体外培养杀伤性t细胞的方法

专利名称：体外培养杀伤性t细胞的方法
技术领域：
本发明涉及体外培养杀伤性T细胞的方法。更具体地，本发明涉及利用IL-2、抗CD3单克隆抗体和大青叶水煎剂体外联合诱导刺激培养人细胞毒性T细胞的方法。
背景技术：
以肿瘤的免疫治疗为基础的肿瘤生物治疗作为现代肿瘤治疗的第四种模式，越来越受到重视。肿瘤的免疫治疗包括主动特异性免疫治疗(肿瘤疫苗)和被动免疫治疗，其中被动免疫治疗包括细胞因子疗法(白介素、干扰素、肿瘤坏死因子等)、抗体为基础的被动免疫治疗、过继性细胞免疫治疗(如LAK、TIL、CIK等)以及基因治疗。而其中过继性细胞免疫 治疗(adoptive cellular immunotherapy,ACI)是指向肿瘤患者转输具有抗肿瘤活性的免疫细胞(特异性的和相对特异性的)直接杀伤肿瘤或激发机体免疫反应杀伤肿瘤细胞，达到治疗肿瘤的目的。过继性细胞免疫治疗可以单独用于临床治疗肿瘤患者，更重要的是可以作为手术、放疗、化疗的补充，与上述三种疗法联合应用，提高疗效和改善患者生存质量。因此，ACI近年来一直是肿瘤生物治疗中最活跃的研究领域。自1985年Rosenberg报道应用LAK/IL-2治疗晚期恶性肿瘤以来，ACI研究进入了高潮，新的免疫效应细胞如肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、抗⑶3抗体激活的杀伤细胞(⑶3AK)、多种细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)不断被发现和应用，细胞体外扩增技术和免疫效应细胞杀伤活性的调变方面也有了较大的发展，使得ACI的临床应用在国内外得以广泛开展并取得了较好的疗效。相关文献已有活化的T细胞的培养方法，包括CIK、CTL、LAK细胞培养的报道。但LAK细胞T细胞增殖数量有限，杀伤功能不高。CTL作为特异性细胞毒性T细胞，培养时需用肿瘤组织诱导，使培养受到限制。CIK细胞培养需4种因子联合刺激，操作步骤较多，试剂成本高。本发明的目的是解决上述技术的不足，开发一种提取操作简单、细胞成熟时间短、细胞杀伤功能强的T细胞的培养方法，为肿瘤免疫治疗的广泛推广奠定基础。

发明内容
因此，本发明的技术目的在于探索新的步骤更简便的人细胞毒性T细胞的诱导培
养方法。因此，本发明的第一方面涉及一种培养人细胞毒性T细胞的方法，其包括如下步骤a)获得无菌人全血50_100ml ；b)用PBS按照1:1比例稀释上述人全血，在塑料离心管中预先加入Ficol1-Hypaque淋巴细胞分离液，按分离液稀释后血液=1 :1 5的比例将稀释后的血液加到Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液的上面；c)室温下1800rpm离心10 30min后弃上清，重悬入40ml PBS中，混勻；再室温下1300rpm离心8min ;弃上清，再重悬入40ml PBS中，混匀；再室温下1300rpm离心5min ；d)弃上清，细胞沉淀用培养基RPM1-1640悬起，计数淋巴细胞数量；e)按2 X IO6个细胞/ml的密度将所分离的细胞悬于RPM1-1640无血清培养液中，悬浮培养于25cm2小培养瓶中，每小瓶细胞中加入终浓度500U/ml的IL-2 ；f)第二天或第三天，每瓶培养细胞中加入终浓度50ng/ml的抗⑶3单克隆抗体；g)第五天或第六天，每瓶培养的细胞按1:3比例传代于75cm2中培养瓶，并加入终浓度为O. 4 1. 6mg/ml的FS ；h)第八天至第十天，细胞数量可增殖到用于临床治疗的水平， 其中FS是指大青叶水煎剂。优选地,无菌人全血的体积为50ml。优选地，按分离液稀释后血液=1 2的比例将稀释后的血液加到Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液的上面，室温下1800rpm离心20min分离单个核细胞。优选地，培养当日培养基中加入终浓度500U/ml的IL-2，次日加入50ng/ml抗CD3单克隆抗体，第5日加入O. 4 1. 