专利名称：一种耐高糖的β-葡萄糖苷酶Bgl4及其表达基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程及酶工程技术领域，具体涉及对黑曲霉来源的新型耐高糖^ -葡萄糖苷酶Bgl4基因克隆和重组表达及应用。
背景技术：
P -葡萄糖苷酶(P-glucosidase, EC 3. 2.1. 21)属于外切水解酶类，又称3-D-葡萄糖苷水解酶，是ー类在亲核分子间催化转移糖苷的酶，可以在短链的寡糖或纤维ニ糖内部、在带有芳香基团或烷基的碳水化合物的残基之间打断￠-1,4-糖苷键，因而被广泛应用纤维素水解等领域(Science 311:484-489.)。纤维素作为绿色植物光合作用所产生的主要生物有机体之一，与半纤维素和木质素一起作为植物的支撑组织随着农林废弃物不断再生，是地球上最丰富的可再生能源。在纤维素水解过程中，3 -葡萄糖苷酶通常不与纤维素直接作用，但是它可以降解对纤维素水解起強烈抑制作用的纤维ニ糖，同时随着水解液中葡萄糖含量的増加，同样也会对￠-葡萄糖苷酶产生強烈的抑制作用。所以发掘具有高葡萄糖耐受能力3-葡萄糖苷酶补充到现有的纤维素水解酶系中是提高酶解效率的有效方法之一。^ -葡萄糖苷酶来源相当广泛，在植物、动物和微生物都能分离纯化出来，而其中曲霉属被认为是最优良菌种，尤以黑曲霉的产量最高。大部分曲霉属菌株能分泌多种组分的3 -葡萄糖苷酶，其酶学性质也各不相同，如A. tubingensis通过不同的培养条件至少有4种￠-葡萄糖苷酶被纯化和定性。按照￠-葡萄糖苷酶对葡萄糖的耐受カ分类，￠-葡萄糖苷酶可分为耐高糖和不耐高糖两种，分别为(a)分子量为130_100kDa的属于水解酶家族3的3 -葡萄糖苷酶，其分泌较多，活性较高，但其活性受葡萄糖抑制(耐葡萄糖的系数Ki一般不超过30mM) ； (b)另ー种分子量为40-55kDa的P -葡萄糖苷酶，其分泌较少，活性较低，但能耐受高浓度的葡萄糖，比如来源于A.niger CCRC31494的分子量为49kDa的￠-葡萄糖苷酶，其耐葡萄糖的K i为543mM，来源于A. oryzae的分子量为43kDa的P -葡萄糖苷酶，其耐葡萄糖的 Ki 为 1360mM (Applied Environmemt Microbiology,64:3607-3614.)。虽然有曲霉来源的耐高糖的3 -葡萄糖苷酶被纯化，但是相关的基因还没有文献报道。本发明从黑曲霉菌株(Aspergillus, niger)发酵液中分离得到ー种新型的耐高糖的葡萄糖苷酶，且具有极其优良的葡萄糖耐受能力(Ki值达到2mol/L)，完全可以满足在现有的纤维素降解体系中对3 -葡萄糖苷酶葡萄糖耐受能力的要求，经过蛋白纯化和蛋白质测序，得到了其N端序列，经过氨基酸序列比对发现其属于GH72家族，至今未有报道发现该家族存在能够水解￠-1,4-糖苷键的￠-葡萄糖苷酶。
发明内容
解决的技术问题本发明主要解决的技术问题在于现在纤维素降解技术中P -葡萄糖昔酶无法耐受闻浓度匍萄糖的从而造成生广成本提闻的问题，进而提供一种耐闻糖的^ -葡萄糖苷酶Bgl4及其表达基因和应用。
技术方案一种耐高糖的P -葡萄糖苷酶Bgl4，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述耐高糖的P -葡萄糖苷酶Bgl4的表达基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所
/Jn o包含上述核苷酸序列的重组质粒。包含上述核苷酸序列的重组质粒pPICZ a A_Bgl4。