专利名称：一种黄杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于海洋微生物技术领域，具体涉及一种黄杆菌及其应用，即一株具有岩藻聚糖硫酸酯酶生产能力的细菌及其应用。
背景技术：
岩藻聚糖硫酸酯(Fucoidan)是广泛存在于褐藻中的一种高分子量的硫酸杂多糖，主要由L-岩藻糖及硫酸酯基团组成，另外还含有半乳糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、糖醛酸等。研究发现它具有多种生理活性，包括抗凝血、抗肿瘤、抗炎、抗血栓、提高免疫力、抗氧化、抗感染等，因此岩藻聚糖硫酸酯成为当今天然海洋活性物质的主攻重点。但由于岩藻聚糖硫酸酯的分子量巨大，从几万到几十万都有，严重影响了它的吸收效率，同时岩藻聚糖硫酸酯通常具有一定的粘性，也大大阻碍了它作为药物的应用。将大分子量的岩藻聚糖硫酸酯降解为小分子量的低聚糖，可以解决上述的应用难题，同时也是目前进行岩藻聚糖硫酸酯构效研究的重要手段。目前，降解岩藻聚糖硫酸酯的方法主要有化学降解法、物理降解法和酶降解法。化学降解法是非特异性降解，反应条件苛刻，水解较难控制，而且产物转化率低，功能性低。物理降解法虽然操作简单可控性好，但其降解效率普遍较低，很难得到符合一定分子量范围的产品。最好的方法就是酶解法，可以特异性地、选择性地切断岩藻聚糖链，反应过程容易控制，易于得到所需分子量范围的低聚糖产品，产物含量高，功能性强。目前，国内外关于岩藻聚糖硫酸酯酶的研究已有一些报道，但是还没有商品化的酶出现，主要由于这 些微生物的产酶能力尚未达到商业化的要求，因此，寻找酶的高产菌株是解决岩藻聚糖硫酸酯应用问题的重要途径。
发明内容
本发明的目的是提供一种黄杆菌及其应用，即一种岩藻聚糖硫酸酯酶的生产菌及其所生产的岩藻聚糖硫酸酯酶，可有效降解岩藻聚糖硫酸酯，为岩藻聚糖硫酸酯的应用和构效研究提供了有效方法。本发明的岩藻聚糖硫酸酯酶生产菌,为黄杆菌(Flavobacteriaceae sp. ) RC2-3,该菌株已于2012年12月03日保藏于北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号=CGMCC No. 6932。本发明筛选的菌可用于降解岩藻聚糖硫酸酯。本发明的黄杆菌科细菌RC2-3的活菌用于制备菌液；所制得的菌液可以用于提取胞内酶，从而用于降解岩藻聚糖硫酸酯。本发明所筛选的细菌用于制备岩藻聚糖硫酸酯酶。本发明筛选的具有岩藻聚糖硫酸酯酶生产能力的细菌，该菌株产酶活力高，达到180U/mL，具有良好的市场推广前景。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。一、黄杆菌的筛选对海带样品进行微生物富集、初筛、复筛，筛选产酶菌。对产酶菌进行液体培养，提取胞内产物，获得岩藻聚糖硫酸酯酶。具体技术方案如下(I)微生物富集培养无菌条件下取适量海带样品，加入无菌海水捣碎，取样品
2.5mL接入50mL富集培养基(Fucoidan 0. 2%，蛋白胨1%，硝酸铵1. 6mg/mL,磷酸氢二钠8mg/mL,用过膜海水配制，pH自然。)进行培养，在25°C, 150rpm的恒温培养摇床培养5天。培养结束后，取上述富集液2. 5mL接入富集培养基重复富集两次。(2)产酶微生物初筛将富集培养液适当稀释后，涂布于选择性培养基(Fucoidan0. 2%，蛋白胨0. 2%，硝酸铵5mg/mL，琼脂2%，用过膜海水配制，pH自然)平板上，在25°C培养5天。将平板中所有形态不同的单菌落，进行纯化培养，再接入斜面培养基(2216E琼脂，用蒸馏水配制，pH自然)，于25°C培养至长满斜面置于4°C冰箱保存。(3)产酶微生物复筛将上述斜面菌种分别接种至15mL液体培养基(Fucoidan0. 2%，蛋白胨1%，硝酸铵5mg/mL，用过膜海水配制，pH自然)，于25°C，180rpm摇床培养，用苯酚硫酸法测定总糖含量。结果获得一株菌RC2-3，培养72小时后总糖含量下降最大，达到54%。