6mg/ml的FS。更优选地，第5日加入lmg/ml的FS。优选地，所述FS的制备方法为取适量大青叶干药材，冷水浸泡20-30分钟，3次水煎混合液浓缩至约lg/ml，离心取上清液以6°C0照射灭菌。优选地,步骤a)的无菌人全血为50ml。优选地，所述PBS 为 O. 01M、ρΗ7· 2 的 PBS。优选地，所述IL-2为重组人IL-2，所述抗⑶3单克隆抗体为鼠抗人⑶3单克隆抗体。优选地，培养至第八天至第十天时回收细胞加入1%人血清白蛋白。换言之，本发明涉及一种高增殖力、高细胞毒活性的T细胞的制备方法，它比以往研究的CIK细胞培养步骤简单、试剂成本低，但能达到与CIK细胞同等效力的细胞功能。换言之，本发明涉及一种改进的体外获取杀伤性T细胞的方法，其步骤可简述如下采集外周血50ml并用PBSl:1稀释，用淋巴细胞分离液密度梯度离心，提取单个核细胞并用PBS洗涤，用含500U/ml IL-2的无血清培养基在37°C、5% CO2浓度下培养，次日，在培养液中加入终浓度为50ng/ml抗⑶3单克隆抗体，继续培养，第5天，T细胞增殖后1:3分瓶并在每瓶培养液中加入终浓度O. 8mg/ml的FS继续培养，第8-10天，即得到高增殖力、高细胞毒活性的T细胞。本发明方法中所用的PBS为常规的细胞培养用PBS，优选浓度为10mM、pH 7. 2的PBS0本发明方法中所用的淋巴细胞分离液并无特殊要求,优选选用Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液。本发明方法中所用的无血清培养基为常规的细胞培养用无血清培养基，优选选用RPM1-1640无血清培养液。同时，本领域技术人员知晓，虽然本发明所述的方法中对各项参数如稀释比例、离心速度、离心时间、冷水浸泡时间、次数、浓缩倍数、试剂体积、试剂浓度、细胞密度、器材规格等做了具体的限定，但这些参数均属于本领域的常规参数，本领域技术人员可以根据具体的实验对这些参数做出相应的调整而不改变整体的实验结果。这样的改变也落入本发明的范围。对于本发明方法中所列出的上述参数的数据，它们均是实现本发明方法的最佳参数。本发明首次发现，采用基因重组人细胞因子IL-2和抗⑶3单克隆抗体联合大青叶水煎剂可以用来诱导杀伤性T细胞，细胞因子、单克隆抗体与中药制剂的联合应用可以对淋巴细胞的扩增产生协同作用，从而使本本发明方法仅使用一种细胞因子、一种单克隆抗体和大青叶水煎剂即可达到以往研究的应用4种因子诱导获得的CIK细胞的细胞增殖数量及活性，而且本研究中细胞毒活性可维持2 3周，细胞最高杀伤率出现在培养的第9 12天。本发明技术方案获得的细胞毒活性的T细胞增殖数量多，活力好，CD8阳性T细胞 数可从20%-30%增加至80%-90%。本发明的方法采集血量少，减少了患者的痛苦，同时操作步骤简单，试剂成本低，细胞成熟时间短，8天即可达到IX IO9个以上可供患者静脉输注。本发明的培养方法可给患者连输6次，每次均达到I X IO9个以上。经过形态学观察及流式细胞术等检测均符合T细胞增殖特性。本方法适用于临床上肿瘤患者的生物免疫疗法，可广泛推广应用。


图1 :显示T细胞培养第一天的状态，倒置相差显微镜100 X，显示T细胞分散存在。图2 :显示T细胞培养第四天的状态，倒置相差显微镜100 X，显示T细胞增殖克隆。图3 :显示T细胞刚接种时的⑶8为28%。图4 :显示T细胞培养第7天时的⑶8为88%。
具体实施例方式下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。本发明下述实施例中使用的各种抗体均来源于商业途径的标准抗体。本发明的试验操作前已通过了本单位的伦理委员会审议并通过。本发明提供一种培养人的活化的细胞毒性T细胞的方法，可用从人的外周血中提取T细胞后刺激增殖。在本发明中，所述方法采用基因重组人细胞因子IL-2和抗CD3单克隆抗体联合大青叶水煎剂诱导T细胞增殖并增强杀伤功能。实施例实施例11、原料获取无菌的人全血50ml，送本院中心实验室提取并培养。