包含SEQ ID NO. 2所述基因序列的重组质粒的制备方法，步骤为(I)设计引物Pl和P2,以黑曲霉菌株Aspergillus niger的mRNA反转录的cDNA为模板，以Pl和P2为引物进行PCR扩增，得到耐高糖P -葡萄糖苷酶Bgl4基因的PCR扩增产物，所述引物为Pl :5’ -CCGGAATTCATGAAGGGCACCGCTGTCG-3’,下划线表示 EcoR I 位点；P2 :5’ -GCTCTAGATTACAACAGGACGAGTCCGGCA-3，,下划线表示 Xba I 位点；(2)将步骤(I)所得PCR扩增产物与pMD-19T克隆载体在16°C下过夜连接；将连接产物转化大肠杆菌ToplOF’感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有耐高糖P -葡萄糖苷酶基因的重组质粒pMD-19T-Bgl4 ；(3)通过对Bgl4全序列翻译得到的蛋白序列进行预测并去除信号肽，设计去信号肽引物 P3 :5’-CCGGAATTCGCGCCTTCGTCGACCATCAAG-3，,下划线表示 EcoR I 位点，以 P3 和 P2为引物，模板为pMD-19T-Bgl4进行PCR扩增，得到去除信号肽的Bgl4基因片段；(4)将步骤(3)所得的PCR扩增产物和pPICZ a A分别用EcoR I和Xba I双酶切，并分别割胶回收，过夜连接；将连接产物转化大肠杆菌ToplOF’感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得耐高糖￠-葡萄糖苷酶基因的重组质粒 pPICZaA_Bgl4。包含上述的重组质粒的毕赤酵母宿主细胞。包含重组质粒pPICZ a A-Bgl4的重组毕赤酵母表达重组酶，将重组质粒pPICZ a A-Bgl4通过Bin I线性化之后电击转化到毕赤酵母宿主菌GSl 15中通过添加有不同浓度梯度博莱霉素的YPD平板来筛选出多拷贝的转化子，使用BMGY培养基培养，再转移到BMMY培养基中以每24h添加0. 5%wt的甲醇进行诱导表达，收集上清液即为耐高糖P -葡萄糖苷酶Bgl4的酶液。所述耐高糖的P -葡萄糖苷酶Bgl4在纤维素降解中的应用。具体方案内容为包括相关基因的克隆、基因的重组表达和酶的定性。1.对得到的黑曲霉菌株(Aspergillus, niger)耐高糖P _葡萄糖苷酶的蛋白进行N端测序，再用测出的N端序列在NCBI数据库中黑曲霉菌株(Aspergillus, niger)全基因组数据库中比对得到其基因序列，根据得到的基因序列设计引物，以黑曲霉菌株(Aspergillus, niger)的 cDNA 为模板进行 PCR,获得黑曲霉菌株(Aspergillus, niger)耐高糖P-葡萄糖苷酶的全基因序列；2.对得到的全基因序列进行分析，通过设计引物去除信号肽，并克隆到酵母的表达载体pPICZ a A,得到重组质粒pPICZ a A-Bgl4 ；3.将重组质粒pPICZaA_Bgl4通过Bin I线性化之后电击转化到毕赤酵母宿主菌GS115中通过添加有不同浓度梯度博莱霉素的YPD平板来筛选出多拷贝的转化子，使用BMGY培养基培养，再转移到BMMY培养基中以每24h添加0. 5%的甲醇进行诱导表达，收集上清液即为耐高糖3-葡萄糖苷酶的酶液。有益效果本发明首次克隆并重组表达了黑曲霉菌株(Aspergillus, niger)耐高糖￠-葡萄糖苷酶Bgl4的基因，重组酶Bgl4的耐葡萄糖系数Ki为2mol/L。
图1表示重组耐高糖P -葡萄糖苷酶Bgl4最适反应pH值；图2表示重组耐高糖P -葡萄糖苷酶Bgl4最适反应温度；图3表示重组耐高糖P -葡萄糖苷酶Bgl4的Ki系数。
具体实施例方式下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。本发明的实施例中所用到的材料包括大肠杆菌(Escherichia coli) ToplOF’ ；pMD_19T克隆载体试剂盒，限制性内切酶、修饰酶、连接酶等(购自Takara公司)；pPICZ a Avector (购自Invitrogen公司)、p-NPG购自Sigma公司。实施例1.黑曲霉菌株(Aspergillus niger)总RNA的获得1.1 黑曲霉菌株(Aspergillus niger)的培养黑曲霉菌株(Aspergillus niger)可以从自然界中筛选获得，也可以从商业途径购买得到(例如可以购自中国エ业微生物菌种保藏管理中心)。黑曲霉菌株(Asp ergillus, niger)的培养基配方为葡萄糖30g/L、K2HPO4 3H20lg/L，KCl 0. 5g/L，MgSO4O. 5g/L，FeSO4O. Olg/L, NaNO3O. 2g/L，pH 调至 4. 