL);所述的缓冲液的体积为溶剂体积5% 25%，优选10% 20% ;反应温度为40°C 65°C，优选45°C 60°C ;反应时间为12h 140h，优选24h 120h。
所述的植物留醇-D-葡萄糖苷的制备方法，其特征在于所述的反应仪器振荡速度为 50rpm 600rpm,优选 IOOrpm 300rpm。
所述的植物留醇_β-D-葡萄糖苷的制备方法，其特征在于所述的柱层析为硅胶柱层析，洗脱剂为石油醚、乙酸乙酯、环己烷、无水乙醚中的一种或几种溶剂的混合物。
本发明中所述的实时反应进程监测方法为薄层色谱层析。
本发明中酯化程度采用高效液相色谱测量，其HPLC分析条件Symmetry C18 柱(4. 6 X 250mm, 5 μ m),柱温35°C,流动相甲醇，流速0. 8mL/min,等速洗脱，进样量 10 μ L ;蒸发光散射检测器ELSD条件载气为N2，流速1. 5L/min，漂移管温度55°C。
本发明的有益效果
I.本发明首次合成了一种植物留醇-D-葡萄糖苷，即水溶性植物留醇衍生物， 极大地拓宽了植物甾醇的应用范围。
2.本发明采用酶法反应，产品安全性高；通过添加缓冲液可以控制反应体系的水分活度，有助于提高转化率。
3.工艺简单，对反应条件要求较低，易实现工业化生产。
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明所保护的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例I :
称取谷甾醇2. 50g,葡萄糖I. 08g于50mL反应瓶中，添加27mL丙酮、3mL pH5. 5的醋酸盐缓冲液作为溶剂，密闭，置于水浴振荡器，在温度50°C下预混合30min，添加谷甾醇和葡萄糖总质量5%的来源于杏仁的游离β-葡萄糖苷酶，控制转速150rpm，反应温度500C，每隔12小时取样检测反应进程，反应72小时；经高效液相色谱分析，反应液中谷甾醇葡萄糖苷的含量为46%;经柱层析分离纯化得纯度大于95%的水溶性谷留醇衍生物-谷甾醇葡萄糖苷。实施例2 称取谷甾醇2. 50g,葡萄糖I. 08g于50mL反应瓶中，添加25mL乙腈、2. 5mL pH5. O的磷酸盐缓冲液作为溶剂，密闭，置于水浴振荡器，在温度60°C下预混合30min，添加谷甾醇和葡萄糖总质量8 %的来源于米曲霉的游离β -葡萄糖苷酶，控制转速150rpm，反应温度60°C，每隔12小时取样检测反应进程，反应84小时经高效液相色谱分析，反应液中谷甾醇葡萄糖苷的含量为45%;经柱层析分离纯化得纯度大于95%的水溶性谷留醇衍生物-谷甾醇葡萄糖苷。
实施例3 称取植物甾醇1.68g，葡萄糖1.44g于IOOmL反应瓶中，添加34mLl，4_ 二氧六环、4mLpH6. O的柠檬酸盐缓冲液作为溶剂，密闭，置于水浴振荡器，在温度55°C下预混合30min，添加植物留醇和葡萄糖总质量5%的来源于木霉的游离β -葡萄糖苷酶，控制转速180rpm，反应温度55°C，每隔12小时取样检测反应进程，反应72小时经高效液相色谱分析，反应液中谷留醇葡萄糖苷的含量为50% ;经柱层析分离纯化得纯度大于95%的水溶性谷甾醇衍生物-谷留醇葡萄糖苷。实施例4:称取谷甾醇3. 12g,葡萄糖I. 35g于IOOmL反应瓶中，添加45mL 二甲亚砜、6mLpH5. O的磷酸盐缓冲液作为溶剂，密闭，置于水浴振荡器，在温度50°C下预混合30min，添加反应体系的5%的来源于细菌的游离中温淀粉酶，控制转速150rpm，反应温度50°C，每隔12小时取样检测反应进程，反应72小时。经高效液相色谱分析，反应液中谷留醇葡萄糖苷的含量为47 % ;经柱层析分离纯化得纯度大于95 %的水溶性谷留醇衍生物-谷留醇葡萄糖苷。实施例5 称取谷甾醇3. 74g,葡萄糖I. 08g于50mL反应瓶中，添加27mL叔丁醇、3. 