2、试剂、耗材与仪器2.1主要试剂与耗材RPMI 1640无血清淋巴细胞培养基(购自天津灏洋生物技术公司，含稳定的谷氨酰胺、不含酚红，含多种血清替代物)，重组人细胞因子IL-2 (上海华新生物高技术有限公司)，抗⑶3单克隆抗体(购自美国P印rotech公司)，O. 01M、pH7. 2的磷酸盐缓冲液(PBS)，大青叶(FS，中药材大青叶产于河北，药材公司购买，十字花科)，细胞培养瓶，离心管和移液管均购自美国Corning公司。大青叶水煎剂制备50g大青叶干药材，冷水浸泡20-30分钟，3次水煎混合液浓缩至lg/ml，离心2000rpm 10分钟，取上清液以6°C0照射灭菌。2. 2主要仪器二氧化碳培养箱(美国THERMO公司371型)，倒置显微镜(日本OLYMPUS公司CKX41型)，大容量低速离心机(美国THERMO公司Multifuge 4KR)，流式细胞仪(美国BD FACSCalibur)，生物安全柜(北京东联哈尔仪器有限公司BSC_1360IIA2)。3、操作步骤 3.1淋巴细胞的分离提取3.1.1取离体无菌人外周血50ml。3.1. 2用磷酸盐缓冲液(PBS)按照I 1比例稀释。3.1. 3在50ml塑料离心管中预先加入标准Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液,按分离液稀释后血液=1 2比例加入稀释后的血液。心 8min
量。3.3.3.3.3.3.
4小心的将稀释后的血液加到Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液的上面。
5室温下1800rpm离心20min。
6取出离心管，小心吸出白色细胞层,重悬于PBS中，混匀，室温下1300rpm离
7吸弃上清，再重悬入40ml PBS中，混匀，室温下1300rpm离心8min。
8吸弃上清，再重悬入40ml PBS中，混匀，室温下1300rpm离心5min。
9吸弃上清，细胞沉淀用RPMI 1640无血清培养液重悬起，计数淋巴细胞数
3.1.
10按2X IO6个细胞/ml的密度将所分离的细胞重悬于RPMI1640无血清培养液中，接种于25cm2小培养瓶中，每小瓶细胞中加入终浓度500U/ml的IL-2。培养的T细胞第一天时的状态如图1所示。3. 2增殖培养3. 2.1第二天每瓶培养细胞中加入终浓度50ng/ml的抗⑶3单克隆抗体并继续培养。培养的T细胞第四天时的状态如图1所示。3. 2. 2第五天每瓶培养的细胞按1:3比例传代于75cm2中培养瓶中，并加入终浓度0. 8mg/ml 的 FS。3. 2. 3第六天至第八天，细胞数量可增殖到用于临床治疗的水平，回收细胞加入1%人血清白蛋白备用。上述获得的制备物可给患者静脉输注。本发明的培养方法可给患者连输6次，每次均达到IXlO9个细胞以上。4细胞及培养方法的验证4.1细胞形态学观察刚接种的细胞为散在瓶底的圆型有核细胞，培养液中混杂较多红细胞。培养3天后淋巴细胞增殖较多，呈细胞球状，红细胞逐渐死亡。4. 2细胞表面抗原标志的测定细胞提取接种当日，取Iml细胞悬液，计数细胞大于I X IO6个。用流式细胞仪进行T细胞亚群检测(检测指标⑶3、⑶4、⑶8)，结果见图3，结果表明刚接种时的CD8为28%。培养第7天时，抽取细胞悬液再进行T细胞亚群检测，结果见图4，结果表明T细胞培养第7天时的⑶8为88%。比较⑶8阳性细胞毒性T细胞的比率。4. 3培养前后细胞数量的比较细胞提取接种当日计数细胞数量为I X IO7,培养第7天时，抽取细胞悬液计数细胞可达到I X IO9个以上。参考文献I赵红，张淑杰，马立人.大 青叶水煎剂调节小鼠免疫细胞分泌IL-2、TNF-A的体外研究.[J]陕西中医，2003，23 (8) :757-759.2柳继锋，张雪梅，薛多清等.大青叶的化学成分研究.[J]中国中药杂志，2006，31
(23):1961-1964.3施玲燕，刘继斌，刘晓玲，徐鸣.CIK细胞实验研究及治疗肿瘤的临床疗效观察[J]肿瘤基础与临床，2009 (02) :141-143.4中药房中药店工作手册.广州广东科技出版社，1991 :103.