8，接种新鲜的黑曲霉孢子悬液，37°C下180rpm培养3_4天过滤收集菌丝体。1. 2 黑曲霉菌株(Aspergillus niger)总 RNA 的提取取收集的黑曲霉菌株(Aspergillus, niger)的菌丝体用PBS缓冲溶液清洗一次后，用在液氮下研磨菌丝体至粉末状，收集到2mL离心管中，加入ImL Trizol后剧烈震荡，4°C下12000g离心IOmin后转移上清液至2mL离心管加入200 u L氯仿震荡15s混匀后30°C下孵育2-3min，4°C下12000g离心IOmin取上层清夜，加入0. 8倍体积异丙醇混匀后4°C下12000g离心lOmin，去净上清后用75%wtこ醇水溶液(DEPC处理过的，去除了 mRNA酶)清洗2次后4°C下7500g离心5min得到沉淀，使其自然干燥后，加入适量DEPC水溶解RNA沉淀，作为模板RNA，-20°C下保存。实施例2. P -葡萄糖苷酶Bgl4编码基因的克隆1.1 黑曲霉(Aspergillus, niger) cDNA 的获得以黑曲霉Aspergillus niger菌株总RNA为模板,利用逆转录合成cDNA第一链(以下各逆转录所用试剂均来自于试剂盒“PrimeScriptTMlstStrand cDNA Synthesis Kit”，购自Takara公司)。在微量离心管中配制下列模板RNA/Primer反应液50 U M Oligo dTIuL,IOmM dNTP MixtureIuL,
总RNAI U g,DEPC-H2O7u L ；混勻后65°C下保温5min后冰上放置Imin在上述微量离心管中配制下列cDNA合成反应液上述RNA/Primer 混合液10 U L,5XPrimeScript Buffer4 U L,40U/u L RNase Inhibiter0. 5 U L,200U/ u L PrimeScript RTase IuLRNase free H2O4. 5 U L;上述反应液混勻后在50°C下保温lh,70°C下保温15min后冰上冷却,得到的反应液立即用于cDNA第二链的合成。2.2^-葡萄糖苷酶Bgl4基因的引物设计及克隆
对黑曲霉(Aspergillus, niger)进行发酵培养(发酵培养基为葡萄糖IOg/L,纤维素 ニ 糖 10g/L，K2HPO4 3H20 lg/L, KCl 0. 5g/L，MgSO4O. 5g/L，FeSO4O. Olg/L,NaNO3O. 2g/L, pH调至4. 8)，37 °C下180rpm培养3_4天。80%wt的硫酸铵沉淀上清液，获得粗酶液，透析后用膜过滤(50kDa的孔径)和DEAE阴离子柱层析(洗脱条件为7. 5Tris缓冲，NaCl的浓度梯度为0-0. 5mol/L,体积为500mL)进行纯化，得到原始耐高糖P -葡萄糖苷酶的纯酶，将获得的纯酶进行蛋白N端测序(上海基康生物技术有限公司)。将得到的N端序列(-VIAITVKGNAF-)在已经全基因组测序的黑曲霉(Aspergillus, niger) CBS513. 88蛋白数据库中进行比对，得到相似度最高的蛋白，获得该蛋白的基因序列(序列号XM_001402396. 2)，以该蛋白的基因序列为模板设计引物Pl和P2，引物Pl :5’ -CCGGAATTCATGAAGGGCACCGCTGTCG-3，，下划线表示 EcoR I 位点。引物 P2 :5’-GCTCTAGATTACAACAGGACGAGTCCGGCA-3’，下划线表示XbaI位点，以cDNA第一链为模板，以Pl，P2，为上下游引物扩增Bgl4基因片段,使用Ex Taq聚合酶(购自Takara公司)以推荐比例配制50 ii L反应液进行片段扩増，PCR反应条件是94°C，5min ;暂停计时，加Ex Taq聚合酶，加40 y L石蜡油密封；35 次循环(94°C，50s ;58°C，90s ；72°C, 90s) ；72°C, IOmin ;反应停止，4°C保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化。