(4)产酶 菌RC2-3的形态、生理生化和分子生物学鉴定将产酶菌划线接种于2216E琼脂平板，光学显微镜观察细菌形态和生理生化鉴定菌落特征为菌落呈黄色，圆形隆起状，边缘整齐，不运动，细胞革兰氏染色阴性，接触酶阳性，氧化酶阳性，在海水中生长，l%NaCl中不生长，16S rDNA进行的分子生物学鉴定属于黄杆菌科(Flavobactereae)。菌株在2216E琼脂平板上25°C培养24h后，菌落呈黄色，圆形隆起状，边缘整齐，不运动，革兰氏染色阴性。接触酶阳性，氧化酶阳性，在海水中生长，l%NaCl中不生长。将该菌涂布于2216E琼脂平板上，25°C培养24-48小时即长出单菌落。该菌株已于2012年12月03日保藏于北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 6932。二、黄杆菌菌液的制备将保藏编号为CGMCC No. 6932的黄杆菌RC2-3接种于液体培养基(FucoidanO. 2%，蛋白胨1%，硝酸铵5mg/mL，用过膜海水配制，pH自然)中，25°C、180rpm条件下培养12h，获得种子培养液，将种子培养液按5%接种量接种于新鲜的液体培养基，于25°C、150rpm条件下培养72h，即制得黄杆菌菌液。三、黄杆菌胞内酶的生产
1、产酶黄杆菌胞内酶的制备将黄杆菌RC2-3的菌液于4°C、IOOOOg离心5-10分钟，弃上清，取沉淀，用少量20mM、pH8. 0的Tris-HCl溶解沉淀，在冰浴保护下，500w条件进行超声波破碎细胞15min，于4°C离心lOmin，弃沉淀，上清即为胞内酶，4°C冰箱保存。2、黄杆菌产酶及降解岩藻聚糖硫酸酯的能力检测实施例1 :取胞内酶与0. 2%的Fucoidan (pH8. 0、20mM的Tris-HCl溶解)等体积混合，于25。C、120rpm摇床振荡培养2小时，以Somogy1-Nelson法测定还原糖含量。I个酶活力单位定义为25。C、pH8. 0条件下，每小时产生的I纳摩尔还原糖需要的酶量。经测定,黄杆菌培养72h后产酶活力达到180U/mL。实施例2 将产酶菌接种于液体培养基(Fucoidan 0. 2%，硝酸铵0. 2%，用过膜海水配制，pH自然)，在25°C、150rpm条件下培养72h,每24h在无菌条件下取样ImL,在80°C灭酶15min,于IOOOOrpm离心IOmin取上清液。以高效凝胶排阻色谱(色谱条件如下Aglient 1100高效液相色谱仪；TSK-gel G3000 PffX I (30cmX7. 5mm)色谱柱；40°C柱温；0. 2M NaCl 为流动相；0. 5mL/min流速；示差检测器)检测多糖分子量的变化。结果表明培养0h、24h、48h、72h后，保留时间为13. 6min的Fucoidan含量分别为100%、75%、33%、28%。证明本发明筛选的菌株具有很好的降解岩藻聚糖硫酸酯的性能。
上述的实验结果表明，本发明筛选得到的产酶菌具有很高的产酶能力，能有效降解高分子量的岩藻聚糖硫酸酯，具有良好的市场推广前景。
权利要求
1.ー种黄杆菌，其保藏编号为CGMCC No. 6932。
2.权利要求1所述的黄杆菌在降解岩藻聚糖硫酸酷中的应用。
3.ー种菌液，所述的菌液是用权利要求1所述的黄杆菌扩大培养制备的。
4.权利要求3所述菌液在制备用于降解岩藻聚糖硫酸酷的胞内酶中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种黄杆菌及其应用，所述的黄杆菌的保藏编号为CGMCC No.6932。本发明筛选的菌可用于降解岩藻聚糖硫酸酯。本发明筛选的具有岩藻聚糖硫酸酯酶生产能力的细菌，该菌株产酶活力高，达到180U/mL，具有很好的市场应用前景。
文档编号C12R1/20GK103045512SQ20121055558
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月19日 优先权日2012年12月19日
发明者王莹, 李八方, 朴美子, 程凡升 申请人:青岛农业大学