权利要求
1.一种培养人细胞毒性T细胞的方法，其包括如下步骤a)获得无菌人全血50_100ml；b)用PBS按照1:1比例稀释上述人全血,在塑料离心管中预先加入Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液，按分离液稀释后血液=1 :1 5的比例将稀释后的血液加到Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液的上面；c)室温下1800rpm离心10 30min后弃上清，重悬入40mlPBS中，混勻；再室温下1300rpm离心8min ;弃上清，再重悬入40ml PBS中，混匀；再室温下1300rpm离心5min ；d)弃上清，细胞沉淀用培养基RPM1-1640悬起，计数淋巴细胞数量；e)按2X IO6个细胞/ml的密度将所分离的细胞悬于RPM1-1640无血清培养液中，悬浮培养于25cm2小培养瓶中，每小瓶细胞中加入终浓度500U/ml的IL-2 ；f)第二天或第三天，每瓶培养细胞中加入终浓度50ng/ml的抗CD3单克隆抗体；g)第五天或第六天，每瓶培养的细胞按1:3比例传代于75cm2中培养瓶，并加入终浓度为 O. 4 1. 6mg/ml 的 FS ；h)第八天至第十天，细胞数量可增殖到用于临床治疗的水平，其中FS是指大青叶水煎剂。
2.根据权利要求1所述的培养人细胞毒性T细胞的方法，其特征在于无菌人全血的体积为50ml ο
3.根据权利要求1或2所述的培养人细胞毒性T细胞的方法，其特征在于，按分离液稀释后血液=1 2的比例将稀释后的血液加到Ficol1-Hypaque淋巴细胞分离液的上面，室温下1800rpm离心20min分离单个核细胞。
4.根据权利要求1到3任一项所述的培养人细胞毒性T细胞的方法，其特征在于培养当日培养基中加入终浓度500U/ml的IL-2，次日加入50ng/ml抗⑶3单克隆抗体，第5日加入 O. 4 1. 6mg/ml 的 FS。
5.根据权利要求4所述的培养人细胞毒性T细胞的方法，其特征在于第5日加入Img/ml 的 FS。
6.根据权利要求1到5任一项所述的培养人细胞毒性T细胞的方法，其特征在于所述FS的制备方法为取适量大青叶干药材，冷水浸泡20-30分钟，3次水煎混合液浓缩至约lg/ml，离心取上清液以6°C0照射灭菌。
7.根据权利要求1到6任一项所述的培养人细胞毒性T细胞的方法，其特征在于步骤a)的无菌人全血为50ml。
8.根据权利要求1到7任一项所述的培养人细胞毒性T细胞的方法，其特征在于所述PBS 为 O. 01M、pH7. 2 的 PBS。
9.据权利要求1到8任一项所述的培养人细胞毒性T细胞的方法，其特征在于所述IL-2为重组人IL-2，所述抗⑶3单克隆抗体为鼠抗人⑶3单克隆抗体。
10.根据权利要求1到9任一项所述的培养人细胞毒性T细胞的方法，其特征在于培养至第八天至第十天时回收细胞加入1%人血清白蛋白。
全文摘要
本发明涉及体外培养杀伤性T细胞的方法。具体而言，本发明经IL-2和抗CD3单克隆抗体联合大青叶水煎剂协同刺激取自50ml离体血液的淋巴细胞即可将其诱导为具有细胞毒活性的T细胞，本发明的诱导培养方法获得的具有细胞毒活性的T细胞增殖数量多，活力好，CD8阳性T细胞数可从20%-30%增加至80%-90%。同时，本发明采集血量少，操作步骤简单，试剂成本低，细胞成熟时间短，8天即可达到1×109个细胞以上并可供患者静脉连续输注6次，每次均达到1×109个细胞以上。本方法适用于临床上肿瘤患者的生物免疫疗法，可广泛推广应用。
文档编号C12N5/0783GK103013914SQ20121054098
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月13日 优先权日2012年12月13日
发明者毕薇薇 申请人:吉林省拓华生物科技有限公司