得到黑曲霉(Aspergillus, niger)耐高糖P -葡萄糖苷酶Bgl4基因序列，如SEQ ID NO. 2所示。回收的片段与pMD_19T simple载体连接,产物转化到大肠杆菌E. coli ToplOF’中，转化产物涂布于蓝白斑筛选平板，37°C过夜培养，接种单菌落到LB(添加氨苄青霉素至终浓度100mg/L)液体培养基中培养8-10h后，提取质粒进行序列測定，得到重组质粒pMD-19T-Bgl4。实施例3. P -葡萄糖苷酶Bgl4表达载体的构建及表达3.1 P -葡萄糖苷酶Bgl4表达载体的构建使用的表达载体质粒是pPICZ a A，带有a-Factor信号肽，所以需要去除原基因的信号肽，因此对获得的基因Bgl4翻译的蛋白质序列进行信号肽预测，预测程序采用在线程序 SingalP4. 0 (http: //www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/)进行，获得耐高糖 3 _ 葡萄糖苷酶Bgl4的信号肽，根据该预测结果设计去除信号肽引物P3 :5，-CCGGAATTCGCGCCTTCGTCGACCATCAAG-3’，下划线表示EcoR I位点，与引物P2以pMD_19T_Bgl4为模板扩增去除信号肽的Bgl4片段，PCR反应条件是94°C，5min ;暂停计时，加Ex Taq聚合酶，加40 y L石蜡油密封;35 次循环(94°C，50s ；58°C,90s ；72°C,90s) ；72°C, IOmin ;反应停止，4°C保温。，将pPICZ a A质粒和扩增片段分被使用EcoR I和Xba I酶切，割胶回收，再用T4连接酶16°C连接过夜，连接产物转化到大肠杆菌E. coli ToplOF’中，转化产物涂布到LB (添加博莱霉素至终浓度25mg/L)固体培养基上37°C过夜培养，接种几个单菌落到LB (添加博莱霉素至终浓度25mg/L)液体培养基中培养8-10小时后，收集菌体提取质粒，酶切验证去除空载质粒，将重组质粒进行核酸序列測定，得到正确的重组表达载体pPICZ a A-Bgl4，将含有该重组质粒的转化子接种到30mL LB (添加博莱霉素至终浓度25mg/L)液体体培养基，培养8_10小时后提取质粒，得到大量重组质粒pPICZ a A-Bgl4。3. 2 P -葡萄糖苷酶Bgl4表达载体的转化及筛选取重组质粒pPICZ a A_Bgl4 42 U L, IOXK buffer 5u L,Bln I 3^1し混匀后37で酶切3h后电泳回收目的基因条带，浓缩后溶于IOy L无菌水中，得到线性化的重组质粒。将约4 ii g的线性化重组质粒加入80 ii L毕赤酵母GSl 15的感受态细胞中(感受态制备按照毕赤酵母表达手册操作)，混匀后转移至电转杯中，调整电击的參数(按照毕赤酵母表达手册操作)，电击转化，加入lmol/L的预冷山梨醇溶液，转化液于30°C放置Ih后，涂布于YPDS平板(添加博莱霉素至终浓度100mg/L)，30°C培养直至长出单菌落，获得了含有基因Bgl4的重组毕赤酵母。3. 3 P -葡萄糖苷酶重组基因工程菌pPICZ a A_Bgl4/GS115的表达将重组酵母菌划线于YH)平板上进行活化，28°C培养2d，至长出单菌落后接种于IOmLBMGY液体培养基中，于28°C，180rpm摇床培养24h，至0D600=2_6，3000rpm离心5min收集菌体，弃上清，用无菌纯净水洗涤菌体1-2次。将菌体用BMMY诱导培养基稀释至0D600=1，用4层纱布代替棉花塞，于28°C，ISOrpm摇床培养。每天补加甲醇至终浓度为0. 5%(v/v)，姆隔24h从BMMY培养基中取出ImL菌液于1. 5mL离心管中，3000rpm离心5min,取上清液用于酶活检测和蛋白分析。实施例4.重组P -葡萄糖苷酶的酶学性质4.1酶活测定方法反应体系100 ii L，5 ii L 20mmol/L对硝基苯P -D葡萄糖苷(pNPG)中加入85 y LlOOmmol/L柠檬酸-磷酸氢ニ钠缓冲液(pH 6. 0)，先在50°C孵育5min，再加入10 y L酶液反应IOmin,显色后再加入lmol/L的碳酸钠溶液600 u L终止反应。在405nm下测定吸光值。酶活力単位(U)定义为在測定条件下，毎分钟产生Iumol P-硝基苯酚所用的酶量为I个酶活力単位。4. 2最适反应温度的测定在35-80°C范围内，每隔5°C，分别測定酶活。缓冲为lOOmmol/L柠檬酸-磷酸氢ニ钠缓冲液，PH 6.0，发现重组耐高糖￠-葡萄糖苷酶的最适反应温度为50°C，如图2。4. 3最适反应pH在不同的pH (4. 0-8. 2，IOOmmoI/L柠檬酸-磷酸氢ニ钠缓冲液)条件下，50°C分别測定酶活，发现重组耐高糖￠-葡萄糖苷酶的最适反应PH为6.0，如图1。