4mLpH6. O的醋酸盐缓冲液作为溶剂，密闭，置于水浴振荡器，在温度50°C下预混合30min，添加谷甾醇和葡萄糖总质量10%的来源于黑曲霉的游离β_葡萄糖苷酶，控制转速170rpm，反应温度50°C，每隔12小时取样检测反应进程，反应72小时经高效液相色谱分析，反应液中谷留醇葡萄糖苷的含量为48%;经柱层析分离纯化得纯度大于95%的水溶性谷留醇衍生物-谷留醇葡萄糖苷。实施例子6 分别称取谷甾醇3. 74g和葡萄糖I. 08g于9只50mL反应瓶中，添加27mL叔丁醇，并分别加入 I. 4mL、2. OmL,2. 7mL、3. 4mL、4. OmL,4. 7mL、5. 4mL、6. ImL 和 6. 8mL pH6. 0 的醋酸盐缓冲液作为溶剂，在温度50°C下预混合30min，添加谷留醇和葡萄糖总质量5%的来源于杏仁的游离β -葡萄糖苷酶，测定反应体系的水分活度，结果表明添加的缓冲液越多水分活度就越大。将这些反应瓶置于水浴恒温振荡仪中，控制转速150rpm，反应温度50°C，反应72小时；经高效液相色谱分析，当添加缓冲液为3. 4mL时，转化率最高，其反应液中谷甾醇葡萄糖苷的含量为50%。
权利要求
1.一种植物留醇-β-D-葡萄糖苷的酶催化制备方法，其特征在于将植物留醇与葡萄糖在酶催化的作用下反应；所述酶催化的体系为酶用量为底物质量的O. 5% 20%，植物甾醇与葡萄糖的摩尔比为I : O. 5 I : 4，底物质量与溶剂体积之比为I : 5 I : 15，缓冲液体积为溶剂体积的5% 25%，反应温度为40°C 65°C，振荡速度为50rpm 600rpm， 反应时间为12h 140h，缓冲溶液的pH值为3. O 6. O。
2.权利要求I所述的方法，其特征在于具体步骤为称取植物留醇与葡萄糖的摩尔比为I : 3的底物于反应瓶中，添加体积与底物质量比为10 I的丙酮作为溶剂，加入12% 溶剂体积的PH6. O的柠檬酸盐缓冲液，密闭，置于水浴振荡器，在温度55°C下预混合30min， 添加植物留醇和葡萄糖总质量5%的糖苷酶类催化剂，控制转速ISOrpm，反应温度55°C，反应72小时经柱层析分离纯化得纯度大于95%的水溶性谷留醇衍生物-谷留醇葡萄糖苷。
3.权利要求I所述的方法，其特征在于所述缓冲液为醋酸盐标准缓冲溶液、磷酸盐标准缓冲溶液或柠檬酸盐标准缓冲溶液。
4.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于所述的植物留醇为豆留醇、β-谷甾醇、菜油留醇和菜籽留醇中的一种或一种以上任意比例的混合植物甾醇。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述糖苷酶包括游离糖苷酶及固定化糖苷酶。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述游离糖苷酶为葡萄糖苷酶、果胶酶和淀粉酶中的一种，来源于杏仁、根霉、细菌、木霉、黑曲霉、米曲霉中的一种或几种。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述固定化糖苷酶为上述来源糖苷酶的固定化形式。
8.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述溶剂为N-N二甲基酰胺、二氧六环、四氢呋喃、乙腈、丙酮、叔丁醇、二甲亚砜中的一种或一种以上任意比例的混合物。
9.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述溶剂为丙酮。
全文摘要
本发明涉及一种植物甾醇-β-D-葡萄糖苷的酶催化制备方法，将一定量的植物甾醇在生物催化剂的作用下与葡萄糖反应生成植物甾醇糖苷，经柱层析分离纯化得植物甾醇-β-D-葡萄糖苷。通过控制催化工艺及反应条件，可获得较高转化率。本发明工艺高效，操作简单，且大大提高了产品安全性，克服了以为那个操作复杂、反应条件苛刻的缺陷，具有广阔的应用前景。
文档编号C12P33/20GK102936613SQ201210474088
公开日2013年2月20日 申请日期2012年11月20日 优先权日2012年11月20日
发明者贾承胜, 郭素洁, 任明星, 张晓鸣, 冯骉 申请人:江南大学