4. 4重组耐高糖P -葡萄糖苷酶的耐糖系数测定不同浓度的葡萄糖浓度(0mmol/L,I OOmmol /L, 200mmol /L, 400mmol /L,600mmol/L, 8OOmmoI/L, IOOOmmol/L, 1200mmol/L, 1 400mmo1 /丨,、1 BOOmmol /丨,、1800mmo1 /T,.2000mmol/L)对重组耐高糖P -葡萄糖苷酶Bgl4酶活的影响，发现重组耐高糖P -葡萄糖苷酶在2000mM葡 萄糖浓度下与对照相比仍具有48. 5%的酶活力，对葡萄糖的耐糖系数Ki约为 2000mmol/L，如图 3。
权利要求
1.一种耐高糖的β-葡萄糖苷酶Bgl4，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述耐高糖的葡萄糖苷酶Bgl4的表达基因，其核苷酸序列如SEQID NO. 2所示。
3.包含权利要求2所述核苷酸序列的重组质粒。
4.包含权利要求2所述核苷酸序列的重组质粒pPICZa A-Bgl4。
5.包含SEQID NO. 2所述基因序列的重组质粒的制备方法，其特征在于(1)设计引物Pl和P2,以黑曲霉菌株(Aspergillus,niger)的mRNA反转录的cDNA为模板，以Pl和P2为引物进行PCR扩增，得到耐高糖β -葡萄糖苷酶Bgl4基因的PCR扩增产物，所述引物为Pl :5’ -CCGGAATTCATGAAGGGCACCGCTGTCG-3’,下划线表示 EcoR I 位点；P2 :5’ -GCTCTAGATTACAACAGGACGAGTCCGGCA-3’,下划线表示 Xba I 位点；(2)将步骤(I)所得PCR扩增产物与pMD-19T克隆载体在16°C下过夜连接；将连接产物转化大肠杆菌ToplOF’感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有耐高糖β -葡萄糖苷酶基因的重组质粒pMD-19T-Bgl4 ；(3)通过对Bgl4全序列翻译得到的蛋白序列进行预测并去除信号肽，设计去信号肽引物 P3 :5’ -CCGGAATTCGCGCCTTCGTCGACCATCAAG-3，,下划线表示 EcoR I 位点，以 P3 和 P2 为引物，模板为pMD-19T-Bgl4进行PCR扩增，得到去除信号肽的Bgl4基因片段；(4)将步骤(3)所得的PCR扩增产物和pPICZa A分别用EcoR I和Xba I双酶切，并分别割胶回收，过夜连接；将连接产物转化大肠杆菌ToplOF’感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得耐闻糖β _匍萄糖昔酶基因的重组质粒 pPICZa A-Bgl40
6.包含权利要求4所述的重组质粒的毕赤酵母宿主细胞。
7.权利要求1所述耐高糖的葡萄糖苷酶Bgl4在纤维素降解中的应用。
全文摘要
一种耐高糖的β-葡萄糖苷酶Bgl4及其表达基因和应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明首次克隆并重组表达了黑曲霉菌株(Aspergillusniger)耐高糖β-葡萄糖苷酶Bgl4的基因，重组酶Bgl4的耐葡萄糖系数Ki为2mol/L。
文档编号C12N15/56GK103031290SQ20121054129
公开日2013年4月10日 申请日期2012年12月14日 优先权日2012年12月14日
发明者赵林果, 谢静聪, 裴建军, 王飞, 庞倩 申请人:南京林业大学